Genetic lineages of Parisotoma notabilis sensu lato (Hexapoda, Collembola) and their use in biological monitoring

Full Text

Биологический мониторинг имеет значение для отслеживания, с одной стороны, трендов изменения биоты под влиянием глобальных процессов, подобных потеплению климата, с другой – локальных антропогенных воздействий на окружающую среду (Spellerberg, 2005). Один из основных показателей “здоровья” среды (Frumkin, 2016) – биологическое разнообразие – нередко сложен для оценки из-за слабой таксономической изученности той или иной группы. Это в значительной степени касается почвенных животных, участвующих в создании почвенного плодородия, разнообразие которых, по мнению специалистов, описано приблизительно наполовину у клещей, менее чем на одну пятую часть – у ногохвосток, на четверть – у дождевых червей и т.д. (Orgiazzi et al., 2016). Это связано не только со слабой изученностью почвенной биоты во многих регионах мира (Phillips et al., 2019; Potapov et al., 2023), но и с криптическим разнообразием даже самых обычных видов коллембол (Porco et al., 2012), клещей (Schäffer et al., 2019; Pfingstl et al., 2021), дождевых червей (Shekhovtsov et al., 2019) и других таксонов.

Едва ли не единственным способом оценить разнообразие почвенной биоты в связи с большим количеством неописанных таксонов и криптических видов на сегодня является метабаркодинг (Yang et al., 2014; Orgiazzi et al., 2015; Dopheide et al., 2019; Geisen, 2021). Этот подход предложено использовать и в целях мониторинга (Deiner et al., 2017; Fernandes et al., 2018), в том числе разнообразия почвенных животных (Taberlet et al., 2012; Ji et al., 2013). Действительно, метабаркодинг позволяет выяснить число так называемых операционных таксономических единиц (OTU), хотя далеко не все из них удается соотнести с известными видами. Среди описанных на сегодня более 9 тыс. видов коллембол в базе GenBank приведены данные лишь для 735, а в базе Bold – 733 видов. Всего в обеих базах содержатся данные о 1001 виде (случаи определений до рода, а также подвиды не учитывали).

Несмотря на дефицит таксономических данных, мониторинг разнообразия почвенной биоты можно проводить даже по OTU с помощью метабаркодинга. Однако при всей важности показателей разнообразия, полученных тем или иным способом, их интерпретация для оценки состояния среды далеко не очевидна. Согласно гипотезе промежуточного нарушения, наибольшее разнообразие наблюдается именно при слабых и средних воздействиях нарушающих факторов (Connell, 1978), что было отмечено для многих групп организмов, включая почвенных животных (Connell et al., 1997; Кузнецова, 2005; McKinney, 2008).

Другим направлением использования генетических методов в оценке состояния среды может стать мониторинг генетического состава популяций полиморфных модельных видов. Особенно хорошо для этой цели подходят экотипы — группы особей внутри вида с наследственно закрепленными адаптациями к определенным факторам среды (Turesson, 1922), включая различные ресурсы (Linhart, Grant, 1996). Такие адаптации могут различать популяции одного вида, но могут наблюдаться и внутри одной популяции. По сути, экотипы отражают процесс расхождения по экологическим нишам, на внутривидовом уровне. Дифференциация может проявляться морфологически или может быть скрытой и распознаваемой только на физиологическом или генетическом уровнях (Bahrndorff et al., 2009; Шеховцов и др., 2020). Сохранение разнообразия экотипов редких видов считается важным для их выживания (Stronen et al., 2022).

Генетические линии, особенно если удается показать, что они представляют собой экотипы, могут быть полезны в мониторинге для ранней диагностики внешне не всегда очевидных изменений в почвенной среде. Тесная связь микроартропод с почвой позволяет успешно использовать их в биоиндикации различных нарушений среды (Culliney, 2013; Menta, Remelli, 2020). Генетические линии почвенных членистоногих, приуроченные к различным местообитаниям, обнаружены как для амфимиктических видов, например, ногохвостки Lepidocyrtus lanuginosus (Gmelin 1788) (Zhang et al., 2018), так и для партеногенетических видов, например, клеща Oppiella nova (Oudemans 1902) (Saltzwedel et al., 2014). Именно партеногенетические виды обычно обеспечивают основную численность населения коллембол в различных местообитаниях (Чернова и др., 2009). К таким видам относится и ногохвостка Parisotoma notabilis (Schäffer 1896). Этот вид имеет космополитическое распространение, но особенно многочислен в различных природных и антропогенных местообитаниях на территории Европы (Potapov, 2001). Для P. notabilis известно по меньшей мере шесть генетических линий, обычно выделяемых по генам COI и 28S (Porco et al., 2012a; Saltzwedel et al., 2017; Striuchkova et al., 2022). Генетические различия между линиями (15–18%; Saltzwedel et al., 2017) близки к уровню межвидовой дивергенции: 16–25% по гену COI (Sun et al., 2018). Это стало поводом рассматривать их как вероятный комплекс криптических видов P. notabilis sensu lato. Однако видовой статус этим линиям пока не придают, поскольку морфологические различия между ними остаются малоизученными.

Популяции P. notabilis s. l. в Московском регионе обычно состоят из представителей 2–3 линий (Striuchkova et al., 2022). Линии L2 и L4-Hebert предпочитают естественные леса, L1 – газоны, а в лесопарках встречаются все три линии (Striuchkova, 2023). Эта дифференцировка генетических линий P. notabilis в градиенте урбанизации дает возможность использовать этот комплекс в биологическом мониторинге антропогенных нарушений среды. При этом нет необходимости владения таксономией коллембол, достаточно выделять один повсеместно распространенный вид, хорошо отличающийся от других, по крайней мере, в Европе. Однако такой мониторинг возможен лишь в районах симпатрии (совместного обитания) двух или более линий P. notabilis, а также при подтверждении их биотопической специализации за пределами Московского региона. Нельзя исключать, что симпатрия линий ограничена этим регионом и связана с локальным заносом линий с других территорий, что нередко отмечается для ногохвосток (Шарин, 2004; Potapov et al., 2021). Эти сомнения связаны с тем, что, например, в Западной Европе отмечали в основном парапатрическое распределение линий, т.е. их географическое разделение (Porco et al., 2012a; Saltzwedel et al., 2017).

В задачи работы входило выяснение двух вопросов: 1. Насколько широко распространена симпатрия линий P. notabilis s. l. в европейской части России? 2. Насколько подтверждается их дифференциация по местообитаниям, в т.ч. в различных природных зонах?

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Отбор проб. Исследования проводили в удаленных друг от друга более чем на 2000 км регионах: на севере европейской части России в зоне бореальных лесов Карелии, на юге в зоне степей Ставропольского края. Центральная часть широтного градиента расположена в смешанных лесах Московского региона (рис. 1).

Рис. 1. Районы исследования

Дифференцировку линий P. notabilis в различных по нарушенности местообитаниях изучали на примере урбанизации: на газонах внутри городской застройки, в лесопарках и естественных лесах. В каждой природной зоне выбрали по два набора таких существенно различающихся местообитаний (рис. 2).

Рис. 2. Схема отбора проб. Наборы данных: квадрат – 1, кружок – 2; номера соответствуют номерам в табл. 1

В Карелии пробы были взяты в зеленомошных сосняках. Опубликованные ранее данные по Московскому региону (Striuchkova, 2023) в этой работе были дополнены материалом из смешанного леса. В степной зоне природный буковый лес находился на территории природного заказника на горе Стрижамент. Городские лесопарки отличаются от природных лесов наличием асфальтовых дорожек и троп, мест для отдыха, повышенным загрязнением от предприятий и транспорта, замусоренностью. Газоны – полуискусственные местообитания на урбаноземах, для которых характерны завоз грунтов, посев газонных трав, их кошение, обычно засоление от антигололедных реагентов. Газоны и лесопарки в черте города находятся в условиях повышенного загрязнения промышленностью и автотранспортом, а также бытовым мусором.

В каждом местообитании с нескольких участков отбирали смешанную пробу верхнего слоя почвы объемом 2 л. Характеристики проб представлены в табл. 1. Выгонку коллембол проводили на воронках Тулльгрена в 96% спирт. Особи P. notabilis выбирали под бинокулярным микроскопом. Всего было проанализировано 152 особи P. notabilis из 19 проб.

Таблица 1. Характеристика материала

Примечания. МО – Московская обл. N – количество особей.

* Информация об остальных пробах представлена в Striuchkova (2023).

Экстракция ДНК и ПЦР. Для предлагаемого мониторинга достаточно просто различать генетические линии. Разделение уже известных линий P. notabilis одинаково успешно можно проводить как по митохондриальному гену СОI, так и по рибосомальному 28S (Porco et al., 2012a; Saltzwedel et al., 2017; Striuchkova et al., 2022). Поскольку выход успешных ПЦР продуктов обычно выше по гену 28S, мы ограничились его использованием. ДНК экстрагировали из отдельных особей с использованием набора Phire tissue direct PCR master mix (Thermo Scientifiс) в соответствии с протоколом Dilution & Storage производителя. Данная методика позволяет выделять ДНК при сравнительно малом повреждении исходного материала, поэтому после выделения образцы извлекались и сохранялись. Все реакции ПЦР для секвенирования проводили в объемах 20 мкл, содержащих 10 мкл Phire Tissue Direct PCR Master Mix (Thermo Scientifiс) с 1 мкл каждого праймера (4 пМ), 1 мкл матричной ДНК и 7 мкл nuclease-free Water. D3-D5 регион 28S рДНК амплифицировали с использованием праймеров 28Sa 5’-GAC CCG TCT TGA AGC ACG-3’ и 28Sbout 5’-CCC ACA GCG CCA GTT CTG CTT ACC-3’ (Whiting, 2002; Prendini et al., 2005). Амплификация состояла из одной начальной стадии активации при 98°C в течение 5 мин, затем 30 циклов амплификации: денатурация при 98°C в течение 5 с, отжиг праймеров при 57°C в течение 5 с, элонгация при 72°C в течение 20 с и заключительный этап элонгации при 72°C в течение 1 мин. Результат ПЦР оценивали с помощью проведения электрофореза в агарозном геле с бромистым этидием. ПЦР-продукты очищали с помощью смеси ферментов экзонуклеазы I (Exo I) и рекомбинантной щелочной фосфатазы (rSAP) согласно протоколу очистки продукта ПЦР перед секвенированием (Thermo Scientifiс). Высушивали с прямым и обратным праймером, секвенирование было выполнено компанией Синтол.

Анализ данных. Полученные секвенограммы редактировали в программе Chromas Lite (версия 2.6.6). Последовательности выравнивали с использованием BioEdit (версия 7.2). В программе MEGA-11 (версия 11) выполняли построения древа по алгоритму Maximum Likelihood с параметрической моделью Jukes-Cantor и Gamma Distributed для разделения особей по линиям. Данные были выложены в GenBank (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/), коды указаны в табл. 1. Сравнение генетической структуры проб проводили с помощью точного критерия Фишера. Взаимосвязь между генетическими линиями и местообитаниями разной степени нарушенности визуализирована с помощью анализа избыточности (RDA) в пакете “packfor” в среде R (R Core Team. RStudio (version 4.2.1.). 2022. https://www.r-project.org/). Данные генотипирования размещены в GenBank. Карта с обозначением районов отбора проб выполнена с использованием Natural Earth II (бесплатные векторные и растровые картографические данные) (https://www.naturalearthdata.com/).

РЕЗУЛЬТАТЫ

Симпатрия генетических линий. По рибосомальному гену 28S в европейской части России обнаружено 4 генетические линии P. notabilis: L0, L1, L2 и L4-Hebert. В каждом из изученных районов от зоны бореальных лесов до зоны степей было показано совместное обитание трех генетических линий. В зонах степей и смешанных лесов все три линии были обнаружены в одной пробе. В бореальных лесах в одной пробе встречали до двух генетических линий, а три линии отмечали на расстоянии 400 м друг от друга. Линии L1 и L4-Hebert обнаружены во всех изученных регионах. Линия L0 найдена на территории европейской части России впервые и отмечена только в степной зоне, где L2, напротив, не обнаружена. Таким образом, в каждой из изученных природных зон обнаружено совместное обитание трех линий P. notabilis.

Дифференциация генетических линий в различных по нарушенности местообитаниях. В каждом регионе зонального градиента различные по нарушенности местообитания, как правило, различались по составу, а предварительно можно сказать, что и по соотношению генетических линий P. notabilis. В Карелии (зона бореальных лесов) в природных лесах и лесопарках были обнаружены линии L2 и L4-Hebert, на газонах – линии L1 и L4-Hebert (рис. 3).

Рис. 3. Распределение генетических линий в различных по нарушенности местообитаниях в зоне бореальных лесов. На столбцах указано количество особей

В Московском регионе (зона смешанных лесов) в лесах были найдены линии L2 и L4-Hebert, на газонах только линия L1, а в лесопарках – совместно три эти линии (рис. 4).

Рис. 4. Распределение генетических линий в различных по нарушенности местообитаниях в зоне смешанных лесов. На столбцах указано количество особей

В Ставропольском крае (зона степей) в лесах на г. Стрижамент были выявлены линии L0, L1 и L4-Hebert, в лесопарках – L1 и L4-Hebert, на газонах – только L1 (рис. 5).

Рис. 5. Распределение генетических линий в разных по нарушенности местообитаниях в зоне степей. На столбцах указано количество особей

Таким образом, линия L0 обнаружена пока только в лесах. Линии L2 и L4-Hebert обитают в лесах и слабонарушенных местообитаниях (лесопарки), при этом L4-Hebert более толерантна к нарушениям, чем L2. Линия L1 встречается на городских газонах с высокой степенью антропогенной нагрузки. Несмотря на небольшую выборку, полученные результаты устойчиво воспроизводились в различных районах исследования. Расчет точного критерия Фишера подтвердил различия в распределении линий по местообитаниям во всех природных зонах на уровне p < 0.01, кроме набора данных 2 для зоны степей (p = 0.011). Анализ избыточности (RDA) показал, что встречаемость линии L1 существенно отличается от встречаемости остальных, достоверно коррелируя с фактором “газон” (рис. 6).

Рис. 6. Сравнение генетического состава популяций P. notabilis в лесах, лесопарках и на городских газонах по анализу избыточности (RDAs)

ОБСУЖДЕНИЕ

Симпатрия генетических линий. Совместное обитание генетических линий P. notabilis, обнаруженное нами в различных природных зонах европейской части России, позволяет предположить, что симпатрия разных линий этого вида, вероятно, обычное явление для Восточной Европы. Совместная встречаемость линий была ранее обнаружена также в Эстонии (Anslan, Tedersoo, 2015). Кроме Восточной Европы, локальная симпатрия трех линий встречается в Канаде, что авторы рассматривали скорее как исключение и результат инвазии (Porco et al., 2012a). Однако проведенный нами самостоятельный анализ последних данных базы GenBank по Северной Америке также показал симпатрию в большинстве исследованных районов Канады: Онтарио, Британской Колумбии, о-ва Ньюфаундленд и о-ва Кейп-Бретон. В этих районах различные линии отмечены как в одной пробе, так и на расстоянии нескольких километров друг от друга. Таким образом, симпатрия линий – по-видимому, более обычное явление, чем их парапатрия.

При этом парапатрия за редким исключением характерна для Западной Европы (Porco et al., 2012a; Saltzwedel et al., 2017). Данные по Западной Европе касаются сборов в лиственных и хвойных лесах (Saltzwedel et al., 2017) либо местообитания не указаны (Porco et al., 2012a). Данные по нарушенным местообитаниям в Западной Европе показали 2 линии (L1 и L2) в Париже, но одну (L0) в Гамбурге. Таким образом, на сегодняшний день использование линий P. notabilis в биологическом мониторинге достаточно обосновано для территории Восточной Европы и Канады. В северной и восточной Азии (Сибирь, Дальний Восток России) P. notabilis довольно малочисленна, что ограничивает ее индикаторное значение.

Экологическая дифференциация генетических линий. Обнаруженное нами ранее распределение генетических линий P. notabilis по местообитаниям с разной степенью урбанизации (Striuchkova, 2023) подтверждено в данной работе для различных природных зон европейской части России. Несмотря на небольшую, двукратную, повторность пробных площадей в каждом типе местообитаний различных регионов, везде найдена сходная дифференцировка генетических линий.

Другие виды антропогенных нарушений, вероятно, также сопровождаются подобной дивергенцией линий. Наши предварительные данные по составу линий P. notabilis в местообитаниях открытого типа разной степени нарушенности (косимые луга, залежи и поля) подтверждают закономерности, выявленные ранее. На лугах были обнаружены в основном линии L2 и L4-Hebert, на залежах – L1 и L4-Hebert, а на полях – только линия L1 (Стрючкова, Кузнецова, 2023). Таким образом, для популяций наиболее нарушенных местообитаний (газоны и поля) характерна максимальная доля L1, в то время как в ненарушенных лесах и на косимых лугах эта линия практически отсутствует, а преобладающей на севере и в центре европейской части России становится L2. Хорошо выраженная биотопическая приуроченность дает основания считать, что, по крайней мере, специализированные линии L1 и L2 являются экотипами.

По оценкам молекулярных часов, дивергенция генетических линий P. notabilis произошла 11.5– 7.4 млн лет назад в миоцене (Saltzwedel et al., 2017). Генетическая линия L1, повсеместно обнаруживаемая сегодня в городах в условиях загрязнения тяжелыми металлами, засоления, избытка органического мусора и т.д., исходно могла возникнуть в связи с освоением различных местообитаний, формирующихся на ранних сукцессионных стадиях. В настоящее время P. notabilis довольно рано появляется в ходе природных сукцессий: зарастания песчаных отвалов, берегов рек, освобождения участков горных пород от ледников (Wanner, Dunger, 2002; Rusek, 2004; Антипова, Бабенко, 2023). Встречаемость P. notabilis в самых разных местообитаниях Европы велика, и, хотя данных по экологии вида очень много (Potapov, 2001; Fjellberg, 2007), неизвестно, какой именно линии или их совокупности эти данные касаются.

Морфологически, на данный момент, только для линии L1 обнаружены некоторые отличительные признаки (Потапов, 2022). Остальные линии P. notabilis пока остаются криптическими операционными таксономическими единицами (OTU), статус которых даже при больших генетических дистанциях не определен. Несмотря на запутанную таксономию P. notabilis s. l., это не мешает использовать его в мониторинге, поскольку вид повсеместно встречается и хорошо отличается от других европейских видов рода, а имеющие диагностическое значение линии успешно определяются генетически.

Сходные с нашими результаты были получены для Lepidocyrtus lanuginosus в центральной Европе (Zhang et al., 2018). Этот вид был разделен на три генетические линии: первая была многочисленной и встречалась в каждом из трех исследуемых мест обитания (леса, луга, пахотные поля), вторая – встречалась только в лесах, третья – только на лугах и пахотных полях. Аналогичная картина была показана и для панцирного клеща Oppiella nova: леса и луга заселены различными генетическими линиями, а переходные местообитания колонизированы линией, характерной как лесов, так и для лугов (Saltzwedel et al., 2014).

Возможности использования P. notabilis s. l. в биологическом мониторинге. Благодаря высокой численности и встречаемости P. notabilis в исследуемом районе обычно достаточно отобрать смешанную пробу подстилки и верхнего слоя почвы объемом 2 л с трех участков на расстоянии 50–100 м. По нашим предварительным данным, 15 особей должно быть достаточно для достоверного выявления не только состава, но и соотношения генетических линий по описанной выше методике. Появление линии L1 и тенденция к увеличению ее доли в природных лесах и лесопарках являются маркерами роста степени нарушенности этих местообитаний.

Таким образом, дивергенцию генетических линий повсеместно встречающейся ногохвостки P. notabilis s. l. можно использовать в биологическом мониторинге почвенной среды. Изменения в соотношении этих линий по данным многолетнего мониторинга можно интерпретировать как свидетельство сдвига положения экосистемы на шкале “норма – сильное нарушение” с позиций почвенной биоты.

БЛАГОДАРНОСТИ

Авторы благодарны А.И. Боковой, К.С. Паниной и М.Б. Потапову за помощь в отборе проб, а также М.Б. Потапову за оформление рисунков.

ФИНАНСИРОВАНИЕ РАБОТЫ

Работа выполнена при финансовой поддержке Российского научного фонда (РНФ), грант № 22-24-00984.

СОБЛЮДЕНИЕ ЭТИЧЕСКИХ СТАНДАРТОВ

В данной работе отсутствуют исследования животных, соответствующих критериям Директивы 2010/63/EU.

КОНФЛИКТ ИНТЕРЕСОВ

Авторы данной работы заявляют, что у них нет конфликта интересов.

About the authors

A. V. Stryuchkova

Email: astr2502@yandex.ru
Russian Federation, Moscow

N. А. Kuznetsova

Author for correspondence.
Email: mpnk@yandex.ru
Russian Federation, Moscow

References

Supplementary files

Supplementary Files

Action

1. JATS XML

Download

2. Fig. 1. Study areas

Download (271KB)

Indexing metadata

3. Fig. 2. Sampling scheme. Data sets: square - 1, circle - 2; numbers correspond to the numbers in Table 1

Download (127KB)

Indexing metadata

4. Fig. 3. Distribution of genetic lines in differently disturbed habitats in the boreal forest zone. Columns indicate the number of individuals

Download (72KB)

Indexing metadata

5. Fig. 4. Distribution of genetic lines in differently disturbed habitats in the mixed forest zone. Columns indicate the number of individuals

Download (73KB)

Indexing metadata

6. Fig. 5. Distribution of genetic lines in differently disturbed habitats in the steppe zone. Columns indicate the number of individuals

Download (71KB)

Indexing metadata

7. Fig. 6. Comparison of genetic composition of P. notabilis populations in forests, forest parks and urban lawns by redundancy analysis (RDAs)

Download (61KB)

Indexing metadata