Долгосрочная память трипсов Thrips tabaci (Thysanoptera, Thripidae)

Полный текст

Микронасекомые – это насекомые, размер которых не превышает двух миллиметров. Они обладают набором уникальных качеств, позволяющих им при столь малых размерах не терять способность успешно выживать и размножаться. Несмотря на значительные перестройки нервной системы, они демонстрируют полный набор обычных форм поведения, таких как полет, поиск половых партнеров и хозяев (Pfeffer, Wolf, 2020), они способны к ассоциативному обучению (Farahani et al., 2014; Polilov et al., 2019) и формированию памяти (Woude et al., 2018). Исследование поведения микронасекомых позволяет приблизиться к расшифровке фундаментальных нейронных механизмов, позволяющих их нервной системе уменьшаться без потери когнитивных способностей.

Накопление информации через обучение на основе проб и ошибок приводит к образованию истинного условного рефлекса (Мазохин-Поршняков, 1975). Эта способность к ассоциативному обучению и наличие памяти помогают животным адаптироваться к постоянно меняющимся условиям среды и, следовательно, значительно повышают выживаемость организма и его плодовитость (Dukas, Duan, 2000). У насекомых формируются два основных типа памяти, различающиеся по длительности и устойчивости – кратковременная и консолидированная (Tully et al., 1994).

Выделяют два типа консолидированной памяти – устойчивую к шоку (или устойчивую к анестезии (Журавлев и др., 2015)) и долгосрочную (Isabel et al., 2004). При формировании устойчивой к шоку памяти не задействуются механизмы синтеза белков (Lagasse et al., 2012; Tully et al., 1994), однако формируются структурные и функциональные изменения в цитоскелете нейронов, которые изменяют проводимость клеточной мембраны и возбудимость нейрона (Kotoula et al., 2017). Процесс формирования долгосрочной памяти требует синтеза новых белков (Montarolo et al., 1986). При этом через четыре часа после эксперимента память задействует только механизмы транскрипции генов, а через сутки после обучения память зависит как от транскрипции, так и трансляции белков, что было показано на медоносной пчеле (Villar et al., 2020).

Механизмы долгосрочной и устойчивой к шоку памяти антагонистичны – при усилении одной из них другая становится менее производительной (Lagasse et al., 2012), поэтому условия их формирования различаются и зависят от силы стимула, биологии вида и частоты встречающегося стимула. Так, стимулы, встретившиеся насекомому в нескольких разных, то есть независимых ситуациях, важнее, чем стимул, встретившийся лишь один раз. Поэтому лишь для запоминания важных стимулов имеет смысл запускать сложный механизм экспрессии генов и формировать долговременную память (Isabel et al., 2004).

Thrips tabaci (Thysanoptera, Thripidae) – широко распространенное растительноядное насекомое с неполным превращением, размером до 1.5 мм, жизненный цикл которого занимает в среднем 19 дней (Clausen, 1978). Ранее были описаны способности T. tabaci к ассоциативному обучению и сохранению следов памяти вплоть до часа после обучения (Федорова и др., 2022). В данном исследовании было доказано, что увеличение числа попыток обучения (см. раздел Методика) усиливает следы памяти, а разнесение сеансов обучения во времени позволяет насекомым консолидировать кратковременную память в устойчивую к шоку или долговременную.

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ

Объект исследования – имаго Thrips tabaci Lindeman 1889 (Thysanoptera, Thripidae). Сбор материала и эксперименты были проведены на Звенигородской биологической станции имени С.Н. Скадовского в июле 2021 и 2022 гг. Трипсы были собраны на таволге вязолистной (Filipendula ulmaria, Rosaceae).

Для проведения ассоциативного обучения и тестов памяти использовали универсальную термоарену для микронасекомых. Устройство термоарены было описано в предыдущих работах, посвященных обучению и памяти трипсов и трихограммы (Федорова и др., 2022, 2023). Насекомое помещали на арену, температура которой достигала 37±0.5°C, что вызывало реакцию избегания. Температура комфортного участка составляла 25±1°C. Рисунок на светодиодном экране вокруг арены состоял из вертикальных полос (зрительный ориентир) и горизонтальных полос, обеспечивающих равномерное освещение. Зрительный ориентир в экспериментах с тестовой группой совпадал с комфортным участком, за счет чего насекомые могли находить его, ориентируясь по рисунку на экране. Для насекомых из контрольной группы зрительный ориентир и местоположение комфортного участка переключали случайным образом, что делало невозможным формирование ассоциативной связи.

Схема эксперимента

Проводили два эксперимента. В первом применяли методику, использованную ранее в наших экспериментах по изучению памяти миниатюрных насекомых (Федорова и др., 2022, 2023). Эксперимент состоял из предварительного теста (T_предв.), одного сеанса обучения, который включал 10 попыток обучения, и тестов на память спустя 4 (Т₄) и 24 ч после обучения (Т₂₄). Предварительный тест и тесты памяти проходили идентично – на арене отсутствовал участок с комфортной температурой, но зрительный ориентир был включен и находился на протяжении каждого теста в одном случайном положении. Длительность тестов составляла 1 мин. После T_предв. начинался сеанс обучения, который состоял из 10 попыток. Каждая попытка состояла из этапа поиска комфортного участка, минуты отдыха на этом участке и переключения комфортного участка и зрительного ориентира в другое случайно выбранное положение. По прошествии 10 попыток, сеанс обучения завершался, и насекомое перемещали в пробирку объемом 2 мл вместе с соцветиями кормовых растений и фильтровальной бумагой, пропитанной водой. Далее насекомых делили на две группы – половина проходила тестирование памяти через 4 ч (Т₄), другая половина – через 24 ч (Т₂₄). Напомним, что тестирования проходили при выключенных комфортных участках.

Второй эксперимент был изменен таким образом, чтобы улучшить сохранение следов памяти через 24 часа после обучения. Через час после первого сеанса обучения, состоящего из 10 попыток, проводили второй, включающий 7 попыток. Через 24 ч после второго сеанса обучения проводили тест на память (Т₂₄).

Регистрация и анализ данных

Передвижение насекомых было зафиксировано на цифровую камеру Moticam 3. С помощью программы Tracker 5.0.5 (https://physlets.org/tracker) были получены координаты траекторий движения. По координатам была рассчитана длина пути при поиске комфортного участка, а также доля времени, проведенного в каждом из четырех секторов в тестах памяти (Т_предв., Т₄ и Т₂₄).

В тестах памяти оценивали долю времени в целевом секторе и индекс обучения. Целевой сектор – это та четверть арены, которая соответствует зрительному ориентиру на экране. Индекс обучения рассчитывали как отношение разности между временем в целевом секторе и временем в противоположном секторе к общему времени в этих двух секторах. Время в секторах, расположенных по бокам от целевого, в индексе обучения не учитывается.

Эти показатели оценивали в трех тестах. Первый тест был предварительным (Т_предв.). Второй тест проводили через 4 часа после обучения (Т₄). Третий тест проводили через 24 часа после обучения (Т₂₄).

Статистический анализ был выполнен в программе STATISTICA 12 (t-test). При проведении множественных попарных сравнений применялась поправка Бонферрони.

РЕЗУЛЬТАТЫ

Эксперимент 1, с одним сеансом обучения (рис. 1А, 2А)

 

Рис. 1. Доля времени (%), проведенного T. tabaci в целевом секторе в каждом из тестов (M±SE) в эксперименте с одним сеансом обучения (А) и эксперименте с двумя сеансами обучения (Б). Т_предв. – предварительный тест, Т₄ – через 4 ч после обучения, Т₂₄ – через 24 ч. t-test: * p < 0.05, ** p < 0.01. В основании каждого столбца – число изученных насекомых

 

Рис. 2. Индекс обучения (отношение разности между временем в целевом секторе и временем в противоположном секторе к общему времени в этих двух секторах) T. tabaci в каждом из тестов (M±SE) в эксперименте с одним сеансом обучения (А) и эксперименте с двумя сеансами обучения (Б). Т_предв. – предварительный тест, Т₄ – через 4 ч после обучения, Т₂₄ – через 24 ч. t-test: * p < 0.05, ** p < 0.01

 

В предварительном тесте (Т_предв.) нет различий между тестовой и контрольной группами, особи проводят сравнимое количество времени во всех секторах арены. Процент времени (рис. 1А), проведенного в целевом секторе через 4 ч (Т₄) после обучения, у тестовой и контрольной групп достоверно различается (t-test, df = 38, F = 4.601, t = 2.812, p = 0.008), как и индекс обучения (рис. 2А) (t-test, df = 38, F = 1.139, t = –2.964, p = 0.005). В эксперименте с одним сеансом обучения не наблюдается различий между тестовой и контрольной группами через 24 ч (Т₂₄) после обучения.

Эксперимент 2, с двумя сеансами обучения (рис. 1Б, 2Б)

В предварительном тесте (Т_предв.) нет различий между тестовой и контрольной группами.

Через 24 ч (Т₂₄) после обучения процент времени (t-test, df = 30, F = 2.648, t = 2.680, p = 0.012) (рис. 1Б) и индекс обучения (t-test, df = 30, F = 1.878, t = 2.710, p = 0.011) (рис. 2Б) достоверно различаются у тестовой и контрольной групп.

Итак, особи, прошедшие два сеанса обучения (рис. 1Б и рис. 2Б), проводили в целевом секторе достоверно больше времени, чем контрольные, что доказывает сохранение памяти в течение 24 ч.

ОБСУЖДЕНИЕ

У некоторых насекомых долгосрочная память, в отличие от памяти, устойчивой к шоку, может формироваться, только если воздействие стимулами разнесено во времени (Tully et al., 1994). На дрозофилах при помощи ольфакторного обучения было показано, что после 10 повторений, следующих непрерывно одно за другим, память сохранялась на протяжении трех дней, так же, как и после единичного повторения. Однако, когда между сеансами обучения были добавлены интервалы в 15 мин, память сохранялась на протяжении как минимум семи дней (Tully et al., 1994).

В экспериментах с ольфакторным обучением на муравьях, пчелах и мухах долгосрочная память формировалась уже после одной попытки обучения (Piqueret et al., 2019; Villar et al., 2020; Yu et al., 2022), однако было показано, что увеличение числа попыток обучения, разнесенных во времени, приводило к улучшению памяти (Yu et al., 2022). Сверчкам (Matsumoto, Mizunami, 2002) и тараканам (Sakura, Mizunami, 2001; Watanabe et al., 2003) было достаточно 2–3 попыток обучения, разнесенных во времени, чтобы вызвать сохранение памяти в течение 4 дней. Однако для многих насекомых, в связи с их экологией, память при обучении на ольфакторные стимулы может оказаться более устойчивой из-за большей значимости этих стимулов для насекомого, поэтому при использовании других типов обучения понадобится большее число попыток.

С помощью термической арены успешно исследовали способности к обучению у дрозофил (Foucaud et al., 2010; Ofstad et al., 2011) и пчел (Scheiner et al., 2020). Эксперименты проводили по схеме, аналогичной схеме нашего эксперимента, но без разнесения попыток обучения во времени. В одном из исследований проводили тесты памяти, показавшие сохранение ее следов спустя 8 ч (Ofstad et al., 2011).

В предыдущих исследованиях памяти трипсов было выявлено наличие следов памяти через час после эксперимента, однако отсутствовали следы памяти спустя 24 ч (Федорова и др., 2022). Обучение в этом случае состояло из одного сеанса, т.е. из 10 попыток, следующих одна за другой.

Настоящий эксперимент предусматривал разнесение сеансов во времени. Трипсы, которые проходили два сеанса, разнесенных во времени, помнили зрительные ориентиры, позволяющие избегать перегрева, по меньшей мере в течение суток после обучения. Полученные данные подтверждают гипотезу о том, что увеличение количества повторений и добавление временны́х интервалов между ними улучшают сохранение следов памяти. Полученные нами данные подтверждают высказанное ранее другими авторами (Isabel et al., 2004) мнение о том, что в природе для организма невыгодно тратить ресурсы на консолидацию, если животное сталкивается со стимулом лишь однажды. Консолидация требуется лишь когда столкновение со стимулом происходит в разных условиях, в данном случае – в разное время.

В данном исследовании мы наблюдаем наличие консолидированных форм памяти. Мы не можем определить, какая именно это память – устойчивая к шоку или долгосрочная, так как это потребовало бы блокировки генов radish (Folkers et al., 1993), NOS1 (Takahashi et al., 2009) и других. Другой способ определить тип памяти – добавить в углеводный корм одной из экспериментальных групп ингибитор синтеза белков циклогексимид (Lagasse et al., 2009), что, вероятно, станет следующим этапом исследования физиологии памяти миниатюрных насекомых.

Устойчивая к шоку память успешно формируется без разнесения попыток обучения во времени, в отличие от долгосрочной памяти (Tully et al., 1994). Таким образом, память трипсов через 4 ч предположительно можно отнести к памяти, устойчивой к шоку, а память спустя 24 ч – к долговременной.

ФИНАНСИРОВАНИЕ РАБОТЫ

Работа выполнена при финансовой поддержке Российского научного фонда (№ 22-74-10008).

СОБЛЮДЕНИЕ ЭТИЧЕСКИХ СТАНДАРТОВ

В данной работе отсутствуют исследования человека или животных, соответствующих критериям Директивы 2010/63/EU.

КОНФЛИКТ ИНТЕРЕСОВ

Авторы данной работы заявляют, что у них нет конфликта интересов.

Об авторах

М. А. Федорова

Московский государственный университет имени М.В. Ломоносова

Автор, ответственный за переписку.
Email: mariafedorova1997@gmail.com
Россия, Москва

С. Э. Фарисенков

Московский государственный университет имени М.В. Ломоносова

Email: mariafedorova1997@gmail.com
Россия, Москва

А. А. Полилов

Московский государственный университет имени М.В. Ломоносова

Email: mariafedorova1997@gmail.com
Россия, Москва

Список литературы

Дополнительные файлы