Synthesis of bifunctional lipophilic constructs

Full Text

Сокращения: ГЛ – гликолипид; нГЛ – неогликолипид; СЛК – синтетический липофильный конструкт; Ad – адипиноил; Asc – аскорбат; A_tetra – тетрасахарид А; CMG – N-карбоксиметилглицин; DOPE – диолеоилфосфатидилэтаноламин; TBTU – 2-(1H-бензотриазол-1-ил)-1,1,3,3-тетраметиламиния тетрафторборат; THPTA – трис-гидроксипропилтриазолилметиламин; SuCy-3 – сульфоцианин-3.

ВВЕДЕНИЕ

Способность гликолипидов (ГЛ) самопроизвольно встраиваться в клеточную мембрану из межклеточной среды [1] открыла широкие возможности для модификации клеточной поверхности [2]. Использование для этого природных ГЛ затруднено тем, что их сложно выделять из природных источников (ввиду низкого содержания и значительного структурного разнообразия), а полный химический синтез таких соединений неоправданно долог. Значительно более перспективным оказался подход, основанный на применении синтетических аналогов ГЛ – неогликолипидов [3], которые содержат сам гликан (функциональную часть), липидный фрагмент, необходимый для встраивания в мембрану, а также спейсер, соединяющий их. Одно из основных преимуществ неогликолипидов – простота синтеза, т.к. входящие в их состав блоки могут быть соединены при помощи эффективных и надежных методов конъюгации. Дальнейшим развитием этого подхода стало введение в практику так называемых активных спейсеров, т.е. групп, которые не только соединяют гликан и липид, но и придают молекуле необходимые характеристики. Так, применение полярных и заряженных N-карбоксиметилглициновых (CMG) спейсеров позволяет регулировать баланс гидрофильности/гидрофобности молекулы и придавать растворимость в водных средах (свойство, крайне важное для работы с живыми клетками) и даже молекулам с гидрофобной функциональной частью [4, 5]. Это открыло возможность значительно расширить репертуар функциональных фрагментов и помимо гликанов вводить в состав липидных производных пептиды [6], флуоресцентные метки [7], лиганды для селективной ковалентной и нековалентной [4] конъюгации и т.д. Наиболее корректное общее наименование для таких соединений – синтетические липофильные конструкты (СЛК), в англоязычной литературе также используют аббревиатуру FSL (Function–Spacer–Lipid).

Возможность модифицировать гликаном клеточную мембрану без нарушения ее жизнедеятельности открывает практически неограниченные перспективы для исследования роли гликанов в функционировании клетки и ее взаимодействии с окружающей средой. Более того, модифицированные таким образом клетки и сами являются инструментом для изучения процессов взаимодействия клеточных гликанов с углевод-узнающими белками [8–10].

Ранее были синтезированы СЛК, несущие в качестве функциональной части различные флуоресцентные метки. Ими окрашивают как отдельные клетки, так и органы, и целые живые организмы, т.е. проводят окрашивание in vivo [7]. Такие конструкты позволяют детально исследовать механизмы и кинетику транспорта липидных молекул в клетку и из нее: их проникновение через гликокаликс, распределение в мембране, интернализацию в клетку и выход из нее – при помощи флуоресцентной микроскопии [1].

Применение конфокальной микроскопии для исследований с участием углеводсодержащих СЛК предполагает визуализацию флуоресцентно-меченными антигликановыми антителами. Антитела способны к мультивалентному взаимодействию с гликанами, а это, в свою очередь, может приводить к кластеризации нескольких (до десяти в случае декавалентных IgM) гликанов одной молекулой антитела и существенно искажать естественное распределение гликолипидов в мембране. Применение флуоресцентно-меченных антигликановых антител также не позволяет изучать взаимодействие гликанов, введенных в состав мембраны при помощи СЛК, с углевод-связывающими белками (например, галектинами), т.к. в такой ситуации будет наблюдаться конкуренция между флуоресцентно-меченными антителами и рецепторами за связывание с гликаном.

Для снятия таких ограничений необходимы конструкты, которые содержат как исследуемый гликан, так и флуоресцентную метку. Некоторые подходы к получению флуоресцентно-меченных гликолипидов известны. Так, возможно нерегиоселективное введение метки в уже полученный углеводсодержащий СЛК. Таким образом был синтезирован BODIPY-меченный конструкт на основе олигомеров гиалуроновой кислоты [1]. Недостаток подхода – статистическое распределение флуоресцентной метки: образуется смесь исходного конструкта и продуктов с различным количеством BODIPY-меток в молекуле, т.е. требование к однозначности структуры полученного СЛК не соблюдается. Также описаны методы введения флуоресцентной метки в природные ганглиозиды [11]. Введение осуществляется путем дезацетилирования NAc-группы нейраминовой кислоты щелочным гидролизом и последующего ацилирования полученного амина соответствующим производным BODIPY. При этом наблюдалось и частичное дезацилирование аминогруппы сфингозина, т.е. потеря остатка жирной кислоты. Возможен синтез олигосахарида, модифицированного флуоресцентной меткой, и дальнейшее введение его в состав неогликолипида. Так, в работе Yamaguchi et al. [12] описан полный химический синтез ганглиозида GD2, в котором к атому С6 остатка GalNAcβ присоединена флуоресцентная метка ATTO594. Крайне высокая трудоемкость получения модифицированного гликана и необходимость разрабатывать для каждого нового соединения свою схему синтеза не позволяет использовать такой подход как универсальный для получения бифункциональных СЛК. Но самый крупный недостаток введения флуоресцентной метки в состав гликановой части СЛК (если гликан – олигосахарид, а не полисахарид) – это безусловное искажение свойств гликана, как физико-химических, так и биологических.

Введение флуоресцентной метки в спейсерную группу углеводсодержащих липофильных конструктов позволит получить СЛК, лишенные описанных выше недостатков. Целью данного исследования был синтез таких бифункциональных СЛК, содержащих одинаковые углеводные и спейсер-липидные блоки, но отличающихся друг от друга флуоресцентной меткой, с использованием двух различных подходов.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Данная работа посвящена получению двух бифункциональных СЛК. Оба конструкта содержат следующие структурные фрагменты (рис. 1): тетрасахарид А (тип 2) (A_tetra (тип 2), гликан) и блок CMG–DOPE, где CMG – это N-карбоксиметилглициновый спейсер, а DOPE – это диолеоилфосфатидилэтаноламин (липид).

 

Рис. 1. Общие структурные фрагменты полученных СЛК: тетрасахарид А (тип 2) и блок CMG–DOPE.

 

Тетрасахарид А (тип 2) [13] был выбран нами в качестве углеводной составляющей получаемых СЛК по нескольким причинам. Во-первых, это “модельный” гликан для различных типов синтезируемых конструктов. Нами уже был синтезирован ряд СЛК с А_tetra (тип 2), отличающихся строением спейсера и липида [14]. Наличие такой серии соединений позволяет оценить влияние архитектуры конструктов на аффинность взаимодействия их углеводной части с соответствующими антителами. Во-вторых, одна из целей получения бифункциональных флуоресцентно-меченных СЛК заключается в исследовании взаимодействия галектинов с их лигандами в составе клеточной мембраны, а АВ0-антигены являются лигандами некоторых галектинов [10, 15].

На сегодняшний день CMG – наиболее часто используемый в синтезе СЛК спейсер. Он позволяет вводить в состав СЛК функциональные группы различной природы (даже гидрофобные), а его вытянутая за счет распределенных по длине отрицательно заряженных групп структура отдаляет функциональную часть от мембраны, увеличивая доступность функциональной группы для взаимодействия извне [3].

DOPE – также основной липид, применяемый в составе СЛК, т.к. он позволяет добиться надежного и равномерного встраивания конструктов в мембрану клетки [16].

Один из синтезированных нами конструктов в качестве флуоресцентной метки содержит флуоресцеин, а второй – сульфоцианин-3. В работе опробованы два разных синтетических подхода, отличающиеся друг от друга последовательностью введения гликана, флуоресцентной метки и спейсер-липидного блока. В первом случае был получен гликан-содержащий СЛК, в структуре которого присутствовал сайт для присоединения флуоресцентной группы. Во втором случае была получена сложная функциональная часть, включающая гликан и флуоресцентную метку. Ее конъюгацией со спейсер-липидным блоком был получен целевой СЛК.

Структуру целевых конструктов и промежуточных соединений подтверждали методами ¹Н- и ¹³С-ЯМР-спектроскопии и масс-спектрометрии высокого разрешения.

Получение бифункционального СЛК введением флуоресцентной метки на последней стадии. Для получения бифункциональных СЛК необходим центральный фрагмент, позволяющий проводить ортогональную конъюгацию трех структурных элементов: гликана, метки, а также спейсер-липида. Для реализации первого синтетического подхода в качестве такого звена мы выбрали производное α-азидолизина (2) (cхема 1) с Boc-защищенной ε-аминогруппой. На первой стадии вводили углеводную часть, для чего карбоксильную группу в производном (2) активировали при помощи TBTU [17] и конъюгировали с аминопропилгликозидом тетрасахарида А (тип 2) (1). Выход продукта (3) составил 75%. Далее Boc-защитную группу в производном (3) удаляли быстрой (5 мин) обработкой 95%-ной трифторуксусной кислотой при охлаждении (такие мягкие условия были необходимы, чтобы не затронуть лабильный в кислых условиях остаток α-L-фукозы в тетрасахаридном фрагменте). Амин (4), полученный таким образом с количественным выходом, далее превращали в активированный эфир (5) обработкой значительным (10 экв.) избытком дисукцинимидного эфира адипиновой кислоты (избыток необходим для минимизации образования продукта присоединения (4) по обеим карбоксильным группам адипиновой кислоты [18]). Конъюгацией активированного эфира (5) со спейсер-липидным блоком H₂N–CMG–DOPE (6) получали СЛК (7), который был выделен с выходом 87% методом гель-хроматографии. В структуре СЛК (7) присутствует азидная группа, позволяющая вводить дополнительные молекулярные фрагменты при помощи азид-алкиновой клик-реакции (CuAAC) [19]. Такие реакции протекают в нейтральных условиях, катализируются катионами Cu⁺, поэтому не затрагивают большинство компонентов, используемых для конструирования СЛК (гликаны, флуоресцентные метки, липиды). Более того, существуют биоортогональные варианты клик-реакций с участием напряженных циклических алкинов, не требующие катализа катионами меди(I), что позволяет конъюгировать молекулы in vivo [20]. Для введения флуоресцентной метки в СЛК (7) была использована клик-реакция. Конъюгацию СЛК (7) с производным флуоресцеина (8), содержащим алкиновый фрагмент, проводили в условиях, описанных Ростовцевым [21]: в качестве растворителя использовали смесь DMSO–вода, в качестве источника ионов меди – CuSO₄, восстановление Cu²⁺→Cu⁺ проводили под действием аскорбата натрия. Для стабилизации ионов Cu⁺ использовали лиганд THPTA [22, 23]. Целевой продукт (9) выделяли методом гель-хроматографии с выходом 77%.

 

Схема 1. Получение СЛК (9). Реагенты и условия: i – TBTU, DIPEA/DMF, 75%; ii – 95%-ная CF₃COOH, 4°С, 5 мин, выход количественный; iii – Ad(ONSu)₂ (10 экв.), DMSO, iv – NaHCO₃ (водн.) (50 мМ)–i-PrOH (2 : 1), 87% (на две стадии); v – CuSO₄, NaAsc, THPTA/DMSO–вода (1 : 1), 77%.

 

Конъюгация гликана и флуоресцентной метки с последующим введением спейсер-липида. Для второго пути получения бифункциональных СЛК в качестве центрального звена, к которому присоединяются все блоки, был выбран ε-азидолизин (10) (схема 2). В данном случае мы планировали сначала получить составную функциональную часть введением флуоресцентной метки и гликана по амино- и карбоксильной группам производного (10) соответственно, которую затем нужно было конъюгировать со спейсер-липидным блоком. В качестве флуоресцентной метки в данном случае был выбран сульфоцианин-3. Конъюгация активированного эфира сульфоцианина-3 (11) с ε-азидолизином (10) приводила к получению производного (12) с выходом 85%. Следующий шаг – введение углеводного фрагмента, для чего карбоксильную группу в соединении (12) активировали TBTU и вводили в реакцию с аминопропилгликозидом тетрасахарида А (тип 2) (1). Было обнаружено, что в ходе этой конъюгации происходил побочный процесс – рацемизация остатка лизина, поэтому полученный таким путем продукт (72%) представлял собой смесь L- и D-изомеров с соотношением 1 : 1 (13L/D). Об этом свидетельствовали данные ¹H-ЯМР-спектроскопии: в спектре (13L/D) протон в α-положении лизина, а также некоторые сигналы тетрасахаридного фрагмента (Н1 и ацетильная группа звена GlcNAc, CH₃-группа α-L-фукозы) проявлялись в виде пар идентичных сигналов с соотношением интегральных интенсивностей 1 : 1. Рацемизация аминокислот при активации их карбоксильных групп действием как TBTU, так и других реагентов, описана в литературе [24]. Предполагается, что она протекает через образование циклического азлактона (12a) (схема 2), в котором α-протон обладает повышенной кислотностью, что и способствует образованию смеси изомеров (12аL/D) и далее диастереомеров (13L/D).

 

Схема 2. Рацемизация при конъюгации с тетрасахаридом (1). Реагенты и условия: i – DIPEA/DMSO, 85%; ii – TBTU, DIPEA/DMF, затем соединение (1), 72%, L/D = 1 : 1.

 

Sturabotti et al. [24] также показали, что замена N-ацильной группы на N-карбамоильную в производном аминокислоты полностью подавляет рацемизацию при активировании карбоксила. Поэтому мы решили изменить план синтеза (схема 3). Сначала аминогруппу в соединении (10) защищали Boc-группой: обрабатывали соединение (10) Boc₂O в присутствии Et₃N, что приводило к получению карбамоильного N-Boc-производного (14) с выходом 81%. Далее соединение (14) конъюгировали с аминопропилгликозидом (1) в присутствии TBTU в условиях, аналогичных получению соединения (3). Обработкой продукта (15) 95%ной трифторуксусной кислотой при охлаждении (как было описано выше для получения производного (4)) был получен амин (16) с выходом 72% на две стадии. ¹Н-ЯМР-спектр амина (16) соответствовал только одному изомеру, т.е. рацемизации при конъюгации (1) и (14) не наблюдалось.

 

Схема 3. Получение СЛК (18). Реагенты и условия: i – Boc₂O, Et₃N/MeOH, 81%; ii – TBTU, DIPEA/DMF, затем соединение (1); iii – 95%-ная CF₃COOH, 4°C, 5 мин, 72% (на две стадии); iv – DIPEA/DMSO, 89%; v – CuSO₄, NaAsc, THPTA/DMSO–вода (1 : 1), 86%.

 

Ацилирование амина (16) активированным эфиром сульфоцианина-3 (11) приводило к получению производного (13), которое было выделено методом колоночной хроматографии на силикагеле с выходом 89% (схема 3). Для завершения синтеза целевого СЛК производное (13), включающее углеводную часть и флуоресцентную метку, необходимо было конъюгировать со спейсер-липидным блоком. Это было целесообразно осуществить также при помощи клик-реакции, т.к. в соединении (13) присутствует азидная группа. В качестве алкиновой компоненты использовали производное (17) – продукт ацилирования амина H₂N–CMG–DOPE (6) 4-пентиновой кислотой. Клик-конъюгацию соединений (13) и (17) осуществляли в условиях, аналогичных получению СЛК (9). Целевой СЛК (18) выделяли методом гель-хроматографии с выходом 86%.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Тетрасахарид А (тип 2) (1) [25] и амин H₂N–CMG–DOPE (6) [3] получали в лаборатории углеводов Института биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН по известным методикам. Производное (17) получали там же конъюгацией 4-пентиновой кислоты и амина (6) при помощи TBTU [17] и выделяли методом гель-фильтрации (описание синтеза будет опубликовано). Использовали коммерчески доступные производные лизина (2) и (10) (IRIS Biotech GmbH, Германия), флуоресцеина (8) и сульфоцианина-3 (11) (ООО “Люмипроб РУС”, Россия). Остальные реагенты также были коммерчески доступны (Acros Organics, США; SigmaAldrich, США). Растворители (Химмед, Реахим, Экос, Россия) перед использованием очищали стандартными методами.

Тонкослойную хроматографию проводили на алюминиевых пластинках Silica gel 60 (1.05554.0001, Merck, Германия), вещества обнаруживали обработкой пластинок 7%-ным водным раствором ортофосфорной кислоты и прогревом до 150°С (обугливание) или раствором нингидрина (для аминов, 3 г/л в смеси бутанол/уксусная кислота, 30 : 1). Колоночную хроматографию проводили на Silica gel 60 0.040–0.063 мм (Merck, Германия), гель-хроматографию – на Sephadex LH-20 (GE Healthcare, Швеция). Растворители упаривали на роторном испарителе в вакууме при 40–45°С.

¹Н-ЯМР-спектры регистрировали на приборах AVANCE (700 МГц) и Avance III (800 МГц) (Bruker, Германия) при 30°С. Значения химических сдвигов в ¹Н-ЯМР-спектрах (δ, м.д.) приведены с использованием для калибровки сигналов остаточных протонов растворителей HOD (δ = 4.750), СD₂HOD (δ = 3.306 в CD₃OD, δ = 3.341 в D₂O– CD₃OD 2 : 1), константы спин-спинового взаимодействия измерены в герцах.

¹³С-ЯМР-спектры регистрировали на приборах AVANCE (700 МГц) и Avance III (800 МГц) (Bruker, Германия) при 30°С. Значения химических сдвигов в ¹³С-ЯМР-спектрах (δ, м.д.) приведены с использованием для калибровки сигналов растворителей CD₃OD (δ = 49.00) и DMSO-d₆ (δ = 39.52).

Отнесение сигналов в ЯМР-спектрах осуществляли сопоставлением зарегистрированных спектров со спектрами охарактеризованных исходных и промежуточных соединений. Дополнительная информация о взаимном расположении сигналов в спектрах тетрасахарида А (тип 2) взята из работы Meloncelli et al. [26].

Масс-спектры высокого разрешения (МСВР) регистрировали на масс-спектрометре maXis (Bruker, Германия) с использованием ионизации электрораспылением (ИЭР), шприцевой ввод растворов в смеси ацетонитрил–вода 50 : 50 (об. %) со скоростью 3 мкл/мин, полярность наблюдаемых ионов выбирали в зависимости от функциональных групп исследуемых веществ. Использовали программное обеспечение ESI Compass 1.3 (Bruker, Германия), параметры настройки прибора устанавливали в соответствии со стандартными методами, предоставляемыми в пакете программного обеспечения производителем. Обработку спектров проводили с использованием пакета программ Data Analysis Version 4.0 SP1 (Bruker, Германия).

Получение СЛК (7). К раствору производного лизина (2) (4.1 мг, 0.015 ммоль) в 0.5 мл DMF добавляли TBTU (4.9 мг, 0.015 ммоль) и DIPEA (2.6 мкл, 0.015 ммоль), а через 10 мин – аминопропилгликозид (1) (10 мг, 0.013 ммоль). Через 1 ч реакционную смесь подвергали гель-хроматографии (CH₃CN–H₂O, 1 : 1). Фракции, содержащие продукт, объединяли и концентрировали. Полученный остаток дополнительно очищали колоночной хроматографией на силикагеле (элюция смесью CH₂Cl₂–EtOH–H₂O, 6 : 5 : 0.5). Фракции, содержащие чистый продукт, объединяли, концентрировали и подвергали лиофильной сушке из воды, получили 9.9 мг (75%) производного (3) в виде белой пены, R_f 0.42 (CH₂Cl₂–EtOH–H₂O, 6 : 5 : 0.5), ¹H-ЯМР (CD₃OD, 700 MГц): 5.34 (д, J_1,2 4.0, 1H, H1 Fucα), 5.16 (д, J_1,2 3.8, 1H, H1 GalNAcα), 4.53 (д, J_1,2 7.7, 1H, H1 Galβ), 4.39 (д, J_1,2 8.4, 1H, H1 GlcNAcβ), 4.35–4.29 (м, 2H, H2 GalNAcα, H5 Fucα), 4.17 (ддд, J 7.4, 4.3, 1.3, 1H, H5 GalNAcα), 4.11 (д, 1H, J_3,4 3.0, H4 Galβ), 4.00 (дд, J_2,3 9.9, J_1,2 7.7, 1H, H2 Galβ), 3.94–3.88 (м, 4H, 3H (A_tetra), OCHHCH₂CH₂N), 3.86–3.81 (м, 2Н, H3 GalNAcα, CH(N₃)), 3.80–3.63 (м, 10H (A_tetra)), 3.59 (дд, J_3,4 10.5, J_4,5 8.8, H4 GlcNAcβ), 3.57–3.52 (м, 2H, H5 Galβ, OCHHCH₂CH₂N), 3.41–3.34 (м, 1H, CHHNHBoc), 3.31–3.28 (м, 1Н, H5 GlcNAcβ), 3.25–3.18 (м, 1H, CHHNHBoc), 3.04 (т, J 6.9, 2H, OCH₂CH₂CH₂N), 2.00 (c, 3H, NC(O)CH₃), 1.99 (c, 3H, NC(O)CH₃), 1.85–1.72 (м, 4H, OCH₂CH₂CH₂N, CH₂), 1.53–1.48 (м, 2H, CH₂), 1.47–1.37 (м, 11H, С(СH₃)₃, CH₂), 1.22 (д, J 6.6, 3H, H6 Fucα); ¹³C-ЯМР (CD₃OD, 176 MГц, DEPT): 101.51 (С1 GlcNAcβ), 100.83 (C1 Galβ), 98.91 (C1 Fucα), 92.24 (C1 GalNAcα), 77.15, 76.59, 75.80, 75.54, 72.75, 72.21, 72.17, 71.36, 70.50, 69.15, 68.70, 68.53, 67.06 (OCH₂CH₂CH₂N), 66.31, 63.57, 62.90 (–CH(N₃)–), 61.99, 61.17, 60.38, 55.51, 49.91, 39.70 (OCH₂CH₂CH₂N), 36.52 (CH₂NHBoc), 31.13 (CH₂), 29.13 (CH₂), 29.05 (OCH₂CH₂CH₂N), 27.42 (C(CH₃)₃), 22.61 (CH₂), 21.50 (NC(O)CH₃), 21.19 (NC(O)CH₃), 15.19 (C6 Fucα); ИЭР МСВР: найдено m/z 1044.4831, рассчитано для C₄₂H₇₄N₇O₂₃⁺, [M + H]⁺ 1044.4816; найдено m/z 1061.5096, рассчитано для C₄₂H₇₇N₈O₂₃⁺, [M + NH₄]⁺ 1061.5081; найдено m/z 1066.4650, рассчитано для C₄₂H₇₃N₇O₂₃Na⁺, [M + Na]⁺ 1066.4634; найдено m/z 1082.4389, рассчитано для C₄₂H₇₃N₇O₂₃K⁺, [M + K]⁺ 1082.4373.

Колбу с производным (3) (9.0 мг, 0.0086 ммоль) охлаждали до 4°С и добавляли в нее 95% CF₃COOH (1 мл), также охлажденную до 4°С. Через 5 мин в смесь добавляли 2 мл Et₂O, что приводило к выпадению продукта в виде тонкой пленки на стенки колбы. Супернатант удаляли, пленку промывали 3 раза по 2 мл Et₂O, после чего высушивали в вакууме масляного насоса. Остаток подвергали ионообменной хроматографии (Dowex 50 (H⁺), элюция 5% водным NH₃). Лиофильной сушкой из воды получали 7.9 мг (97%) производного (4), белая пена, R_f 0.63 (MeOH–1 M Py ∙ HOAc (водн.), 5 : 1), ¹H-ЯМР (D₂O + эквивалентное к соединению (4) количество CF₃COOH, 700 MГц): 5.36 (д, J_1,2 4.1, 1H, H1 Fucα), 5.19 (д, J_1,2 3.8, 1H, H1 GalNAcα), 4.61 (д, J_1,2 7.7, 1H, H1 Galβ), 4.52 (д, J_1,2 8.4, 1H, H1 GlcNAcβ), 4.33 (кв, 1H, J_5,6 6, H5 Fucα), 4.27–4.20 (м, 3H, A_tetra), 4.11 (дд, J 7.5, 5.5, 1H, CH(N₃)), 4.03–3.98 (м, 3H, A_tetra), 3.96–3.89 (м, 3H, 2H (A_tetra), OCHHCH₂CH₂N), 3.86–3.71 (м, 10H, A_tetra), 3.70–3.62 (м, 3H, 2H (A_tetra), OCHHCH₂CH₂N), 3.46 (ддд, J 9.9, 6.0, 2.1, 1H, H-5 GlcNAcβ), 3.35–3.24 (м, 2H, CH₂NHBoc), 3.02 (т, J 7.7, 2H, OCH₂CH₂CH₂N), 2.06 (c, 3H, NC(O)CH₃), 2.05 (c, 3H, NC(O)CH₃), 1.91–1.78 (м, 4H, OCH₂CH₂CH₂N, CH₂), 1.77–1.67 (м, 2H, CH₂), 1.52–1.43 (м, 2H, CH₂), 1.26 (д, J 6.7, 3H, H6 Fucα); ¹³C-ЯМР (D₂O + эквивалентное к соединению (4) количество CF₃COOH, 176 MГц, DEPT): 101.21 (С1 GlcNAcβ), 100.15 (C1 Galβ), 98.68 (C1 Fucα), 91.41 (C1 GalNAcα), 76.36, 75.76, 75.41, 75.23, 72.43, 71.77, 71.15, 70.03, 68.55, 68.02 (OCH₂CH₂CH₂N), 67.86, 67.72, 66.90, 63.26 (–CH(N₃)–), 63.11, 61.37, 61.12, 60.25, 55.44, 49.56, 39.23 (OCH₂CH₂CH₂N), 36.55 (CH₂NHBoc), 30.78 (CH₂), 28.40 (OCH₂CH₂CH₂N), 26.38 (CH₂), 22.04 (NC(O)CH₃), 21.99 (NC(O)CH₃), 21.75 (CH₂), 15.20 (C6 Fucα); ИЭР МСВР: найдено m/z 944.4306, рассчитано для C₃₇H₆₆N₇O₂₁⁺, [M + H]⁺ 944.4295.

Раствор производного (4) (6.7 мг, 0.0071 ммоль) в 400 мкл DMSO четырьмя равными порциями через каждые 10 мин добавляли к раствору Ad(ONSu)₂ (24.1 мг, 0.071 ммоль). Через 30 мин после добавления последней порции смесь подвергали гель-хроматографии (CH₃CN–H₂O, 1 : 1, 0.3% АсОН). Фракции, содержащие активированный эфир (5) (R_f 0.50 (CHCl₃–EtOH–H₂O, 6 : 9 : 2)), объединяли, концентрировали и подвергали лиофильной сушке из 0.1% АсОН. Полученный остаток растворяли в 300 мкл DMF и добавляли тремя равными порциями через каждый 1 ч к раствору амина (6) (9.8 мг, 0.0053 ммоль) в смеси 0.5 мл 50 мМ NaHCO₃ (водн.) и 0.25 мл i-PrOH (pH 8.5) при перемешивании. Через 12 ч смесь нейтрализовали АсОН (2 мкл) до рН 7.0 и подвергали гель-хроматографии (i-PrOH–H₂O, 1 : 2, 0.25% AcOH, 0.5% пиридина). Фракции, содержащие чистый продукт, объединяли, концентрировали и дважды подвергали лиофильной сушке из воды. Полученный остаток растворяли в воде и титровали 50 мМ NaHCO₃ (водн.) до рН 6.5, после чего снова подвергали лиофильной сушке из воды. Таким образом было получено 14 мг (87% при расчете на амин (6)) СЛК (7) в виде белой пены, R_f 0.28 (i-PrOH–MeOH–CH₃CN–H₂O, 4 : 3 : 8 : 4), ¹H-ЯМР (D₂O–CD₃OD, 2 : 1, 700 MГц): 5.38 (д, J_1,2 4.2, 1H, H1 Fucα), 5.37–5.32 (м, 4H, 2 HC=CH), 5.31–5.28 (м, 1H, м, 1Н, C(2)H глицерина), 5.20 (д, J_1,2 3.9, 1H, H1 GalNAcα), 4.62 (д, J_1,2 7.6, 1H, H1 Galβ), 4.51 (д, J_1,2 8.5, 1H, H1 GlcNAcβ), 4.46 (д, J 12.1, 1H, C(1)H глицерина), 4.34 (кв, J 6.6, 1H, H5 Fucα), 4.31–3.89, 3.84–3.71, 3.69–3.65 (3м, 48H, 10H, 2H, 21H A_tetra, 12 C(O)CH₂N (CMG), 4 NCH₂C(O)O (CMG), NCH₂CH₂OP, C(1)H’ и C(3)H₂ глицерина, CH(N₃), OCHHCH₂CH₂N), 3.64–3.60 (м, 1H, OCHHCH₂CH₂N), 3.46–3.32 (м, 7H, H5 GlcNAcβ, NCH₂CH₂OP, NCH₂CH₂N), 3.28–3.18 (м, 4H, OCH₂CH₂CH₂N, CH₂NC(O)), 2.44–2.21 (м, 12H, 6 C(O)CH₂), 2.09–2.00 (м, 14H, 2 NC(O)CH₃, 2 CH₂C=CCH₂), 1.88–1.77 (м, 4H, OCH₂CH₂CH₂N, CH₂), 1.69–1.53 (м, 14H, 6 C(O)CH₂CH₂, CH₂), 1.45–1.25 (м, 45H, 21 CH₂, H6 Fucα), 0.91 (т, J 7.0, 6H, 2 CH₃; ¹³C-ЯМР (D₂O–CD₃OD, 2 : 1, 201 MГц): 176.66 (C=O), 176.05 (C=O), 175.93 (C=O), 175.05–174.90 (C=O), 174.51 (C=O), 174.02 (C=O), 172.06 (C=O), 171.79 (C=O), 171.59–171.06 (C=O), 170.80–170.51 (C=O), 129.59 (НC=C), 129.56(НC=C), 129.52 (НC=C), 129.50(НC=C), 101.19 (С1 GlcNAcβ), 100.20 (C1 Galβ), 98.65 (C1 Fucα), 91.46 (C1 GalNAcα), 76.46, 75.78, 75.39, 75.22, 72.39, 72.30, 71.79, 71.11, 70.65, 70.61, 70.02, 68.64, 67.90, 67.80, 67.64, 66.80, 64.01, 63.98, 63.44, 63.42, 63.41, 63.12, 63.08, 62.95, 62.93, 61.40, 61.11, 60.16, 55.41, 54.32, 53.03–51.95, 49.56, 42.46, 42.22, 40.72, 39.92, 39.88, 38.85, 38.41, 38.41, 36.31, 35.45, 35.35, 35.35, 35.14, 35.13, 35.06, 33.94, 33.83, 31.81, 30.89, 29.70–28.80, 28.55, 28.03, 27.01, 25.01, 24.91, 24.69, 24.64, 24.59, 24.57, 22.53, 22.22, 22.11, 21.88, 15.20 (C6 Fucα), 13.73 (2 СH₃); ИЭР МСВР: найдено m/z 1441.1901^2–, рассчитано для C₁₂₄H₂₀₅N₂₂O₅₃P, [M – 2H]^2– 1441.1910; найдено m/z 960.4576, рассчитано для C₁₂₄H₂₀₄N₂₂O₅₃P^3–, [M – 3H]^3– 960.4576; найдено m/z 720.0914, рассчитано для C₁₂₄H₂₀₃N₂₂O₅₃P^4–, [M – 4H]^4- 720.0934; найдено m/z 575.8717, рассчитано для C₁₂₄H₂₀₂N₂₂O₅₃P^5–, [M – 5H]^5– 575.8744.

Получение СЛК (9). Раствор СЛК (7) (7.0 мг, 0.0023 ммоль) и алкина (8) (1.9 мг, 0.0046 ммоль) растворяли в смеси DMSO–Н₂О, 1 : 1 (0.5 мл) и замораживали жидким азотом. Колбу заполняли аргоном и давали смеси оттаять, после чего в противотоке аргоном добавляли растворы CuSO₄ ∙ 5H₂O (0.29 мг, 0.0012 ммоль в 50 мкл H₂O), NaAsc (0.23 мг, 0.0012 ммоль в 50 мкл H₂O), THPTA (0.50 мг, 0.0012 ммоль в 50 мкл H₂O). Через 1 ч реакционную смесь подвергали гель-хроматографии (CH₃CN–H₂O, 1 : 1). Фракции, содержащие чистый продукт, объединяли, концентрировали и подвергали лиофильной сушке из воды, получили 6.0 мг (77%) СЛК (9) в виде желтой пены, R_f 0.60 (CHCl₃–MeOH–H₂O, 2 : 6 : 0.5), ¹H-ЯМР (D₂O–CD₃OD, 2 : 1, 700 MГц): 8.45 (c, 1H, триазол), 8.18–8.13 (м, 2Н, флуоресцеин), 7.35 (д, J 8.3, 1Н, флуоресцеин), 7.04–6.95 (м, 2Н, флуоресцеин), 6.84 (c, 2Н, флуоресцеин), 6.73 (д, J 9.0, 2Н, флуоресцеин), 5.38 (д, J_1,2 4.1, 1H, H1 Fucα), 5.35–5.24 (м, 6H, 2 HC=CH, C(2)H глицерина, C(O)CHCH₂ (лизин)), 5.19 (д, J_1,2 3.9, 1H, H1 GalNAcα), 4.61 (д, J_1,2 7.6, 1H, H1 Galβ), 4.49 (д, J_1,2 8.4, 1H, H1 GlcNAcβ), 4.45 (дд, J 12.2, 2.5, 1H, C(1)H глицерина), 4.34 (кв, J 6.8, 1H, H5 Fucα), 4.29–3.88, 3.84–3.70, 3.69–3.64 (3м, 48H, 10H, 2H, 20H A_tetra, 12 C(O)CH₂N (CMG), 4 NCH₂C(O)O (CMG), NCH₂CH₂OP, C(1)H’ и C(3)H₂ глицерина, OCHHCH₂CH₂N, C(O)NHCH₂N (флуоресцеин)), 3.60–3.55 (м, 1H, OCHHCH₂CH₂N), 3.46–3.28 (м, 8H, H5 GlcNAcβ, NCH₂CH₂OP, NCH₂CH₂N, CHHNC(O) (лизин)), 3.27–3.21 (м, 1Н, CHHNC(O)), 3.19–3.12 (м, 2H, OCH₂CH₂CH₂N), 2.41–2.17 (м, 12H, 6 C(O)CH₂), 2.06 (с, 3H, NC(O)CH₃), 2.02 (с, 3H, NC(O)CH₃), 2.00–1.92 (м, 8H, 2 CH₂C=CCH₂), 1.81–1.75 (м, 2H, OCH₂CH₂CH₂N), 1.67–1.53 (м, 16H, 6 C(O)CH₂CH₂, 2 CH₂), 1.39–1.19 (м, 45H, 21 CH₂, H6 Fucα), 0.86 (т, J 7.0, 6H, 2 CH₃); ¹³C-ЯМР (D₂O–CD₃OD, 2 : 1, 201 MГц): 183.09 (C=O), 174.56–172.80 (C=O), 171.89 (C=O), 170.05–169.85 (C=O), 169.38 (C=O), 168.50 (C=O), 160.94, 144.80, 136.08, 130.11 (C=C), 130.02 (C=C), 129.75(C=C), 128.34 (C=C), 122.60 (CH триазол), 115.22, 109.96, 102.83, 101.27 (С1 GlcNAcβ), 100.90 (C1 Galβ), 99.06 (C1 Fucα), 92.17 (C1 GalNAcα), 78.02, 76.18, 75.65, 75.43, 72.41, 71.99, 71.87, 71.42, 70.85, 70.10, 68.84, 68.18, 67.93, 66.94, 66.33, 63.39–62.99, 62.78, 61.62, 60.61, 60.20, 55.33, 53.97, 53.49–52.11, 49.67, 44.70, 42.29, 42.21, 40.61, 38.48, 38.36, 36.43, 35.53, 35.46, 35.28, 35.18, 34.04, 33.88, 31.60, 30.90, 29.46–28.69, 28.51, 26.92, 26.88, 25.31, 25.23, 25.11, 24.99, 24.81, 24.76, 22.93, 22.44, 16.49 (C6 Fucα), 14.25 (2 СH₃); ИЭР МСВР: найдено m/z 1098.1543, рассчитано для C₁₄₈H₂₁₉N₂₃O₅₉P^3–, [M – 3H]^3– 1098.1557; найдено m/z 823.3639, рассчитано для C₁₄₈H₂₁₈N₂₃O₅₉P^4–, [M – 4H]^4– 823.3655; найдено m/z 658.4897, рассчитано для C₁₄₈H₂₁₇N₂₃O₅₉P^5–, [M – 5H]^5– 658.4915; найдено m/z 548.5735, рассчитано для C₁₄₈H₂₁₆N₂₃O₅₉P^6–, [M – 6H]^6– 548.5757.

Смесь эпимеров (13L/D). К раствору производного (10) (1.8 мг, 0.010 ммоль) в 100 мкл DMSO добавляли раствор активированного эфира (11) (6.8 мг, 0.0092 ммоль) в 200 мкл DMSO и 0.5 мкл (0.0028 ммоль) Et₃N. Через 2 ч реакционную смесь подвергали гель-хроматографии (CH₃CN–H₂O, 1 : 1). Фракции, содержащие продукт, объединяли, концентрировали и подвергали колоночной хроматографии на силикагеле (CH₂Cl₂–EtOH–H₂O, 6 : 5 : 0.5); фракции содержащие чистый продукт объединяли, концентрировали и подвергали лиофильной сушке из воды, получили 6.2 мг (85%) производного (12) в виде розовой пены, R_f 0.45 (CH₂Cl₂–EtOH–H₂O, 6 : 5 : 0.5), ¹H-ЯМР (D₂O, 700 MГц): 8.53 (т, J 13.4, 1H, С=СH), 7.91 (т, J 1.6, 2H, ArH), 7.86 (т, J 2.0, 1H, С=СH), 7.85 (т, J 1.9, 1H, С=СH), 7.36 (дд, J 8.4, 6.6, 2H, ArH), 6.38 (дд, J 13.5, 10.2, 2H, ArH), 4.16 (дд, J 8.9, 4.7, 1H, C(O)CHN), 4.13–4.06 (м, 2H, CH₂), 3.62 (c, 3H, N(CH₃)), 3.25 (тд, J 6.7, 3.0, 2H, CH₂), 2.31 (тд, J 7.1, 2.7, 2H, CH₂), 1.87–1.82 (м, 2H, CH₂), 1.75 (с, 12H, 2 C(CH₃)₂), 1.74–1.60 (м, 4H, 2 CH₂), 1.57–1.49 (м, 2H, CH₂), 1.47–1.24 (м, 4H, 2 CH₂); ¹³C-ЯМР (D₂O, 176 MГц, DEPT): 151.95 (C=CH), 126.66 (2 C=CH), 119.83 (C-Ar), 119.70 (C-Ar), 111.45 (C-Ar), 111.29 (C-Ar), 103.57 (C-Ar), 103.48 (C-Ar), 54.41 (C(O)CHN), 50.91, 44.09, 35.44, 30.91, 27.61, 26.51, 25.46, 25.03, 22.56; ИЭР МСВР: найдено m/z 769.2695, рассчитано для C₃₆H₄₅N₆O₉S₂^–, [M – H]^– 769.2692; найдено m/z 384.1311, рассчитано для C₃₆H₄₄N₆O₉S₂^2–, [M – 2H]^2– 384.1305.

К раствору производного (12) (6.0 мг, 0.0076 ммоль) в 0.5 мл DMF добавляли раствор TBTU (2.4 мг, 0.0076 ммоль) в 100 мкл DMF и DIPEA (1.3 мкл, 0.0076 ммоль), а через 10 мин – аминопропилгликозид (1) (5.4 мг, 0.0068 ммоль). Через 4 ч реакционную смесь подвергали гель-хроматографии (CH₃CN–H₂O, 1 : 1). Фракции, содержащие продукт, объединяли, концентрировали и полученный остаток дополнительно очищали колоночной хроматографией на силикагеле (CHCl₃–MeOH, 2 : 3). Фракции, содержащие чистый продукт, объединяли, концентрировали и подвергали лиофильной сушке из воды, в результате получили 7.4 мг (72%) смеси (13L/D) (по данным ¹H-ЯМР соотношение изомеров 1 : 1) в виде розовой пены, R_f 0.32 (CH₂Cl₂–EtOH–H₂O, 6 : 5 : 1), ¹H-ЯМР (CD₃OD, 700 MГц): характеристические сигналы 8.60–8.53 (м, 1H, С=СH), 7.95 (дд, J 3.4, 1.7, 2H, ArH), 7.93 (д, J 1.8, 1H, С=СH), 7.92 (д, J 1.8, 1H, С=СH), 7.43–7.39 (м, 2H, ArH), 6.53–6.46 (м, 2H, ArH), 5.34 (д, J_1,2 4.1, 1H, H1 Fucα), 5.15 (д, J_1,2 3.7, 1H, H1 GalNAcα), 4.53 (д, J_1,2 7.6, 1H, H1 Galβ), 4.40 (д, J_1,2 8.4, 0.5 H, H1 GlcNAcβ (L)), 4.39 (д, J_1,2 8.4, 0.5 H, H1 GlcNAcβ (D)), 4.27–4.20 (м, 1H, C(O)CHN (L + D)), 2.00 (с, 3H, NC(O)CH₃), 1.97 (c, 1.5 H, NC(O)CH₃ (L)), 1.96 (c, 1.5 H, NC(O)CH₃ (D)), 1.22 (м, 3H, H6 Fucα (L + D)).

Получение СЛК (18). Производное (10) (10 мг, 0.029 ммоль) растворяли в MeOH (400 мкл), добавляли Boc₂O (28 мкл, 0.058 ммоль) и Et₃N (8 мкл, 0.03 ммоль). Через 24 ч смесь концентрировали и подвергали колоночной хроматографии на силикагеле, получили 12.2 мг (81%) производного (14), бесцветное стекло, R_f 0.24 (CHCl₃–MeOH, 9 : 1), ¹H-ЯМР (DMSO-d₆, 800 MГц): 3.40 (кв, J 7.4, 1H, C(O)CHN), 3.31 (т, J 6.8, 2H, CH₂N₃), 1.71–1.63 (м, 1Н, СHH), 1.59–1.46 (м, 3Н, СHH, CH₂), 1.38 (c, 9H, C(CH₃)₃), 1.37–1.32 (м, 2Н, CH₂); ¹³C-ЯМР (DMSO-d₆, 201 MГц): 174.88 (C(O)OH), 155.87 (C(O)NH), 78.25 (C(CH₃)₃), 54.17 (C(O)CHN), 51.08 (CH₂N₃), 31.31 (CH₂), 28.69 (C(CH₃)₃), 28.45 (CH₂), 23.24 (CH₂); ИЭР МСВР: найдено m/z 273.1557, рассчитано для C₁₁H₂₁N₄O₄, [M + H]⁺ 273.1556; найдено m/z 290.1823, рассчитано для C₁₁H₂₄N₅O₄⁺, [M + NH₄]⁺ 290.1821; найдено m/z 295.1375, рассчитано для C₁₁H₂₀N₄O₄Na⁺, [M + Na]⁺ 295.1382; найдено m/z 311.1116, рассчитано для C₁₁H₂₀N₄O₄K⁺, [M + K]⁺ 311.1114.

К раствору производного (14) (3.0 мг, 0.011 ммоль) в 0.75 мл DMF добавляли раствор TBTU (3.5 мг, 0.011 ммоль) в 100 мкл DMF и DIPEA (1.9 мкл, 0.011 ммоль), а через 10 мин – аминопропилгликозид (1) (7.8 мг, 0.0099 ммоль). Через 30 мин реакционную смесь подвергали гель-хроматографии (CH₃CN–H₂O, 1 : 1). Фракции, содержащие продукт, объединяли и концентрировали, полученный остаток дополнительно очищали колоночной хроматографией на силикагеле (CH₂Cl₂–EtOH–H₂O, 6 : 5 : 1). Фракции, содержащие чистый продукт, объединяли и концентрировали. Полученный остаток, содержащий продукт (15) (R_f 0.44, CH₂Cl₂–EtOH–H₂O, 6 : 5 : 1), охлаждали до 4°С и добавляли к нему 95%-ную CF₃COOH (1 мл), также охлажденную до 4°С. Через 5 мин в смесь добавляли 2 мл Et₂O, что приводило к выпадению продукта в виде тонкой пленки на стенки колбы. Супернатант удаляли, пленку промывали 3 раза по 2 мл Et₂O, после чего высушивали в вакууме масляного насоса. Остаток подвергали ионообменной хроматографии (Dowex 50 (H⁺), элюция 5%-ным водным NH₃). Лиофильной сушкой из воды получали 6.7 мг (72%) производного (16), белая пена, R_f 0.20 (CHCl₃–MeOH–H₂O, 2 : 6 : 1), ¹H-ЯМР (D₂O + эквивалентное к соединению (16) количество CF₃COOH, 800 MГц): 5.36 (д, J_1,2 4.2, 1H, H1 Fucα), 5.19 (д, J_1,2 3.9, 1H, H1 GalNAcα), 4.60 (д, J_1,2 7.7, 1H, H1 Galβ), 4.50 (д, J_1,2 8.5, 1H, H1 GlcNAcβ), 4.32 (кв, J_5,6 6.6, 1H, H5 Fucα), 4.27– 4.20 (м, 3H, H2 GalNAcα, H5 Galβ, H4 Galβ), 4.03–3.88 (м, 7H, 6H A_tetra, OCHHCH₂CH₂N), 3.86–3.70 (м, 10H, 9H A_tetra, C(O)CHNH₂), 3.70–3.66 (м, 2H, A_tetra), 3.65–3.61 (м, 1H, OCHHCH₂CH₂N), 3.45 (ддд, J 10.0, 6.0, 2.1, 1H, H5 GlcNAcβ), 3.42–3.34 (м, 3H, OCH₂CH₂CHHN, CH₂N₃), 3.26–3.21 (м, 1H, OCH₂CH₂CHHN), 2.06 (с, 3H, NC(O)CH₃), 2.05 (с, 3H, NC(O)CH₃), 1.93–1.88 (м, 2H, OCH₂CH₂CH₂N), 1.81 (п, J 6.5, 2H, CH₂), 1.66 (п, J 6.9, 2H, CH₂), 1.49–1.42 (м, 2H, CH₂), 1.26 (д, J_5,6 6.6, 3H, H6 Fucα); ¹³C-ЯМР (D₂O + эквивалентное к соединению (16) количество CF₃COOH, 201 MГц): 174.88 (NC(O)C), 174.68 (NC(O)C), 169.50 (NC(O)C), 101.26 (С1 GlcNAcβ), 100.15 (C1 Galβ), 98.68 (C1 Fucα), 91.4 (C1 GalNAcα), 76.37, 75.75, 75.39, 75.22, 72.44, 72.31, 71.77, 71.15, 70.03, 68.55, 68.02, 67.85, 67.72, 66.89, 63.10, 61.36, 61.20, 60.23, 55.43, 53.25, 50.69, 49.56, 36.73 (OCH₂CH₂CH₂N), 30.38 (OCH₂CH₂CH₂N), 28.30 (CH₂), 27.60 (C(CH₃)₃), 22.24 (CH₂), 21.99 (NC(O)CH₃), 21.55 (NC(O)CH₃), 15.20 (C6 Fucα); ИЭР МСВР: найдено m/z 944.4306, рассчитано для C₃₇H₆₆N₇O₂₁⁺, [M + H]⁺ 944.4295.

К раствору производного (16) (5.0 мг, 0.0053 ммоль) в DMSO (0.5 мл) добавляли раствор активированного эфира (11) (4.3 мг, 0.0055 ммоль) в DMSO (0.5 мл) и DIPEA (0.28 мкл, 0.0017 ммоль). Через 1 ч реакционную смесь подвергали гель-хроматографии (CH₃CN–H₂O, 1 : 1). Фракции, содержащие чистый продукт, объединяли и концентрировали; фракции, содержащие чистый продукт с примесями, объединяли, концентрировали и подвергали дополнительной очистке колоночной хроматографией на силикагеле (CH₂Cl₂–EtOH–H₂O, 6 : 5 : 1). Все фракции с чистым продуктом объединяли, концентрировали и подвергали лиофильной сушке из воды, в результате получили 7.4 мг (89%) продукта (13) в виде розовой пены, R_f 0.32 (CH₂Cl₂–EtOH–H₂O, 6 : 5 : 1), ¹H-ЯМР (CD₃OD, 800 MГц): 8.57 (т, J 13.4, 1H, С=СH), 7.95 (дд, J 2.9, 1.7, 2H, ArH), 7.92 (д, J 1.8, 1H, С=СH), 7.91 (д, J 2.0, 1H, С=СH), 7.41 (дд, J 9.8, 8.3, 2H, ArH), 6.50 (дд, J 15.0, 13.4, 2H, ArH), 5.34 (д, J_1,2 4.0, 1H, H1 Fucα), 5.15 (д, J_1,2 3.9, 1H, H1 GalNAcα), 4.53 (д, J_1,2 7.7, 1H, H1 Galβ), 4.39 (д, J_1,2 8.6, 1H, H1 GlcNAcβ), 4.34–4.29 (м, 2H, A_tetra), 4.25 (дд, J 8.9, 5.5, 1H, C(O)CHN), 4.23–4.14 (м, 2H, 1H A_tetra, CH₂), 4.10 (д, 1H, J_3,4 3.1, H4 Galβ), 4.00 (дд, J_2,3 9.9, J_1,2 7.7, 1H, H2 Galβ), 3.93–3.88 (м, 4H, 3H A_tetra, OCHHCH₂CH₂N), 3.82 (дд, J_2,3 11.0, J_3,4 3.2, 1H, H3 GalNAcα), 3.80–3.63 (м, 15H, 12 A_tetra, N(CH₃)), 3.61–3.49 (м, 4H, 1H A_tetra, CH₂, OCHHCH₂CH₂N), 3.34–3.27 (м, 4H, H5 GlcNAcβ, OCH₂CH₂CH₂N, CHH), 3.22–3.17 (м, 1H, CHH), 2.35–2.25 (м, 2H, CH₂), 2.00 (с, 3H, NC(O)CH₃), 1.97 (с, 3H, NC(O)CH₃), 1.90–1.84 (м, 2H, OCH₂CH₂CH₂N), 1.79 (c, 12H, 2 C(CH₃)₂) 1.78–1.70 (м, 4H, 2 CH₂), 1.67– 1.55 (м, 4H, 2 CH₂), 1.35–1.26 (м, 2H, CH₂), 1.21 (д, J_5,6 6.7, 3H, H6 Fucα); ¹³C-ЯМР (CD₃OD, 201 MГц): 176.21, 175.40, 174.49, 173.08, 173.01, 172.20, 143.97, 143.32, 142.76, 142.70, 140.79, 140.74, 126.94, 126.83, 120.11, 120.00, 110.84, 110.62, 103.50, 103.24, 101.55 (С1 GlcNAcβ), 100.82 (C1 Galβ), 98.90 (C1 Fucα), 92.23 (C1 GalNAcα), 77.15, 76.57, 75.75, 75.56, 72.88, 72.47, 72.19, 72.14, 71.34, 70.47, 69.17, 68.68, 68.55, 67.31, 66.32, 66.19, 63.56, 63.04, 61.98, 61.18, 60.35, 55.41, 53.47, 50.89, 49.89, 49.35, 49,33, 43.99, 36.47, 35.04, 31.66, 31.27, 29.49–28.78, 28.09, 26.86, 26.84, 26.73, 26.69, 25.85, 24.97, 22.91, 22.31, 21.68, 21.34, 19.30, 15.21 (C6 Fucα); ИЭР МСВР: найдено m/z 771.8093, рассчитано для C₆₇H₁₀₁N₉O₂₈S₂²⁺, [M + 2H]²⁺ 771.8093.

Алкин (17) (5.6 мг, 0.0023 ммоль) и азид (13) (4.0 мг, 0.0026 ммоль) растворяли в смеси DMSO– Н₂О, 1 : 1 (0.5 мл) и замораживали жидким азотом. Колбу заполняли аргоном и давали смеси оттаять, после чего в противотоке аргоном добавляли растворы CuSO₄ ∙ 5H₂O (0.29 мг, 0.0012 ммоль в 50 мкл H₂O), NaAsc (0.23 мг, 0.0012 ммоль в 50 мкл H₂O), THPTA (0.50 мг, 0.0012 ммоль в 50 мкл H₂O). Через 1 ч реакционную смесь подвергали гель-хроматографии (CH₃CN–H₂O, 1 : 1); фракции, содержащие чистый продукт объединяли, концентрировали и подвергали лиофильной сушке из воды, получили 6.9 мг (86%) СЛК (18) в виде розовой пены, R_f 0.22 (i-PrOH–MeOH–CH₃CN–H₂O, 4 : 3 : 8 : 4), ¹H-ЯМР (D₂O–CD₃OD, 2 : 1, 800 MГц): 8.59 (т, J 13.3, 1H, C=CH SuCy-3), 7.94 (c, 2H, ArH), 7.91 (т, J 8.8, 2H, 2 C=CH SuCy-3), 7.82 (c, 1H, триазольный цикл), 7.45 (т, J 9.1 2H, ArH), 6.47 (дд, J 13.5, 8.0, 2H, ArH), 5.37 (д, J_1,2 4.8, 1H, H1 Fucα), 5.37–5.33 (м, 4H, 2 HC=CH), 5.30–5.26 (м, 1H, C(2)H глицерина), 5.19 (д, J_1,2 3.9, 1H, H1 GalNAcα), 4.61 (д, J_1,2 7.6, 1H, H1 Galβ), 4.50 (д, J_1,2 8.4, 1H, H1 GlcNAcβ), 4.45 (дд, J 12.3, 2.1, 1H, C(1)H глицерина), 4.39 (м, 1H, H5 Galβ), 4.34 (кв, J 6.5, 1H, H5 Fucα), 4.30 –4.26 (м, 2H, H2 GalNAcα, H-4 Galβ) 4.34–3.86, 3.83–3.64 (2м, 49H, 12H, 17H A_tetra, 12 C(O)CH₂N (CMG), 4 NCH₂C(O)O (CMG), NCH₂CH₂OP, C(1)H’ и C(3)H₂ глицерина, OCHHCH₂CH₂N, CH₂N SuCy3, C(O)CHN лизин, NCH₃), 3.58–3.54 (м, 1H, OCHHCH₂CH₂N), 3.46–3.22 (м, 8H, H5 GlcNAcβ, NCH₂CH₂OP, NCH₂CH₂N, OCH₂CH₂CHHN), 3.17–3.12 (м, 1Н, OCH₂CH₂CHHN), 3.02 (т, J 7.4, 1H, CH₂), 2.70 (т, J 7.4, 1H, CH₂), 2.40 – 2.26 (м, 12H, 6 C(O)CH₂), 2.06 (с, 3H, NC(O)CH₃), 2.03 (с, 3H, NC(O)CH₃), 2.00–1.92 (м, 8H, 2 CH₂C=CCH₂), 1.92–1.84 (м, 4H, OCH₂CH₂CH₂N, CH₂), 1.81 (c, 12H, 2 C(CH₃)₂), 1.80–1.55 (м, 20H, 6 C(O)CH₂CH₂, 4 CH₂), 1.39–1.19 (м, 45H, 21 CH₂, H6 Fucα), 0.87 (т, J 7.1, 6H, 2 CH₃); ¹³C-ЯМР (D₂O–CD₃OD, 2 : 1, 201 MГц, DEPT): 153.33 (C=CH SuCy-3), 129.62 (C=C олеоил), 127.05 (С=СH SuCy-3), 123.12 (CH триазол), 119.73 (С(Ar)H SuCy-3), 111.44 (С(Ar)H SuCy-3), 103.73 (С(Ar)H SuCy-3), 101.16 (С1 GlcNAcβ), 100.19 (C1 Galβ), 98.97 (C1 Fucα), 91.65 (C1 GalNAcα), 76.41, 75.78, 75.42, 75.22, 72.51, 72.11, 71.76, 71.32, 70.64, 70.61, 70.02, 68.45, 67.99, 67.81, 67.78, 66.77, 64.16, 63.98, 63.44, 63.19, 61.98, 61.94, 61.89, 61.55, 62.43, 61.40, 61.11, 60.62, 55.41, 54.32, 52.91–51.85, 51.60, 50.84, 49.56, 44.13–43.90, 40.50–40.01, 39.98, 39.83, 38.84, 38.75, 38.52, 36.10, 35.26, 35.19, 34.81, 34.30–33.63, 31.90, 30.76, 30.52, 30.60–29.48, 29.28, 28.64, 27.12–26.55, 25.53, 25.45–24.59, 22.74, 22.42, 22.10, 21.92, 15.45 (C6 Fucα), 13.90 (2 СH₃); ИЭР МСВР: найдено m/z 1725.2752, рассчитано для C₁₅₃H₂₃₇N₂₄O₅₉PS₂^2–, [M – 2H]^2– 1725.2738; найдено m/z 1149.8477, рассчитано для C₁₅₃H₂₃₆N₂₄O₅₉PS₂^3–, [M – 3H]^3– 1149.8492; найдено m/z 862.1339, рассчитано для C₁₅₃H₂₃₅N₂₄O₅₉PS₂^4–, [M – 4H]^4– 862.1357; найдено m/z 689.5057, рассчитано для C₁₅₃H₂₃₄N₂₄O₅₉PS₂^5–, [M – 5H]^5– 689.5077; найдено m/z 754.4202^6–, рассчитано для C₁₅₃H₂₃₃N₂₄O₅₉PS₂, [M – 6H]^6– 574.4225.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Синтезированы два бифункциональных липофильных конструкта, содержащих тетрасахарид А (тип 2) (гликан), CMG–DOPE (спейсер-липид) и отличающиеся флуоресцентной меткой (флуоресцеин или сульфоцианин-3). Опробованы две синтетические стратегии, отличающиеся порядком конъюгирования составных блоков; обе стратегии позволяют получать СЛК, содержащие другие гликаны и флуоресцентные метки.

Синтезированные липофильные конструкты предназначены для прямой флуоресцентной визуализации гликанов, встроенных в клеточную мембрану в составе СЛК. Независимый характер введения гликана и флуоресцентной метки в конструкт (они не связаны ковалентно и разнесены пространственно) исключает влияние флуорофора на узнавание углеводной части СЛК гликан-специфическими белками, что позволит исследовать взаимодействие последних с гликанами непосредственно в составе гликокаликса клетки.

ФОНДОВАЯ ПОДДЕРЖКА

Работа выполнена при финансовой поддержке гранта Российского научного фонда № 22-23-00756 “Синтетические гликолипидные биоконъюгаты как инструменты исследования эукариотической клетки”.

СОБЛЮДЕНИЕ ЭТИЧЕСКИХ СТАНДАРТОВ

Настоящая статья не содержит описания исследований с участием людей или использованием животных в качестве объектов исследования.

КОНФЛИКТ ИНТЕРЕСОВ

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

About the authors

D. O. Anisimova

Shemyakin–Ovchinnikov Institute of Bioorganic Chemistry of the Russian Academy of Sciences

Email: imryzhov@gmail.com
Russian Federation, ul. Miklukho-Maklaya 16/10, Moscow, 117997

M. S. Savchenko

Shemyakin–Ovchinnikov Institute of Bioorganic Chemistry of the Russian Academy of Sciences

Email: imryzhov@gmail.com
Russian Federation, ul. Miklukho-Maklaya 16/10, Moscow, 117997

A. B. Tuzikov

Shemyakin–Ovchinnikov Institute of Bioorganic Chemistry of the Russian Academy of Sciences

Email: imryzhov@gmail.com
Russian Federation, ul. Miklukho-Maklaya 16/10, Moscow, 117997

A. S. Paramonov

Shemyakin–Ovchinnikov Institute of Bioorganic Chemistry of the Russian Academy of Sciences

Email: imryzhov@gmail.com
Russian Federation, ul. Miklukho-Maklaya 16/10, Moscow, 117997

A. O. Chizhov

N. D. Zelinsky Institute of Organic Chemistry of the Russian Academy of Sciences

Email: imryzhov@gmail.com
Russian Federation, Leninskiy prosp. 47, Moscow, 119991

N. V. Bovin

Shemyakin–Ovchinnikov Institute of Bioorganic Chemistry of the Russian Academy of Sciences

Email: imryzhov@gmail.com
Russian Federation, ul. Miklukho-Maklaya 16/10, Moscow, 117997

I. M. Ryzhov

Shemyakin–Ovchinnikov Institute of Bioorganic Chemistry of the Russian Academy of Sciences

Author for correspondence.
Email: imryzhov@gmail.com
Russian Federation, ul. Miklukho-Maklaya 16/10, Moscow, 117997

References

Supplementary files