The approach to the preparation of cyclic photocleavable RNA for photoactivatable CRISPR/Cas9 System

Мұқаба

Дәйексөз келтіру

Толық мәтін

Ашық рұқсат Ашық рұқсат
Рұқсат жабық Рұқсат берілді
Рұқсат жабық Тек жазылушылар үшін

Аннотация

The development of controllable gene editing systems on the base of CRISPR/Cas is an actually problem of modern molecular biology and genetic enginery. Interesting variant of solution of this problem is modification of guide RNA by introduction of photocleavable linkers. We developed the approach to the synthesis of cyclic photocleavable guide crRNA for the CRISPR/Cas9 system with photolinker on the base of 1-(2-nitrophenyl)-1,2-ethanediol (PL). Upon irradiation by UV-light these guide RNA are linearized and CRISPR/Cas9 system is activated. Two chemical methods to the cyclization of RNA were tested: Michael reaction (thiol-maleimide condensation) and Cu-catalyzed azide-alkyne cycloaddition (CuAAC, click-chemistry reaction). For this purpose 5',3'-modified RNA containing reactive groups were prepared. The advantages of CuAAC reaction for cyclic RNA preparation was demonstrated. Effectivity of cyclic RNAs is depends from their secondary structure and ability of reactive groups to draw together. Series of photocleavable and control non-cleavable cyclic crRNA were obtained. It was shown that cyclic crRNAs guide nuclease Cas9 for plasmid cleavage less effective but linearization of photocleavable cyclic crRNA increases extent of plasmid cleavage. Developed approach permits prepare cyclic photocleavable RNA including spatiotemporal activation of guide RNA for gene editing. Photoregulation of gene editing will permit to lower the off-target effects and to carry out the editing more targeting.

Толық мәтін

Рұқсат жабық

Авторлар туралы

E. Ivanskaya

Intitute of Chemical Biology and Funamental Medicine SB RAS; Novosibirsk State University

Email: danov@niboch.nsc.ru
Ресей, prosp. Acad. Lavrentjeva 8, Novosibirsk, 630090; ul. Pirogova 1, Novosibirsk, 630090

M. Meschaninova

Intitute of Chemical Biology and Funamental Medicine SB RAS

Email: danov@niboch.nsc.ru
Ресей, prosp. Acad. Lavrentjeva 8, Novosibirsk, 630090

M. Vorobyeva

Intitute of Chemical Biology and Funamental Medicine SB RAS

Email: danov@niboch.nsc.ru
Ресей, prosp. Acad. Lavrentjeva 8, Novosibirsk, 630090

D. Zharkov

Intitute of Chemical Biology and Funamental Medicine SB RAS; Novosibirsk State University

Email: danov@niboch.nsc.ru
Ресей, prosp. Acad. Lavrentjeva 8, Novosibirsk, 630090; ul. Pirogova 1, Novosibirsk, 630090

D. Novopashina

Intitute of Chemical Biology and Funamental Medicine SB RAS; Novosibirsk State University

Хат алмасуға жауапты Автор.
Email: danov@niboch.nsc.ru
Ресей, prosp. Acad. Lavrentjeva 8, Novosibirsk, 630090; ul. Pirogova 1, Novosibirsk, 630090

Әдебиет тізімі

  1. Jinek M., Chylinski K., Fonfara I., Hauer M., Doudna J.A., Charpentier E. // Science. 2012. V. 337. P. 816–821. https://doi.org/10.1126/science.1225829
  2. Wang, J.Y., Pausch, P., Doudna, J.A. // Nat. Rev. Microbiol. 2022. V. 20. P. 641–656. https://doi.org/10.1038/s41579-022-00739-4
  3. Makarova K.S., Wolf Y.I., Iranzo J., Shmakov S.A., Alkhnbashi O.S., Brouns S.J.J., Charpentier E., Cheng D., Haft D.H., Horvath P., Moineau S., Mojica F.J.M., Scott D., Shah S.A., Siksnys V., Terns M.P., Venclovas Č., White M.F., Yakunin A.F., Yan W., Zhang F., Garrett R.A., Backofen R., van der Oost J., Barrangou R., Koonin E.V. // Nat. Rev. Microbiol. 2020. V. 18. P. 67–83. https://doi.org/10.1038/s41579-019-0299-x
  4. Brown W., Zhou W., Deiters A. // ChemBioChem. 2021. V. 22. P. 63–72. https://doi.org/10.1002/cbic.202000423
  5. Sun Y.-J., Chen W.-D., Liu J., Li J.-J., Zhang Y., Cai W.-Q., Liu L., Tang X.-J., Hou J., Wang M., Cheng L. // Angew. Chemie Int. Ed. 2023. V. 62. P. e202212413. https://doi.org/10.1002/anie.202212413
  6. Zhang Y., Ling X., Su X., Zhang S., Wang J., Zhang P., Feng W., Zhu Y.Y., Liu T., Tang X. // Angew. Chemie. 2020. V. 132. P. 21081–21085. https://doi.org/10.1002/anie.202009890
  7. Hartmann D., Booth M.J. // Commun. Chem. 2023. V. 6. P. 59. https://doi.org/10.1038/s42004-023-00860-2
  8. Darrah K.E., Deiters A. // Chem. Soc. Rev. 2021. V. 50. P. 13253-13267. https://doi.org/10.1039/d1cs00257k
  9. Wu Y., Yang Z., Lu Y. // Curr. Opin. Chem. Biol. 2020. V. 57. P. 95–104. https://doi.org/10.1016/j.cbpa.2020.05.003
  10. Casey J.P., Blidner R.A., Monroe W.T. // Mol. Pharm. 2009. V. 6. P. 669–685. https://doi.org/10.1021/mp900082q
  11. Petkovic S., Müller S. // Nucl. Acids Res. 2015. V. 43. P. 2454–2465. https://doi.org/10.1093/nar/gkv045
  12. Obi P., Chen Y.G. // Methods. 2021. V. 196. P. 85–103. https://doi.org/10.1016/j.ymeth.2021.02.020
  13. Lietard J., Meyer A., Vasseur J.-J., Morvan F. // J. Org. Chem. 2008. V. 73. P. 191–200. https://doi.org/10.1021/jo702177c
  14. Wesselhoeft R.A., Kowalski P.S., Anderson D.G. // Nat. Commun. 2018. V. 9. P. 2629. https://doi.org/10.1038/s41467-018-05096-6
  15. Ji D., Lyu K., Zhao H., Kwok C.R. // Nucleic Acids Res. 2021. V. 49. P. 7280–7291. https://doi.org/10.1093/nar/gkab593
  16. Riccardi C., Meyer A., Vasseur J.-J., Krauss I.R., Paduano L., Morvan F., Montesarchio D. // Bioorg. Chem. 2020. V. 94. P. 103379. https://doi.org/10.1016/j.bioorg.2019.103379
  17. Zhang X.-J., Zhao Z., Wang X., Su M.-H., Ai L., Li Y., Yuan Q., Wang X.-Q., Tan W. // Natl. Sci. Rev. 2022. V. 10. P. nwac107. https://doi.org/10.1093/nsr/nwac107
  18. Sánchez A., Pedroso E., Grandas A. // Chem. Commun. 2013. V. 49. P. 309–311. https://doi.org/10.1039/c2cc35357a
  19. Yamazoe S., Liu Q., McQuade L.E., Deiters A., Chen J.K. // Angew. Chem. Int. Ed. 2014. V. 53. P. 10114–10118. https://doi.org/10.1002/anie.201405355
  20. Brown W., Bardhan A., Darrah K., Tsang M., Deiters A. // J. Am. Chem. Soc. 2022. V. 144. P. 16819–16826. https://doi.org/10.1021/jacs.2c04479
  21. Klimek R., Wang M., McKenney V.R., Schuman E.M., Heckel A. // Chem. Commun. 2021. V. 57. P. 615– 618. https://doi.org/10.1039/d0cc06704k
  22. Yang L., Kim H.B., Sul J.-Y., Yeldell S.B., Eberwine J.H., Dmochowski I.J. // ChemBioChem. 2018. V. 19. P. 1250–1254. https://doi.org/10.1002/cbic.201800012
  23. Akhmetova E.A., Golyshev V.M., Vokhtantsev I.P., Meschaninova M.I., Venyaminova A.G., Novopashina D.S. // Russ. J. Bioorg. Chem. 2021. V. 47. P. 496–504. https://doi.org/10.1134/S1068162021020023
  24. Semikolenova O., Sakovina L., Akhmetova E., Kim D., Vokhtantsev I., Golyshev V., Vorobyeva M., Novopashin S., Novopashina D. // Int. J. Mol. Sci. 2021. V. 22. P. 10919. https://doi.org/10.3390/ijms222010919
  25. Meschaninova M.I., Novopashina D.S., Semikolenova O.A., Silnikov V.N., Venyaminova A.G. // Molecules. 2019. V. 24. P. 4266. https://doi.org/10.3390/molecules24234266
  26. Novopashina D., Vorobyeva M., Nazarov A., Davydova A., Danilin N., Koroleva L., Matveev A., Bardasheva A., Tikunova N., Kupryushkin M., Pyshnyi D., Altman S., Venyaminova A. // Front. Pharmacol. 2019. V. 10. P. 813. https://doi.org/10.3389/fphar.2019.00813
  27. Danilin N.A., Koroleva L.S., Novopashina D.S., Venyaminova A.G. // Russ. J. Bioorg. Chem. 2019. V. 45. P. 825–832. https://doi.org/10.1134/S106816201906013X
  28. Deltcheva E., Chylinski K., Sharma C.M., Gonzales K., Chao Y., Pirzada Z.A., Eckert M.R., Vogel J., Charpentier E. // Nature. 2011. V. 471. P. 602–607. https://doi.org/10.1038/nature09886
  29. Sternberg S.H., Redding S., Jinek M., Greene E.C., Doudna J.A. // Nature. 2014. V. 507. P. 62–67. https://doi.org/10.1038/nature13011
  30. Shibata M., Nishimasu H., Kodera N., Hirano S., Ando T., Uchihashi T., Nureki O. // Nat. Commun. 2017. V. 8. Р. 1430. https://doi.org/10.1038/s41467-017-01466-8
  31. Kida S., Maeda M., Hojo K., Eto Y., Nakagawa S., Kawasaki K. // Chem. Pharm. Bull. 2007. V. 55. P. 685– 687. https://doi.org/10.1248/cpb.55.685
  32. Anders C., Jinek M. // Methods Enzymol. 2014. V. 546. P. 1–20. https://doi.org/10.1016/B978-0-12-801185-0.00001-5
  33. Shubsda M.F., Goodisman J., Dabrowiak J.C. // J. Biochem. Biophys. Methods. 1997. V. 34. P. 73–79. https://doi.org/10.1016/S0165-022X(96)01204-3

Қосымша файлдар

Қосымша файлдар
Әрекет
1. JATS XML
Жүктеу
2. Fig. 1. The proposed strategy for the functioning of the photoregulated CRISPR/Cas9 system using cyclic photoblocked crRNAs. PAM is a protospacer adjacent motif.

Жүктеу (73KB)
Метадеректер
3. Fig. 2. The most probable secondary structures of cyclic crRNAs: C-42-P1, C-46-P1, C-46-P2, C-48-P1 and C-48-P2, obtained using the OligoAnalyzer program (https://www.idtdna.com/calc/analyzer).

Жүктеу (116KB)
Метадеректер
4. Fig. 3. RP-HPLC profile of the isolated cyclization products corresponding to the initial linear oligonucleotide (blue) and cyclic crRNA (gray). Chromatography was performed in a concentration gradient of 0–50% CH3CN in 0.02 M triethylammonium acetate (pH 7.0). The peak release time of the cyclic product C-46-P1-cyc was 571 s, and that of the initial linear 5′,3′-modified oligoribonucleotide C-46-P1 was 539 s.

Жүктеу (56KB)
Метадеректер
5. Fig. 4. Cleavage of cyclic RNAs C-46-P1 and C-46-P2 under UV irradiation. Electrophoretic analysis in 15% denaturing PAGE: 1 – cyclic C-46-P1, 2 – UV-irradiated cyclic C-46-P1, 3 – cyclic C-46-P2, 4 – UV-irradiated cyclic C-46-P2. Irradiation wavelength – 365 nm, irradiation time – 30 min. Visualization of RNA in the gel was performed by staining with a solution of Stains-all dye. BP – bromophenol blue.

Жүктеу (51KB)
Метадеректер
6. Fig. 5. (a) Schematic representation of the active CRISPR/Cas9 complex; (b) electrophoretic analysis of plasmid substrate cleavage. M – set of dsDNA length markers, K– – control containing plasmid without enzyme, K+ – plasmid after cleavage with Cas9 nuclease with unmodified crRNA. UV: the “–” sign means no irradiation, the “+” sign means irradiation with UV light for 30 min at 365 nm.

Жүктеу (148KB)
Метадеректер
7. Fig. 6. Efficiency of plasmid DNA cleavage using irradiated and non-irradiated cyclic photocleavable crRNAs and their non-cleavable analogs. K– – intact plasmid; K+ – plasmid cleavage by Cas9 nuclease in the presence of a pair of unmodified crRNA/tracrRNA guide RNAs; UV: the “–” sign means no irradiation, the “+” sign means irradiation with UV light for 30 min at 365 nm.

Жүктеу (84KB)
Метадеректер
8. Scheme 1. Introduction of an azido group at the 5'-end of a 3'-alkyne-modified oligoribonucleotide.

Жүктеу (69KB)
Метадеректер
9. Scheme 2. Obtaining an oligoribonucleotide containing an amino group at the 3' end and a cystamine residue at the 5' end.

Жүктеу (105KB)
Метадеректер
10. Scheme 3. Preparation of an oligoribonucleotide containing a thiol group at the 3' end and a maleimide group at the 5' end.

Жүктеу (100KB)
Метадеректер
11. Scheme 4. Synthesis of cyclic oligoribonucleotide by the azide-alkyne cycloaddition method.

Жүктеу (58KB)
Метадеректер
12. Scheme 5. Synthesis of cyclic oligoribonucleotide by thiol-maleimide condensation.

Жүктеу (71KB)
Метадеректер

© Russian Academy of Sciences, 2024

Согласие на обработку персональных данных с помощью сервиса «Яндекс.Метрика»

1. Я (далее – «Пользователь» или «Субъект персональных данных»), осуществляя использование сайта https://journals.rcsi.science/ (далее – «Сайт»), подтверждая свою полную дееспособность даю согласие на обработку персональных данных с использованием средств автоматизации Оператору - федеральному государственному бюджетному учреждению «Российский центр научной информации» (РЦНИ), далее – «Оператор», расположенному по адресу: 119991, г. Москва, Ленинский просп., д.32А, со следующими условиями.

2. Категории обрабатываемых данных: файлы «cookies» (куки-файлы). Файлы «cookie» – это небольшой текстовый файл, который веб-сервер может хранить в браузере Пользователя. Данные файлы веб-сервер загружает на устройство Пользователя при посещении им Сайта. При каждом следующем посещении Пользователем Сайта «cookie» файлы отправляются на Сайт Оператора. Данные файлы позволяют Сайту распознавать устройство Пользователя. Содержимое такого файла может как относиться, так и не относиться к персональным данным, в зависимости от того, содержит ли такой файл персональные данные или содержит обезличенные технические данные.

3. Цель обработки персональных данных: анализ пользовательской активности с помощью сервиса «Яндекс.Метрика».

4. Категории субъектов персональных данных: все Пользователи Сайта, которые дали согласие на обработку файлов «cookie».

5. Способы обработки: сбор, запись, систематизация, накопление, хранение, уточнение (обновление, изменение), извлечение, использование, передача (доступ, предоставление), блокирование, удаление, уничтожение персональных данных.

6. Срок обработки и хранения: до получения от Субъекта персональных данных требования о прекращении обработки/отзыва согласия.

7. Способ отзыва: заявление об отзыве в письменном виде путём его направления на адрес электронной почты Оператора: info@rcsi.science или путем письменного обращения по юридическому адресу: 119991, г. Москва, Ленинский просп., д.32А

8. Субъект персональных данных вправе запретить своему оборудованию прием этих данных или ограничить прием этих данных. При отказе от получения таких данных или при ограничении приема данных некоторые функции Сайта могут работать некорректно. Субъект персональных данных обязуется сам настроить свое оборудование таким способом, чтобы оно обеспечивало адекватный его желаниям режим работы и уровень защиты данных файлов «cookie», Оператор не предоставляет технологических и правовых консультаций на темы подобного характера.

9. Порядок уничтожения персональных данных при достижении цели их обработки или при наступлении иных законных оснований определяется Оператором в соответствии с законодательством Российской Федерации.

10. Я согласен/согласна квалифицировать в качестве своей простой электронной подписи под настоящим Согласием и под Политикой обработки персональных данных выполнение мною следующего действия на сайте: https://journals.rcsi.science/ нажатие мною на интерфейсе с текстом: «Сайт использует сервис «Яндекс.Метрика» (который использует файлы «cookie») на элемент с текстом «Принять и продолжить».