Skeletochronology of amphibians and reptiles: fundamentals of methodology, variety of problems and prospects

Full Text

Посвящается Галине Александровне Клевезаль

Скелетохронология – это «определение индивидуального возраста амфибий и рептилий по ростовым слоям на срезах костей конечностей, и особенно прижизненное, по слоям на срезах фаланг пальцев…» (Клевезаль, Смирина, 2016). «В скелетохронологическом анализе подсчитывается количество циклических годовых ростовых меток в первичном периостелиальном кортексе костей» (Скучас, Колчанов, 2024). Этот метод определения индивидуального возраста у пойкилотермных животных с годовым циклическим ростом получил широкое распространение благодаря своей надежности, возможности определять возраст животных прижизненно, а также возможности ретроспективно оценивать размеры тела по размерам ежегодных ростовых меток. Цель моего обзора – рассмотреть применение скелетохронологии для определения индивидуального возраста и для решения разнообразных прикладных и общетеоретических задач, возникающих на основе полученных данных по возрасту. Моей целью также было описание возможностей и ограничений метода для широкого круга зоологов и специалистов близких специальностей, не имеющих опыта его применения.

ФОРМИРОВАНИЕ И ИССЛЕДОВАНИЕ РЕГИСТРИРУЮЩИХ СТРУКТУР ¹ В ТРУБЧАТЫХ КОСТЯХ

В трубчатых костях амфибий и рептилий ростовые слои, включающие в себя линии остановки роста (lines of arrested growth, далее для краткости – LAGs), формируются в периостальной части (Румянцев, 1958; Клейненберг, Смирина, 1969; Смирина, 1972). Ростовые слои могут формироваться также в эндостальной части трубчатых костей, но они малопригодны для скелетохронологического исследования, поскольку выражены менее четко, а кроме того, при увеличении объема костномозговой полости эндостальная кость резорбируется обычно в значительной степени или полностью. В редких случаях, у взрослых ящериц, площадь эндостальной кости на поперечном срезе бедра может быть больше площади костномозговой полости, но при этом хорошо различимые ростовые слои и LAGs отсутствуют (Кидов и др., 2023а, рис. 2). Важно также учитывать, что наибольшее число ростовых слоев формируется вблизи середины диафиза кости, и по мере продвижения от середины диафиза к эпифизам вероятность увидеть на поперечных срезах полный набор ростовых слоев и LAGs снижается (Rozenblut, Ogielska, 2005, Fig. 11 и 12).

Следует также отметить, что у амфибий и рептилий LAGs формируются, как правило, во всех случаях, в отличие от современных птиц и крупных млекопитающих, а также некоторых групп ископаемых тетрапод (обзор см. Скучас, Колчанов, 2024).

У амфибий и рептилий умеренной зоны в течение активного периода в годовом цикле обычно формируется один ростовой слой, ограниченный одной LAG. Эта закономерность была доказана с помощью введения животным тетрациклиновой метки, которая локализуется в узкой зоне трубчатой кости в период, соответствующий остановке роста (Смирина, 1972). Такая остановка роста происходит либо во время зимовки, либо во время летней спячки. Существует довольно много исключений из этой закономерности, наиболее важные будут рассмотрены в дальнейшем.

Оценка темпов резорбции и количества резорбированных LAGs

По мере роста животного и увеличения размеров костномозговой полости может увеличиваться и число внутренних LAGs, подвергшихся полной резорбции. Очевидно, общей закономерностью является более высокая вероятность резорбции большего числа внутренних LAGs у наиболее старых особей в выборке. Для количественной оценки размеров потенциально резорбированных LAGs необходимо дополнительно к взрослым особям иметь группу годовиков, а лучше– еще и двухлетних особей той же популяции, для сравнения наружного диаметра их кости с величиной костномозговой полости взрослых особей. В идеале, для каждой популяции даже одного вида (особенно широкоареального) следует иметь свою «корректирующую» группу неполовозрелых особей (Э. М. Смирина, личное сообщение). Более подробное описание процедуры оценки количества резорбированных внутренних LAGs – см. Hemelaar, 1985; Клевезаль, Смирина, 2016. В обзоре (Клевезаль, Смирина, 2016) так же подробно рассмотрены другие сложные случаи отсутствия соответствия количества видимых ростовых слоев и LAGs возрасту особи, такие как сдвоенные LAGs и невозможность различения крайних внешних LAGs вследствие крайне медленного роста у наиболее старых особей.

«Голень vs бедро vs фаланга пальца»

При возможности выбора между фалангами пальцев и более крупными костями конечностей обычно отдают предпочтение крупным костям, особенно в тех случаях, когда заранее известно, что в исследуемой выборке много старых особей. У таких животных расстояние между наружными LAGs может быть настолько малым, что на срезах фаланг эти LAGs будут сливаться, но могут быть идентифицированы на срезах больших костей. У большинства бесхвостых амфибий в качестве наиболее крупной и удобной кости выбирают бедренную кость. Однако наше исследование небольших выборок травяных и остромордых лягушек позволило сделать заключение, что в кости голени костномозговая полость меньше, и поэтому в них выше вероятность неполной резорбции LAGs, соответствующих 1-й и 2-й зимовкам. Э. М. Смирина, посмотрев срезы бедренных костей и костей голени лягушек из этих выборок, согласилась с моим заключением (Ляпков, неопубликованные данные; Смирина, личное сообщение).

При сравнении количества и качества LAGs в фалангах и больших трубчатых костях были получены разнообразные результаты. Так, не было выявлено различий между числом LAGs в плечевой кости и фаланге пальцев у 10 особей обыкновенного тритона (Marnell, 1997). У 14 взрослых ящериц Psammodromus algirus были изготовлены поперечные срезы фаланг, бедренной и плечевой костей, и у всех особей различий по числу LAGs не выявлено (Comas et al., 2016). Темп резорбции в фалангах может быть выше, чем в бедре и голени (у крабоядной лягушки (Fejervarya cancrivora) – Rajmira, 2022), или, наоборот, – ниже (у агамы Laudakia stoliczkana – Smirina, Ananjeva, 2007). Вполне вероятно, у каждого вида существует свое соотношение, и поэтому необходимо исследовать каждый из видов в поисках трубчатой кости с минимальным темпом резорбции костномозговой полости (Sahoo, Kara, 2017).

Недостатки и преимущества использования фаланг пальцев

К недостаткам, как уже отмечалось, относятся сравнительно мелкие размеры кости, что существенно уменьшает расстояние между линиями склеивания, соответствующими последним зимовкам, и повышает вероятность их полного слияния. Кроме того, у долгоживущих видов число слоев и LAGs в фалангах может быть всегда меньше реального возраста особи (Plytycz, Bigaj, 1993; Eden et al., 2007; Wagner et al., 2011; Sinsch, 2015). Также было сделано предположение, что рост фаланг пальцев в толщину с возрастом прекращается, в то время как более крупные трубчатые кости продолжают расти (Smirina, Ananjeva, 2007).

Отдельной группой стоят вопросы научной этики и охраны редких и исчезающих видов, поскольку в большинстве случаев остается неясным, насколько сильно процедура отрезания фаланг пальцев снижает выживаемость (Ginnan et al., 2014; Zamora-Camacho et al., 2023).

К преимуществам использования фаланг относятся уже упоминавшиеся сравнительно низкие темпы резорбции костномозговой полости и, следовательно, меньшая вероятность полной резорбции первой LAG (Smirina, Ananjeva, 2007; Quiroga et al., 2015). Интересно отметить, что у круглоголовок Phrynocephalus vlangalii лучшие срезы получаются из проксимальной половины фаланг, благодаря ненаправленному удлинению этой части кости (Ma et al., 2022). Хорошие результаты получаются также при использовании для изготовления срезов фаланг Salamandrina perspicillata (Bovero et al., 2006). У южноамериканских субтропических видов бесхвостых амфибий наблюдались более стабильное формирование LAGs и их лучшая выраженность в фалангах пальцев, по сравнению с бедренной и плечевой костями (Brum et al., 2019). При этом, также согласно утверждению авторов, LAGs были видны лучше на срезах фаланги 4-го пальца задней конечности, в сравнении с 3-м пальцем. Такая однотипность результата не вполне понятна, поскольку было исследовано 11 видов, относящихся к 8 разным семействам: Alsodidae, Centronelidae, Bufonidae, Hylidae, Leptodactylidae, Microhylidae, Odontophrynidae, Phyllomedusidae.

Оптимизация процесса изготовления и окрашивания срезов

Обычно срезы кости изготавливают на замораживающем микротоме, что, в отличие от заключения в парафин, позволяет существенно ускорить процесс. Окрашенные срезы помещают затем на предметное стекло в 100%-й глицерин и, расправив, накрывают покровным стеклом, т. е. изготовляют временные препараты. Существует еще несколько способов сэкономить время изготовления срезов. Вместо замораживания кости в воде, можно использовать более удобную среду, например, реагент для криоблоков Tissue-Tek (Sinsch et al., 2010). Другой удобный вариант – заключение кости в гисторезин (Sinsch et al., 2002), позволяющий получать срезы без замораживания. В двух последних случаях, вместо санного, можно использовать ротационный микротом.

Существуют также коммерческие фирмы (в т. ч. Matson lab (https://matsonslab.com/), которые в середине 2000-х гг. изготовляли окрашенные срезы из фаланг пальцев лягушек.

Большие сложности (и соответственно – потери времени) возникают в процессе подготовки мелких фаланг пальцев и при работе с ними на микротоме. Обычно такие фаланги заключают в парафиновые блоки. В качестве альтернативы было предложено проводить предварительное тотальное окрашивание всей фаланги (Hasumi, Watanabe, 2007), которое делает ее более заметной и упрощает подготовку к работе на замораживающем микротоме.

Изучение окрашенных срезов, работа одновременно с несколькими операторами и отбраковка сомнительных случаев

Для исследования сложных случаев, т. е. когда ростовые слои и LAGs четко не различаются и плохо идентифицируются, была предложена стратегия совместной работы нескольких операторов (Смирина и др., 1994). Таким способом можно было отделить по крайней мере более надежно идентифицируемые срезы от самых сомнительных случаев. Скромный опыт автора позволяет предложить иную модификацию этой стратегии: совместное рассмотрение всеми операторами каждого из несовпадающих случаев, что позволяет выявить явно ошибочные определения числа LAGs любым из операторов. В результате остаются лишь те случаи, которые каждый из операторов считает действительно сомнительными. И лучшее решение для таких общепризнанных сомнительных случаев – исключить их из выборки. С такой отбраковкой сомнительных случаев вполне согласна Э. М. Смирина (Смирина, личное сообщение). Отметим также, что такие сомнительные случаи встречаются довольно редко – рис. 1 (см. также Lyapkov et al., 2021).

Рис. 1. Пример дополнительных LAGs на срезе кости голени (4 такие линии отмечены стрелками со знаком вопроса), которые могут быть неотличимы от LAGs, соответствующих зимовкам (отмечены стрелками): двухгодовалая озерная лягушка из камчатской популяции с длительным периодом активности в течение годового цикла. Длина отрезка 1 мм.

Другие методы визуализации LAGs

Вместо изготовления окрашенных поперечных срезов была предпринята попытка использования продольных шлифов трубчатых костей. Полученные препараты рассматривали в поляризационном свете, что давало возможность не только увидеть все LAGs, но и проследить их изменения от середины диафиза к эпифизам (Корнилова и др., 1996). Однако этот метод не получил широкого распространения, поскольку приготовление шлифов занимало приблизительно столько же времени, сколько изготовление срезов, а качество полученных неокрашенных шлифов было существенно ниже.

Недавно были опубликованы результаты применения петрографических шлифов трубчатых костей нескольких видов амфибий и рептилий, в сравнении с результатами применения окрашенных срезов тех же костей (Schucht et al., 2021). В большинстве случаев количество LAGs на гистологических срезах превышало таковое на шлифах, обратное соотношение наблюдалось реже. При этом количество LAGs не всегда совпадало с реальным (известным заранее) возрастом животного. Авторы не приводят объяснений таким различиям, но поскольку каждый вид был представлен всего лишь одним экземпляром (даже хуже, чем в коллекции Ноя), причем долгое время содержавшимся в неволе, следует считать результаты этого исследования не более чем предварительными.

ОСНОВНЫЕ РЕШАЕМЫЕ ЗАДАЧИ

Оценка индивидуального возраста, возраста достижения половой зрелости и других демографических характеристик

При применении метода скелетохронологии обычной задачей является оценка возрастного распределения исследуемой популяции или ее половозрелой части, а также возраста достижения половой зрелости (первого размножения) и максимального возраста.

Кроме того, на основании данных возрастного распределения часто определяют выживаемость и ожидаемую продолжительность жизни, по формулам Робсона и Чапмана (Robson, Chapman, 1961, цит. по: Miaud et al., 1999). При этом далеко не во всех исследованиях проводится проверка на постоянство возрастного распределения, что является необходимым условиям получения оценок по этим формулам. Поэтому для оценок погодовой выживаемости также используют построение таблиц выживания (life tables), причем необходимые для выделения генераций данные по возрастам в исследуемой выборке часто получают с помощью скелетохронологии.

Принято считать, что рост амфибий по завершении метаморфоза и рост молоди рептилий происходит первоначально максимально быстро. Последующее замедление роста связано с достижением половой зрелости, поскольку происходит перераспределение ресурсов, бóльшая часть которых в дальнейшем расходуется на формирование гонад. На основании такого допущения замедление роста, проявляющееся как значительное снижение расстояния между последующими LAGs, интерпретируется как достижение половой зрелости. Поэтому LAG, предшествующую такому замедлению роста, и считают соответствующей возрасту наступления половой зрелости.

Особо следует отметить, что возраст первого размножения далеко не всегда может быть определен только на основании размеров и данных скелетохронологии. В простейшем случае необходима выборка половозрелых особей, собранных в период размножения. Кроме того, дополнительные данные для коррекции оценки этого возраста могут быть получены на основании повторных отловов ранее меченых особей. Например, у бурых лягушек – это вышедшие из одного водоема метаморфы известного года рождения. Это могут быть и немеченые особи, (ре)интродуцированные на ранних стадиях жизненного цикла (икра, головастики или метаморфы) в водоемы местности, где данный вид отсутствует полностью. Так, после реинтродукции кладок икры остромордой лягушки было установлено, что на юге Швеции после первой зимовки становятся половозрелыми и приходят в нерестовые водоемы только немногочисленные самцы (Lardner, Loman, 2009), в то время как самки созревают минимум на год позднее.

Оценка темпов роста

Как уже отмечалось выше, рост амфибий и рептилий характеризуется наиболее высокими темпами до полового созревания, а затем замедляется, более или менее сильно. Но необходимо иметь в виду, что возрастная динамика темпов роста может демонстрировать высокую изменчивость, даже в пределах одной популяции. Так, при исследовании двух популяций травяной лягушки в юго-западной части ареала вида (Augert, Joly, 1993) было выявлено несколько типов «скелетограмм», которые различались расстояниями между соседними LAGs (Fig. 3 и 4), а также временем начала замедления роста. Это замедление могло начинаться не только после 2-й и 3-й зимовок, но и в более позднем возрасте, после окончания 5-й зимовки. Поскольку половая зрелость у лягушек в равнинных популяциях востока Франции наступает обычно после 2-й, но не позднее чем после 3-й зимовки, выявленные высокие темпы роста после 4-й и 5-й зимовок не соответствуют ожидаемому замедлению роста, связанному с перераспределением ресурсов на размножение.

Встречаются (хотя и редко) исключения из обычной динамики темпов роста пойкилотермных позвоночных животных по мере взросления. Широко известен случай повторного ускорения роста после достижения половой зрелости в некоторых популяциях арктического гольца, который был описан как часто встречающийся вариант у половозрелых (иногда и у неполовозрелых) особей ручьевой мелкой формы после их переселения в сравнительно крупное озеро и перехода на питание рыбой (Alekseyev et al., 2009; Fig. 4 и 5). Аналогичное ускорение роста, но всегда после достижения половой зрелости (также как часто встречающийся вариант) было выявлено лишь в одной популяции травяной лягушки, населяющей ограниченную территорию дна старого глубокого карьера (Ляпков, 2021; рис. II.30 и II.31 и табл. II.19.). В этом случае ускорение темпов роста, вероятно, также связано с увеличением размеров особей и возможностью расширения размерного спектра объектов питания. Несколько менее выраженная картина ускорения темпов роста была выявлена у Bufo sachalinensis (Матушкина и др., 2024, рис. 4 В); в этом случае ускорение может быть связано с исходно очень мелкими размерами метаморфов этого вида и медленным достижением сравнительно крупных размеров, при которых наступает половая зрелость. Кроме отмеченных случаев у амфибий, известны похожие случаи и у рептилий. Так, у морских черепах Caretta caretta первые 4–5 LAGs расположены близко друг к другу, но в более позднем возрасте темпы роста заметно повышаются (Snover et al., 2010; Fig.1 и 2), вследствие перехода молоди от пелагического образа жизни в открытом океане к жизни в прибрежной зоне. Интересно, что при исследовании других, географически близких популяций того же вида (у побережья юго-восточных штатов США и Азорских островов) подобной динамики темпов роста не выявлено. Очевидно, что во всех описанных случаях повторное ускорение темпов роста связано с пространственным изменением среды обитания или происходит вследствие такого сильного увеличения размеров, при котором изменяются отношения данной особи со средой. Отметим также, что согласно простейшим геометрическим расчетам (Cullen et al., 2021; Fig. 1, model 1: constant Δ radius), при постоянном приросте радиусов LAGs (что соответствует «скелетограммам» 3, 6 и 9, согласно Augert, Joly, 1993) происходит ускорение темпов увеличения как площади поперечного среза кости между двумя соседними LAGs, так и массы тела. Вместе с тем, такие скелетограммы в двух исследованных авторами популяциях травяной лягушки (Augert, Joly, 1993) встречаются наиболее редко.

Данные скелетохронологии используются также для изучения формирования половых различий по размерам в процессе постметаморфозного роста у амфибий (обзор см. Ляпков, 2021; Cajade et al., 2013; Zhang, Lu, 2013) и постнатального роста рептилий (обзор см. Cox et al., 2007). Так, при исследовании нескольких популяций остромордой лягушки из различных регионов ее обширного ареала, было показано, что самцы крупнее самок, не только в пределах одного возраста (Ляпков, 2021), но и в пределах каждой из исследованных генераций каждого данного возраста (Ляпков и др., 2007). Поэтому причина более крупных размеров половозрелых самцов этого вида – в выявленных различиях между особями разного пола по темпам роста, но не в различиях в среднем возрасте. В обзоре по другим видам Anura (Zhang, Lu, 2013) было показано, что половые различия по темпам роста демонстрируют высокую степень межвидовой и межвозрастной изменчивости.

Географическая изменчивость темпов роста – еще одна актуальная тема современных исследований. У широкоареальных видов различия между популяциями из местообитаний с длительным и коротким периодом активности в годовом цикле могут обусловливать значительные различия в возрасте при сходных размерах. На рис. 2 показан срез кости голени 2-летнего самца остромордой лягушки из южной популяции, с длительностью сезона активности 7 мес. и срез кости голени 9-летней самки приблизительно такого же размера из северной популяции, с длительностью сезона активности около 3.5 мес. Судя по расположению LAGs, эта самка впервые размножалась в возрасте не менее 4 лет.

Рис. 2. Примеры быстрого (А) и медленного (Б) роста, оцениваемого по относительному расстоянию между LAGs. Приведены срезы голени остромордых лягушек из популяций: А – Брянского леса, половозрелый самец, длина тела 64 мм, 2 зимовки и Б – Югана, половозрелая самка, длина тела 58 мм, 9 зимовок. Описание популяций – см. Ляпков, 2021. Длина отрезка 1 мм.

Не менее интересно исследование механизмов формирования межпопуляционной изменчивости максимальной продолжительности жизни в пределах данного вида. Согласно литературному обзору скелетохронологических исследований по хвостатым и бесхвостым амфибиям, максимальная продолжительность жизни ряда видов выше в горных популяциях (чем в равнинных), но не в высоких широтах (Zhang, Lu, 2012).

Ретроспективная оценка длины тела

Ретроспективная оценка длины тела основана на предварительном выборе уравнения зависимости длины тела от размеров среза трубчатой кости, с максимальным вкладом в изменчивость модели (согласно выбранному уравнению, и соответственно – минимальной величиной остаточной изменчивости). Далее, используя параметры выбранного уравнения, можно рассчитать неизвестное значение длины тела в данном возрасте по величине LAG, соответствующей данному возрасту (подробнее – Смирина, 1983). Несколько иной подход применили Маруноучи и соавт. (Marunouchi et al., 2000): они сравнивали длину тела Rana japonica, рассчитанную по различным формулам, с реальными данными, полученными при повторном отлове тех же самых особей известного возраста. Согласно их результатам, наиболее сходными с измеренными значениями были значения длины тела, рассчитанные по формуле Даля-Леа (Ricker, 1992, цит. по: Marunouchi et al., 2000); формула представляет собой простую пропорцию (подробнее см. Смирина, Ройтберг, 2012). Удобство применения формулы пропорции состоит также в том, что при расчете длины тела никакие параметры уравнения не используются, как это делается при использовании большинства других формул. В свою очередь, эти параметры могут изменяться в зависимости от объема и состава выборки, по которой производится их оценка. Вместе с тем, согласно результатам повторных отловов морских черепах (Snover et al., 2007), аллометрическая модель соотношения между диаметром поперечных срезов плеча и длиной карапакса Caretta caretta подходит для ретроспективной оценки длины карапакса лучше, чем линейная.

При этом некоторые авторы считают использование вместо диаметра LAGs площади кольца, ограниченного двумя соседними LAGs, более точным способом ретроспективной оценки длины тела, причем не только у бесхвостых амфибий (Sinsch et al., 2010; Sinsch, 2015), но и у хвостатых (Homan et al., 2003). Однако эти авторы не приводят никаких сравнительных результатов применения двух обсуждаемых методов ретроспективной оценки длины тела, утверждая лишь, что площадь прироста на срезе кости точнее отражает величину прироста, чем диаметр LAGs. Учитывая различие в зависимости длины тела от линейных размеров LAGs и от площади части среза, ограниченной соседними LAGs (Cullen et al., 2021), это утверждение не является очевидным.

Полученные данные по длине тела групп одновозрастных особей (полученным либо в результате группировки непосредственно измеренных особей известного возраста, либо в результате ретроспективной оценки длины тела) используют затем для оценки параметров уравнения роста, т. е. зависимости длины тела от возраста. Общепринятым считается использование линейной версии уравнения фон Берталанффи, параметрами которого являются начальная и предельная величины длины тела и коэффициент роста (Мина, Клевезаль, 1976). S-образная кривая, соответствующая этому уравнению, характеризуется двумя перегибами, т. е. первоначальным ускорением роста и его последующим замедлением. Однако, как было показано выше, рост пойкилотермных позвоночных в ряде случаев может вторично ускоряться, что создает принципиально иную картину роста. В качестве альтернативы, учитывающей такие сильные отклонения, было предложено производить простое сравнение одновозрастных групп особей по размерам (длине тела или весу), а также по приростам за известный интервал времени и скорости таких приростов (Ляпков, 2021).

Другие особенности роста, также создающие сложности при попытке его описания целиком, за весь жизненный цикл, были выявлены у рептилий со сравнительно мелкими размерами при вылуплении и крупными размерами взрослых особей. Так, у сравнительно мелких неполовозрелых Caretta caretta форма зависимости длины карапакса от диаметра поперечных срезов плеча отличалась от таковой у взрослых черепах (Snover et al., 2007). Поэтому было предложено проводить ретроспективную оценку длины карапакса отдельно у неполовозрелых и взрослых особей.

ОСНОВНЫЕ ПРЕИМУЩЕСТВА МЕТОДИКИ СКЕЛЕТОХРОНОЛОГИИ

Несомненным достоинством методики скелетохронологии является сравнительно малое количество времени, затрачиваемое для получения результатов: любая особь несет в себе регистрирующие структуры истории своего роста, и задача исследователя лишь в том, чтобы сделать эти структуры читабельными. В этом состоит принципиальное отличие от использования методики мечения и повторных отловов; дополнительное преимущество скелетохронологии возникает в том случае, когда мечение само по себе нарушает дальнейший нормальный рост.

Методика позволяет оценивать возраст прижизненно, благодаря возможности изготовлять срезы из фаланг пальцев. Считается, что невозможно получить материал прижизненно только у змей и черепах. Поскольку у черепах невозможно взять прижизненно фаланги пальцев, обычно используют плечевую кость. У змей обычно используют позвонки или кости черепа (нижней челюсти). Исследование на веретенице (Кидов и др., 2023) показало возможность прижизненно использовать позвонки хвоста, в которых число LAGs такое же, как в нижней челюсти. Здесь же следует отметить, что у безногих амфибий для изготовления срезов использовали только туловищные позвонки, что исключало возможность прижизненного определения возраста (Measey et al., 1998).

В отличие от методики мечения и повторных отловов, можно использовать погибших особей и экземпляры из музейных коллекций; взятие коротких дистальных фаланг пальцев обеспечивает минимальное повреждение ценным экземплярам (Roček et al., 2016).

Кроме данных по индивидуальному возрасту, методика позволяет получить дополнительную разнообразную ценную информацию (подробнее – см. выше, раздел «Основные задачи»).

Благодаря наличию ростовых слоев и LAGs у тропических и субтропических видов (Kumbar, Pancharatna, 2001; Tessa et al., 2017 – Мадагаскар, 12 видов бесхвостых амфибий), методика может быть использована не только для видов умеренной зоны. В качестве главной причины формирования LAGs принято считать сезонность климата (Brum et al., 2019). Не исключены также внутренние, наследственные механизмы, поскольку ростовые слои могут формироваться и в стабильных условиях эксперимента (Marangoni et al., 2009).

У долгоживущих личинок хвостатых амфибий, проходящих несколько зимовок до метаморфоза, также формируются ростовые слои и LAGs (Смирина и др., 1994; Khonsue, Matsui, 2001).

Также особо следует отметить, что данные, полученные в результате ретроспективной оценки размеров, дают возможность увеличить объем выборки в каждом из выявленных возрастов. Другими словами, каждая особь в этом случае представлена не одной парой переменных (длина тела при поимке и возраст при поимке), а дополнительно данными по рассчитанной длине тела в каждом из возрастов. Кроме того, если особь поймана не непосредственно перед уходом в зимовку (или сразу после выхода с зимовки), то расчетное значение длины тела, соответствующее ее последней зимовке, является более точной оценкой, поскольку ее длина тела при поимке определяется также приростом за период от выхода с зимовки до момента поимки.

Особенно наглядно преимущества скелетохронологии проявляются при сравнении с другими методиками. Так, в исследованиях рептилий (Szekely et al., 2024, всего в обзоре проанализировано 387 публикаций) скелетохронология используется в 80% случаев, т. е. намного чаще других методик (97 публикаций, 20% случаев). Отдельно по группам преимущество скелетохронологии выглядит не столь очевидно. Так, при изучении ящериц этот метод использовали в 48% случаев, другие методы – в 52%; при изучении змей, соответственно, 100% и 0%; черепах 68% и 32%.

РЕГИСТРИРУЮЩИЕ СТРУКТУРЫ, ОТЛИЧАЮЩИЕСЯ ОТ РОСТОВЫХ СЛОЕВ И LAGs КОСТЕЙ

Кроме ростовых слоев и LAGs костей, регистрирующими структурами обладают и многие другие ткани и органы. Наиболее известные из них и часто используемые – хорошо заметные ростовые слои в роговых щитках панциря черепах. Но прежде следует отметить, что соответствие возрасту особей количества LAGs на срезах лопатки, подвздошной, плечевой и бедренной костей было доказано впервые сравнительно недавно, с помощью изучения индивидуально меченых Gopherus agassizii (Curtin et al., 2008). Для немногих видов черепах (Caretta caretta, Lepidochelys kempii и Chelonia mydas) было также исследовано отложение тетрациклиновой метки в плечевой кости (Snover et al., 2011), и было доказано, что каждый ростовой слой со своей LAG откладывается раз в год. У черепах дополнительные регистрирующие структуры изучены наиболее детально. Рассмотрим некоторые особенности использования этих структур.

1. Слои в роговых щитках панциря черепах можно использовать и для определения возраста, и для ретроспективной оценки размеров тела (обзор см. Wilson et al., 2003; Rodriguez-Caro et al., 2015).
2. Однако точно не установлено, в каких случаях можно использовать (вместо LAGs) результаты измерения границ годовых слоев в щитках, поскольку в одних исследованиях число таких слоев соответствовало возрасту (который определяли методом индивидуального мечения или фотографирования карапакса и повторных отловов), а в других случаях – не соответствовало. Так, с помощью мечения и повторных отловов в нескольких точках на юго-востоке Испании было установлено, что у 57% особей Testudo graeca число ростовых слоев на щитках карапакса соответствует числу лет. У остальных 43% особей чаще встречались случаи заниженной оценки возраста по числу ростовых слоев (Rodriguez-Caro et al., 2015). В других исследованиях, в случае выявленного несоответствия, оценка возраста по слоям в роговых щитках чаще была завышенной, по причине остановки роста, не связанного с зимовкой, и появления дополнительных ростовых слоев. Вместе с тем, у достигших половой зрелости и сравнительно старых особей могут сливаться и становиться неразличимыми как LAGs в костях, так и крайние ростовые слои в щитках. Кроме того, края щитков могут становиться истертыми, и все это ведет к занижению оценки возраста по щиткам (Bertolero et al., 2005; Attum et al., 2011). Это еще одна причина предпочтительного применения ретроспективной оценки размеров отдельно к выборкам сравнительно молодых особей. Так, у пятнистой черепахи (Clemmys guttata) не выявлена корреляция между числом ростовых слоев в щитках пластрона и промежутком времени между двумя отловами (Howell, Seigel, 2018). Согласно результатам литературного обзора (Wilson et al., 2003), авторы всего 8 исследований (из 49) сделали вывод о невозможности использования подсчета годовых слоев в щитках для определения возраста.
3. При изучении черепах иногда использовали только скелетохронологию, т. е. изготовление срезов трубчатых костей (плеча или фаланг пальцев) и измерение LAGs (Yamoudi et al., 2019). Однако, публикаций, в которых сравнивали количество ростовых слоев в щитках и количество LAGs в трубчатых костях, крайне мало, а их результаты неоднозначны. Так, у молодых особей и самок китайской коробчатой черепахи (Cuora flavomarginata) количество LAGs на срезах плеча (с поправкой на резорбцию внутренних LAGs, близких к костномозговой полости) всегда меньше количества ростовых слоев в щитках, в то время как у взрослых самцов это различие недостоверно (Sun, Wu, 2020). У черепахи Gopherus polyphemus корреляция числа LAGs с числом ростовых слоев в щитках, а также с длиной карапакса и пластрона была сильной положительной (Ehret, 2007). При этом лучшая сохранность большинства LAGs наблюдалась в плечевой и бедренных костях, а наибольшему вторичному ремоделингу, сопровождающемуся утратой многих LAGs, были подвержены позвонки. Исследование Testudo graeca на юго-востоке Румынии (Vlad et al., 2024), также выявило положительную корреляцию числа LAGs с числом ростовых слоев в щитках. Однако у наиболее старых особей заниженными были оценки возраста и по числу ростовых слоев в больших трубчатых костях (максимум 28 лет), и по слоям в роговых щитках (30 лет), в отличие от результатов мечения и повторных отловов (40 лет).

Гораздо реже чем роговые панцири для определения возраста использовали склеральные косточки. У морских черепах Dermochelys coriacea число годовых слоев в этих косточках совпадает с числом LAGs в фалангах пальцев (Avens et al., 2009).

Ещё один «неклассический» подход – это зигапофизная скелетохронология, т. е. подсчёт годичных ростовых меток, формирующихся на поверхности сочленовных отростков позвонков. Подробное описание этого метода дано на примере определения возраста по позвонкам базального мозазаврида (Григорьев и др., 2002). Несмотря на преимущественное использование этого метода для оценки возраста и скорости роста вымерших форм (Григорьев и др., 2002; Skutschas et al., 2020), есть примеры его использования и для современных видов. Вероятно, впервые метод был применен для изучения пригодности оценок возраста у 6 видов современных змей (Petermann, Gauthier, 2018), причем, кроме дополнительных данных по известному возрасту животного, использовали также оценки возраста на основе окрашенных срезов ребер и тел позвонков. Было также показано, что у сибирского углозуба количество линий на поверхности зигапофизов совпадает с числом соответствующих линий на срезах зигапофизов (Skutschas et al., 2020). Кроме того, годичные ростовые метки есть на сочленовных поверхностях зигапофизов жаб, амбистом, варанов, питонов и крокодилов (Skutschas et al., 2020). Очевидно, этот метод имеет хорошие перспективы и применительно к современным животным.

Существуют и другие, сравнительно редко использующиеся регистрирующие структуры. Так, по характеру окраски брюха и форме гребня можно различить неполовозрелых и половозрелых самцов гребенчатых тритонов (Triturus cristatus), дискретно не различающихся по длине тела (Hinneberg et al., 2020).

В акродонтных зубах (молярах и премолярах) агамы Laudakia stoliczkana были выявлены ростовые слои и LAGs (Smirina, Ananjeva, 2007), число которых было таким же, как в LAGs в трубчатых костях (с поправкой на резорбцию двух внутренних LAGs). Однако, по мнению авторов, LAGs в зубах были существенно менее четкие и поэтому они не годятся для определения возраста.

Наружная роговая часть когтя нескольких видов скальных ящериц рода Darevskia характеризуется слоистой структурой (Galoyan et al., 2024), причем количество слоев совпадает с количеством LAGs в фалангах пальцев, которые несут эти когти.

«СКЕЛЕТОХРОНОЛОГИЯ VS МЕЧЕНИЕ И ПОВТОРНЫЕ ОТЛОВЫ»

В некоторых работах и обзорах приведены результаты сравнения двух основных подходов к оценкам возраста у особей одних и тех же популяций и указано, насколько часто эти оценки не совпадают. В некоторых случаях такие несовпадения имели вполне очевидные причины. Так, при повторных отловах впервые пришедших в нерестовый водоем 3-летних камышовых жаб одной популяции, ранее меченных по завершении метаморфоза, были обнаружены всего две особи с одной или двумя дополнительными LAGs (Tejedo et al., 1997). Сильное несовпадение реального и определенного с помощью скелетохрологии возраста, выявленное при исследовании популяции Ambystoma tigrinum nebulosum (Eden et al., 2007), очевидно, следует рассматривать как редкий и наиболее сильно уклоняющийся случай. По мнению авторов, такое сильное несовпадение вызвано высоким темпом резорбции костномозговой полости и частыми перестройками структуры кости фаланг. Известно также, что в пиренейских популяциях Salamandra salamandra могут резорбироваться LAGs, соответствующие не только 1-й и 2-й, но и 3-й зимовке (Alcobendas, Castanet, 2000). Обзор сравнительных данных по безлегочным саламандрам (Staub, 2016) показал, что для каждого из рассмотренных видов, оценки максимального возраста методом скелетохрологии (максимум 15 лет у Desmognathus quadramaculatus) и с помощью мечения и повторных отловов не сильно различались, хотя значения первых были всегда несколько ниже. Вместе с тем прямые наблюдения и измерения особей, содержащихся в неволе, дают более высокие оценки максимального возраста, что, очевидно, связано со сравнительно благоприятными условиями и отсутствием многих причин гибели в естественных условиях. Максимальное различие выявлено для Phaeognathus hubrichti: 11 и 36 лет соответственно. Для сравнения: у остальных хвостатых амфибий (не плетодонтид) максимальный возраст, выявленный скелетохронологией, составил 32 года (у Ambystoma maculatum – Flageole, Leclair, 1992). При этом у некоторых безлегочных саламандр, например у Gyrinophilus porphyriticus (Bruce, Castanet, 2006), LAGs плохо различимы, что, по мнению авторов, происходит прежде всего из-за отсутствия выраженной сезонности в местообитаниях этого вида, населяющего подземные пустоты по берегам ручьев и небольших рек.

Согласно обзору Ульриха Зинша (Sinsch, 2015), доля особей с правильно определённым возрастом составила 86% (от 29 до 100%), но только при условии, что известный заранее возраст у бесхвостых и хвостатых амфибий был не более 7 лет. При увеличении известного возраста до 13 лет доля таких особей снижается вплоть до нуля.

Начиная с публикаций Зинша (Sinsch, 2015), а также Клевезаль и Смириной (2016) за последние годы появилось еще несколько обзоров по методикам и результатам определения возраста у амфибий и рептилий. Согласно данным, приводимым авторами этих обзоров, степень изученности различных групп остается низкой: 3.3% видов у амфибий (Peng et al., 2022) и всего около 2% видов у рептилий (Szekely et al., 2024). Вместе с тем, такой, на первый взгляд несколько формализованный подход к оценке степени охвата методикой скелетохронологии, в целом полезен, поскольку дает представление об уровне изученности различных семейств, континентов или стран. Особую ценность представляют собой опубликованные (в качестве приложений) базы первичных данных, использованных в этих работах (Peng et al., 2022; Zhang et al., 2024; Szekely et al., 2024). К сожалению, в таких базах данных отсутствуют многие русскоязычные публикации. В целом, от более ранних к более поздним обзорам наблюдается тенденция появления все большего числа доводов в пользу оптимальности метода скелетохронологии, в сравнении с другими методиками определения индивидуального возраста.

ОБЩЕЕ ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В заключение следует рассмотреть основные проблемы, которые все еще не решены в рамках использования методики и ее теоретической основы. Несмотря на наличие LAGs у зимующих личинок хвостатых амфибий, не обнаружено таковых у личинок бесхвостых. Такое отсутствие LAGs известно у зимующих головастиков двух видов: Lithobates catesbeianus (Khonsue, Matsui, 2001) и Grandirana rugosa (Khonsue et al., 2001). В редких случаях LAGs могут отсутствовать и у взрослых особей (хотя бы у части) видов из местообитаний с жарким климатом, например у Rana saharica (Esteban et al., 1999): LAGs не были найдены ни у сеголеток, ни у взрослых особей, и такие случаи тоже пока не объяснимы.

Неясным остается также то, насколько сильно различаются относительные размеры LAGs, соответствующих одним и тем же зимовкам, в различных трубчатых костях одних и тех же особей. И соответственно – насколько будут различаться результаты ретроспективных оценок длины тела при использовании промеров LAGs различных костей одной и той же особи.

Некоторые более общие проблемы, связанные с формированием ростовых слоев и LAGs, рассмотрены в статье Скучаса и Колчанова (2024).

Перспективные направления дальнейших исследований. Согласно нашим представлениям, это, во-первых, микрокомпьютерная томография с помощью синхротрона (phase contrast X-ray synchrotron microtomography, PPC-SRμCT). Ранее было показано, что число и форма LAGs на срезах плечевой кости Desmognathus точно соответствует картине, полученной с помощью микрокомпьютерной томографии той же кости (Sanchez et al., 2012, Fig. 3). Однако, насколько можно судить по литературе, кроме данных авторов по этому одному виду, микрокомпьютерную томографию не применяли для визуализации LAGs и исследования других видов современных амфибий и рептилий (обзор см. Matthews, Plessis, 2016).

Во-вторых, очевидна необходимость одновременного исследования вместе с ростом (т. е. с изучением LAGs) и других характеристик (аспектов) жизненного цикла, прежде всего – репродуктивных характеристик (обзор см. Ляпков, 2021), а также выживаемости на различных стадиях постметаморфозного периода.

В итоге, скелетохронологию, несмотря на все недостатки, следует считать наиболее эффективной методикой, позволяющей не только определять индивидуальный возраст амфибий и рептилий, но и производить ретроспективную оценку размеров животных и особенностей их роста, а также получать необходимые данные для многих других аспектов демографии и популяционной экологии.

БЛАГОДАРНОСТИ

Особая благодарность Э. М. Смириной, которая 46 лет назад помогла мне освоить основы метода скелетохронологии и любезно консультировала меня все эти годы. Я благодарен Е. С. Ройтбергу и Д. А. Шабанову за содержательное обсуждение с ними разнообразных аспектов применения методики скелетохронологии. Благодарю также анонимного рецензента и П. П. Скучаса (Санкт-Петербургский государственный университет) за ценные замечания.

ФИНАНСИРОВАНИЕ РАБОТЫ

Работа выполнена в рамках госзадания 04-1-21 № 121031600198-2.

СОБЛЮДЕНИЕ ЭТИЧЕСКИХ СТАНДАРТОВ

В данной работе отсутствуют исследования человека или животных, соответствующих критериям Директивы 2010/63/EU.

КОНФЛИКТ ИНТЕРЕСОВ

Автор данной работы заявляет, что у него нет конфликта интересов.

¹ Первоначально «регистрирующими структурами» называли те части организмов, в которых в процессе роста формируются элементы (слои, зоны и т. п.), сохраняющиеся на протяжении длительного периода (Мина, Клевезаль, 1970). Примерами могут служить раковины моллюсков, чешуя и отолиты рыб, периостальная кость и дентин зубов млекопитающих. Однако позднее этот термин стали использовать для обозначения отдельных элементов, обычно ростовых слоев, и именно в этом значении термин используется в настоящей статье.

About the authors

S. M. Lyapkov

Author for correspondence.
Email: lyapkov@mail.ru

Biological Faculty

References

Supplementary files

Supplementary Files

Action

1. JATS XML

Download

2. Fig. 1. An example of additional LAGs on a section of the shin bone (4 such lines are marked with arrows with a question mark), which may be indistinguishable from LAGs corresponding to wintering (marked with arrows): a two-year-old lake frog from the Kamchatka population with a long period of activity during the annual cycle. The length of the segment is 1 mm.

Download (159KB)

Indexing metadata

3. Fig. 2. Examples of fast (A) and slow (B) growth, estimated by the relative distance between LAGs. Sections of the tibia of sharp–faced frogs from the populations of: A – Bryansk forest, mature male, body length 64 mm, 2 wintering grounds and B - Yugana, mature female, body length 58 mm, 9 wintering grounds. For a description of the populations, see Lyapkov, 2021. The length of the segment is 1 mm.

Download (374KB)

Indexing metadata