Effect of Aminophenol and Amino Acids Derivatives on the Level of Nitrosyl Radical and Its Active Forms In Vitro

Full Text

ВВЕДЕНИЕ

Монооксид азота [оксид азота(II) или нитрозил-радикал ^•NO] в организме образуется в ходе как ферментативных (окисление L-аргинина, катализируемого NO-синтазами), так и неферментативных (диспропорционирование нитрита в кислой среде, pH < 6.0, и др.) процессов [1–3]. NO является внутри- и внеклеточным переносчиком, играет важную роль во многих физиологических процессах (нейротрансмиссия, регуляция артериального давления, иммунный и воспалительный ответ, и др.) [1–3].

Монооксид азота [E°′(^•NO/³NO^–) = −0.8 В, рН = 7.0; E°′(^•NO + H⁺)/¹HNO = −0.5 В, pH = 7.4; E°′(NO⁺/^•NO) = 1.45 В; E°(2^•NO, 2e^–, 2H⁺/N₂O, H₂O) = 1.59 В] обладает редокс-гибкостью, может выступать как донором, так и акцептором электрона в окислительно-восстановительных реакциях [4–7]. Нитрозил-радикал не способен инициировать отрыв атома Н от макромолекул и присоединяться по двойной связи, но активно взаимодействует со свободными радикалами, ионами переходных металлов (не- и гемовое железо, металлокомплексы) [3, 4, 7].

Монооксид азота в организме оказывает как анти-, так и прооксидантное действие [1, 2, 7–15]. Главным фактором, который определяет биологические эффекты NO, является его концентрация. В ходе процессов биорегуляции наблюдаются низкие концентрации NO (10^–9–10^–6 М.), однако при определенных условиях, например стимуляции макрофагов, уровень NO может значительно повышаться (>10^–6 М.) [7, 9, 11]. Чрезмерное образование NO связано со многими патологиями (ревматоидный артрит, астма, атеросклероз, воспаление, нейродегенерация) [1, 2, 14, 15].

Прооксидантное действие NO может проявляться как вследствие его прямого взаимодействия с биомишенями, так и косвенно, через активные формы, а именно оксид азота(IV) [E°′(^•NO₂/NO₂^–) = 0.99–1.1 В)] и оксид азота(III) [азотистый ангидрид, сесквиоксид азота, E°′(N₂O₃/^•NO, NO₂^–) = 0.8 В] [6–8, 10]. Диоксид азота способен вступать в различные реакции: отрыв атома Н от связи C–H, присоединение к связям C=C, перенос атома O, присоединение к свободным радикалам и перенос электрона [16]. Сесквиоксид азота является нитрозирующим агентом в аэрированных водных растворах монооксида азота [8, 9, 17]. Образование высших оксидов азота сопряжено с автоокислением NO. В водных растворах в присутствии молекулярного кислорода ([O₂] = 2.4·10^–4 М., рН = 7.4) ^•NO (раствoримость в вoде 1.8 мМ. при 25°С [18]) почти полностью превращается в нитрит-анион (HNO₂, pK_a = 3.37). Механизм превращения сложный, реализуется через протекание реакций (1–3), представленных на схеме 1 [6, 7, 19]. На первой стадии образуется ^•NO₂, который далее в обратимой реакции с ^•NO трансформируется в N₂O₃. В водной среде N₂O₃, в отсутствие других мишеней, гидролизуется с образованием NO₂^– [19].

 

2^•NO + O₂ → 2^•NO₂, k ~ (2.9–4.8)·10⁶ моль^–2·л·с^–1 (рН = 7.4), (1)

NO₂ + ^•NO ↔ N₂O₃, k_→ = 1.1·10⁹ моль^–1·л·с^–1, k_← = 8·10⁴ моль^–1·л·с^–1, (2)

N₂O₃ + H₂O → 2NO₂^– + 2Н⁺, k = (0.5–2)·10³ с^–1. (3)

Схема 1

 

Лимитирующей стадией образования NO₂^– является тримолекулярная реакция ^•NO с O₂ [уравнение (1)], которая имеет суммарный третий порядок (второй по [^•NO], первый по [О₂]). Скорость реакции автоокисления NO в водном растворе зависит от его концентрации [7, 19].

Окисление и нитрозирование различных веществ в аэробных условиях может происходить с участием NO, ^•NO₂ и N₂O₃, а также пероксинитрита ONOO^– [E°′(ONOO^–/^•NO₂, НО^–) = 1.2–1.6 В, рН = 7.0; ONOOH, pK_a = 6.8] [6], образующегося в реакции NO c супероксид анион-радикалом {E°′(O_2(aq)/O₂^•–) = –0.16 В [20]} [7, 9, 10]. Превалирование того или иного процесса будет определяться константами скоростей реакций, концентрацией реагентов и окружающими условиями. Активные формы азота (^•NO, ^•NO₂, N₂O₃, ONOO^–) способны вызывать дезаминирование аминокислот и оснований ДНК, образование нитрозотиолов (RSNO) и нитрозоаминов (R¹R²NNO), нитрование белков (остатков тирозина и триптофана), усиливать перекисное окисление липидов [1–3, 7, 8]. В конечном итоге активные формы азота опосредуют развитие как нитрозативного, так и окислительного стресса [1–3, 7–11], механизм которого будет определяться видом и концентрацией образующихся активных частиц, что в свою очередь определяется клеточной средой.

Подходы к элиминированию избытка активных форм азота и предотвращению нитрозативного стресса до конца не определены. Актуальным является изучение способности различных соединений регулировать уровень активных форм азота. Значимую роль в антиоксидантной системе организма играют аминокислоты (АК) и их производные [21]. Активность в отношении активных форм азота наиболее изучена для триптофана, тирозина и цистеина [21]. Метионин, фенилаланин, гистидин, лизин и аргинин модифицируются при действии пероксинитрита [8, 21, 22]. В работе [23] изучена NO-акцепторная активность аминокислот с разветвленной цепью (лейцин, валин, изолейцин). Интенсивно исследуется NO-активность пептидов, выделенных из белковых гидролизатов [24–26]. Несмотря на большой накопленный материал, детальный механизм вовлечения производных аминокислот в регулирование свободно-радикальных процессов с участием ^•NO остается открытым. С этой точки зрения, интересными объектами исследования являются дипептиды. Как известно [27, 28], они проявляют различную биологическую активность, включая антиоксидантную, и вследствие своих свойств (лучшее усваивание, чем у свободных аминокислот и белковых гидролизатов, способность проникать через биомембраны и гематоэнцефалический барьер) являются привлекательными терапевтическими средствами.

Среди антиоксидантов важное место занимают природные фенолы и их синтетические функционализированные производные [29–31]. Фенольные соединения обладают потенциалом регулировать уровень NO [32–36]. Такие функционализированные фенолы, как производные аминофенола, проявляют противораковую, антивирусную и антирадикальную активность [37–41], при этом их роль в регулировании процессов с участием активных форм азота исследована недостаточно.

Целью настоящей работы было изучение способности отдельных производных аминофенола и аминокислот регулировать уровень нитрозил-радикала и его активных форм (^•NO₂, N₂O₃) в водной аэробной среде, используя нитропруссид в качестве донора ^•NO.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Известно [42, 43], что нитропруссид натрия под воздействием света в водной среде (рН = 7.4) спонтанно разлагается с выделением NO. Нитрозил-радикал в аэробной среде окисляется до устойчивого метаболита, нитрит-аниона, через стадии образования промежуточных интермедиатов, как указано на схеме 1. Эффективность используемой тест-системы предварительно оценивали по известным акцепторам активных форм азота (NaN₃, пиперазин, дофамин, Н₂О₂, аскорбиновая кислота, 6-гидрокси-2,5,7,8-тетраметилхроман-2-карбоновая кислота) [44–50]. Полученные данные подтверждают то, что тест-система на основе нитропруссида натрия позволяет оценить общую активность соединения в отношении NO_х (^•NO, NO₂, N₂O₃) в физиологически значимых условиях. Концентрация NO₂^– в тест-системе в присутствии исследуемых соединений в сравнении с контрольной без добавок таковых выступает мерой их способности регулировать уровень NO_х.

На схеме 2 представлены структурные формулы исследованных функционализированных фенолов. Выбор производных 2-аминофенола обусловлен тем, что ранее в наших исследованиях установлена их противовирусная и антиоксидантная активность [39–41, 51]. Аминофенол 10 является активным действующим началом противогерпетического препарата Бутаминофен, выпускаемого РУП «Белмедпрепараты».

 

Схема 2

 

На рис. 1 представлены зависимости концентрации нитрит-аниона в тест-системе (в % от контроля) от концентрации тестируемого соединения [S], полученные для соединений 1–3, 7, тролокса и убихинона Q₀, не содержащего в отличие от фенольных соединений OH-групп. Как видно из данного рисунка, среди изомеров аминофенолы 2 и 1 обнаруживают большую или схожую NO_х-акцепторную активноcть в сравнении со стандартным тролоксом, величины их индекса IC₅₀ составляют 0.11, 0.195 и 0.19 мМ. соответственно. 4-Аминофенол уступает по эффективности другим изомерам, величина его IC₅₀ составила 0.31 мМ. Введение трет-бутильного заместителя в пара-положение к ОН-группе у 2-аминофенола незначительно изменило его активность, для соединения 7 IC₅₀ = 0.24 мМ. Для соединений 4, 5 и убихинона Q₀ получены схожие зависимости %, [NO₂^–]₀–[S], поэтому, чтобы не перегружать рис. 1, они не приводятся. В исследованном концентрационном диапазоне (0–3.0 мМ.) данные N-ацетилированные производные 2- и 4-аминофенола проявляют слабый эффект: при 3 мМ. снижают уровень NO₂^– на ~12–15% в сравнении с контролем.

 

Рис. 1. Накопление нитрит-аниона в тест-системе нитропруссид натрия–PSB (10/10 мМ., рН = 7.4) в присутствии функционализированных фенолов: 1 – 2, 2 – тролокс, 3 – 1, 4 – 3, 5 – 7, 6 – убихинон Q₀

 

На рис. 2 представлены результаты, полученные для стерически затрудненных аминофенолов и их производных, которые исследованы в более узком концентрационном диапазоне (0–0.15 мМ.) вследствие их ограниченной растворимости в водных системах. NO_x-Акцепторная активность данных соединений убывает в следующем ряду: 8 (IC₅₀ = 0.125 мМ.) > тролокс > 9 > 10 > 12 > 11 ≥ 13 ≥ 6 (ионол). Надо отметить, что соединение 12 в сравнении с аминофенолом 11 оказалось более эффективно только при увеличении его концентрации в системе. Метилирование гидроксильной группы в бензольном кольце фенолов 10 и 12 (см. продукты 11 и 13) приводило к снижению активности.

 

Рис. 2. Накопление нитрит-аниона в тест-системе нитропруссид натрия–PSB (10/50 мМ., рН = 7.4) в присутствии функционализированных фенолов: 1 – 8, 2 – тролокс, 3 – 9, 4 – 10, 5 – 12, 6 – 11, 7 – 6, 8 – 13

 

Согласно полученным данным, исследованные аминофенолы и их производные в физиологически значимых условиях способны реагировать с нитрозил-радикалом и его интермедиатами. Следствием такого взаимодействия может являться образование нитрозо- и нитропроизводных. Взаиморасположение NH₂- и OH-групп в бензольном кольце, наличие, положение и вид заместителей будут определять возможность С-, О- или N-нитрозирования (замещение атома Н в бензольном кольце, NH₂- и OH-группах).

Образование конечных продуктов при взаимодействии аминофенолов и NO_x может реализовываться через различные механизмы. Один из возможных путей – это нитрозирование с участием промежуточных радикальных интермедиатов. Фенольные соединения (АrОН) могут подвергаться одноэлектронному окислению диоксидом азота с образованием феноксильных радикалов (АrО^•) [50, 52]. Например, константа скорости реакции NO₂ с тирозином, гидрохиноном и тролоксом {E°(TхO^•,H⁺/TхOH) = 0.48 В [53]} составляет 2.9·10⁷, ~10⁸ и <10⁵ (рН = 6.6)–5·10⁸ (рН = 11.5) моль^–1·л·с^–1 соответственно [34, 54, 55]. Образование С-нитропроизводных дофамина при его взаимодействии с NO/О₂ объясняют возможностью формирования семихинон-радикала Q₀Н^• или Q₀^–• (рK радикала Q₀Н^• 5.9–6.45) [50, 56]. Последующее взаимодействие АrО^• с NO₂ и NO будет зависеть от структуры фенольного соединения и окружающих условий [50, 52, 57, 58].

С учетом свойств NO, окисление им фенольной ОН-группы с образованием АrО^• представляется затруднительным [52]. Однако в работе [59] констатируют взаимодействие NO со стерически затрудненными фенольными антиоксидантами и токоферолом с образованием АrО^•. Методом ЭПР показано, что в анаэробных условиях NO окисляет убихинолы Q₀H₂ и Q₂H₂ (k = 0.49·10⁴ и 1.6·10⁴ моль^–1·л·с^–1 соответственно) [34], а также 3,4-дигидроксифенилуксусную кислоту (но не дофамин) [60] с образованием семихинон-радикала и NO^–. Следует отметить, что проблемой подобных исследований является полное элиминирование O₂ и, следовательно, высших оксидов азота из системы [52].

В работе [32] NO-акцепторную способность различных гидрофильных антиоксидантов, включая кофейную кислоту и тролокс, объясняют реализацией окислительно-восстановительных процессов, а не свободнорадикального механизма.

Другой механизм нитрозирования функционализированных фенолов базируется на том, что данные соединения подвергаются электрофильной атаке нитрозирующим агентом, в частности N₂O₃, с образованием нитрозопроизводных, и последующем их окислении до нитросоединений [18, 56, 61].

Согласно полученным результатам все изомеры аминофенола 1–3 продемонстрировали способность снижать уровень NO_x. Следует полагать, учитывая отличия в структуре, что механизм их взаимодействия с NO, NO₂ и N₂O₃ будет различен. мета-Изомер аминофенола, который в отличие от орто- и пара-аминофенола не образует семихинон-радикалы, проявляет наибольший эффект. Для него характерна согласованная ориентация ОН- и NH₂-групп, активирующих электрофильное замещение в орто- и пара-положение бензольного кольца, что, очевидно, способствует С-нитрозированию. Для фенольных соединений показано [36, 61–63], что С-нитрозирование идет более активно в пара-положение к ОН-группе, чем в орто-положение, что, вероятно, обусловливает меньшую активность афминофенола 3 в сравнении с аминофенолом 1. В работе [36] для пирокатехина и гидрохинона детектировали продукты О- и С-нитрозирования, в то время как для резорцина только С-нитрозопродукты. Нельзя исключать возможность образования О-нитропродуктов для аминофенолов 1 и 3 через стадию образования семихинон-радикалов, что, конечно, требует дальнейших углубленных исследований.

Введение трет-бутильной группы в положение 4 аминофенола 1 не приводило к повышению его NO_х-акцепторной активности, однако наличие двух электронно-донорных групп в положениях 4 и 6 соединений 8 и 9 способстовало их эффективности. Согласно работе [64], алкилирование 2-аминофенола в положения 4 и 6 усиливало его способность акцептировать пероксильные радикалы.

Исходя из сравнения данных полученных для соединений 10–13, гидроксильная группа важна для NO_x-акцепторной активности аминофенола. Согласно работе [65], вератрол (О-метилированный пирокатехин) в отличие от пирокатехина не снижает уровень NO. Ацетилирование фенольных групп куркумина снижало его NO-акцепторную способность [66], хотя в работе [67] для куркумина и диацетилкуркумина не наблюдали значительной разницы. Следует отметить, что соединения 10 и 12 проявляют противовирусную активность, которая пропадает при метилировании ОН-группы [41, 68].

В аэробных условиях процессы, протекающие с аминофенолами могут быть более сложными. Соединения 1, 3 и их производные могут окисляться молекулярным кислородом с образованием семихинон-радикала и O₂^•–, который в присутствии NO трансформируется в ONOO^– (k = 1.9·10¹⁰ моль^–1·л·с^–1), как постулируют это для дофамина [8, 50, 56]. Пероксинитрит, в свою очередь, способен окислять исходные субстраты [6, 7].

Известно [69–71], что алифатические и ароматические амины подвергаются N-нитрозированию, в случае первичных алифатических аминов (RNH₂) это приводит к их дезаминированию. Нитрозирование аминов посредством NO происходит в присутствии O₂, в результате электрофильной атаки N₂O₃ [71], также вероятен радикальный механизм с участием ^•NO₂ [72]. Например, константа скорости реакции анилина и o-метиланилина с N₂O₃ равна соответственно 7.5·10⁸ и 4.8·10⁸ моль^–1·л·с^–1 [70].

В условиях нашего эксперимента аминофенолы с первичной NH₂-группой были более активны, чем N-замещенные производные. Наименьший эффект проявляют N-ацетилированные производные 4 и 5. Согласно работе [73], трансформацию соединения 5 в N-(4-гидрокси-2-нитрофенил)ацетамид при pH = 7.4 наблюдали при инкубации с пероксинитритом или миелопероксидазой/Н₂О₂/NaNO₂, однако в системах, основанных на таких донорах NO, как диэтиламин NONO-ат или спермин NONO-ат, данный продукт отсутствовал.

Слабый эффект убихинона Q₀ с увеличеснием его концентрации может быть обусловлен его взаимодействием с образующимся NO₂^–. В статье [74] показано, что электрохимически генерируемый о-бензохинон в водной среде (рН = 6.5) в реакции Михаэля реагирует с нитрит-анионом с образованием нитрокатехола.

В данной работе объектами исследования также были отдельные дипептиды (Tyr-Ala, Phen-Ala, β-Ala-His и Gly-Gly), содержащие остатки ароматических, гетероциклической и простейших аминокислот. На рис. 3 и 4 представлены результаты исследования влияния указанных дипептидов и составляющих их аминокислот на уровень NO_x в тест-системе. Наибольшей активностью из дипептидов обладает Tyr-Ala (IC₅₀ = 5 мМ.) и он сравним по действию с аскорбиновой кислотой (IC₅₀ = 4.88 мМ.), выбранной в качестве стандарта. Надо отметить, что с увеличением концентрации Tyr-Ala (>5 мМ.) его ингибирующий эффект не усиливался. Второй по эффективности был β-Ala-His (IC₅₀ = 35.0 мМ.). Остальные соединения сравнивали по их активности, которую они проявляют в концентрации 45 мМ., выбор которой определялся величиной IC₅₀ триптофана. При данной дозе Phen-Ala (IC₅₀ > 50 мМ.), Phen, α-Ala и Trp снижают уровень NO_x на 29, 23, 16 и 50% соответственно. Свободный Tyr не был исследован вследствие его плохой растворимости в водной среде при рН = 7.4. В концентрации 45 мМ. His (IC₅₀ = 48.5 мМ.) и β-Ala ингибировали накопление NO_x на 47.5 и 7.5% соответственно, Gly-Gly (IC₅₀ > 50 мМ.) и Gly – на 35 и 22.5% соответственно. Активность свободных аминокислот убывала в следующем ряду: Trp > Phen ≥ Gly > α-Ala > β-Ala.

 

Рис. 3. Накопление нитрит-аниона в тест-системе нитропруссид натрия–PSB (10/10 мМ., рН = 7.4) в присутствии: 1 – Tyr-Ala, 2 – Trp, 3 – Phen-Ala, 4 – Phen, 5 – α-Ala

 

Рис. 4. Накопление нитрит-аниона в тест-системе нитропруссид натрия–PSB (10/10 мМ., рН = 7.4) в присутствии: 1 – Car, 2 – His, 3 – Gly-Gly, 4 – Gly, 5 – β-Ala, 6 – (Gly)₂Cu²⁺, 7 – (Gly-Gly)₂Cu²⁺

 

Известно [75], что комплексы аминокислот и пептидов с ионами металлов обладают различной биологической активностью, поэтому в работе также исследовали комплексы Gly и Gly-Gly с ионами меди(II). Согласно данным, представленным на рис. 4, комплексы Cu(Gly)₂ и Cu(Gly-Gly)₂ при низких концентрациях (0.05–0.5 мМ.) в 1.4–1.8 раз активнее в акцептировании NO_x, чем Gly и Gly-Gly.

Высокую NO_x-акцепторную активность Tyr-Ala обусловливает преимущественно наличие остатка Tyr. Известно [52], что Tyr и его производные эффективно нитрируются нитрозил-радикалом в присутствии кислорода, что вероятнее всего реализуется по радикальному механизму через образование тирозин-феноксильного радикала (Tyr^•). Взаимодействие Tyr^• с NO и NO₂ с образованием 3-нитротирозина протекает с высокой константой скорости ~1.0·10⁹ (рН = 7.4) и 3·10⁹ моль^–1·л·с^–1 соответственно [58]. Меньшая эффективность Phen-Ala в сравнении с Tyr-Ala подтверждает важную роль фенольной ОН-группы в способности данных дипептидов регулировать уровень NO_x.

β-Ala-His (карнозин) является важнейшим эндогенным дипептидом, обладающим антиоксидантной активностью [76]. Карнозин снижает повреждение клеток, вызванное окислительным/нитрозативным стрессом, регулируя уровень NO [77–79]. Исходя из полученных данных, His (pI = 7.59), содержащий остатки имидазола (рK_а = 6.04), обусловливает эффективность β-Ala-His в способности регулировать уровень NO_x. Полученные результаты согласуются с данными работы [77], где показано, что His более эффективен в акцептировании NO, чем β-Ala (донор NO: пропиламин-пропиламин NONOат). Методом масс-спектрометрии (электроспрей-ионизация) установлено [77, 79], что карнозин образует аддукты с NO.

Дипептиды проявляют большую NO_x-акцепторную активность, чем свободные аминокислоты, входящие в их состав. Такой синергический эффект аминокислот при их соединении амидной связью может быть обусловлен вкладом группы CONH во взаимодействие дипептидов с NO_x. Вторичный амин дипептидной связи может вступать в реакцию N-нитрозирования и, тем самым, повышать способность дипептидов снижать уровень NO_x.

Комплексы Cu(Gly)₂ и Cu(Gly-Gly)₂ при низких дозах эффективнее, чем Gly и Gly-Gly, что можно объяснить взаимодействием NO с ионами Сu²⁺. Известно [3], что NO реагирует с ионами переходных металлов, комплексы которых могут выступать эффективными акцепторами нитрозил-радикала. NO в водной среде способен восстанавливать ионы Сu²⁺ в ее комплексах [80]. Для понимания более детального механизма NO_x-акцепторной активности изученных соединений требуются более углубленные исследования.

ВЫВОДЫ

Таким образом, изомеры и производные 2-аминофенола, а также дипептиды Tyr-Ala, β-Ala-His, Phen-Ala и Gly-Gly обладают способностью регулировать уровень NO_х (^•NO, ^•NO₂, N₂O₃) при физиологически значимых условиях in vitro. Замена атома Н на СН₃ в ОН-группе аминофенолов снижает их эффективность, аминофенолы с немодифицированной NH₂-группой обнаруживают большую активность, чем N-замещенные. Дипептиды как NO_х-акцепторы более эффективны, чем входящие в их состав свободные аминокислоты. Комплексы Cu(Gly)₂ и Cu(Gly-Gly)₂ активнее, чем Gly и Gly-Gly. Полученные результаты исследования соотношения структура–активность могут быть полезны для создания эффективных антиоксидантов на основе производных аминофенолов и дипептидов.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

В работе использованы следующие реактивы: 6-гидрокси-2,5,7,8-тетраметилхроман-2-карбоновая кислота (тролокс, ТхОН), 4-(2-аминоэтил)-бензол-1,2-диол (дофамин), пиперазин, 2,3-диметокси-5-метил-п-бензохинон (убихинон Q₀), β-аланилгистидин (β-Ala-His), β-аланин (β-Ala), L-гистидин (His), L-глицин (Gly), глицилглицин (Gly-Gly), нитропруссид натрия [натриевая соль пентацианонитрозилферрата(II), дигидрат], N-(1-нафтил)этилендиамина дигидрохлорид, сульфаниламид, тирозилаланин (Тyr-Ala), фенилаланилаланин (Phen-Ala), α-аланин (α-Ala), фенилаланин (Phen), триптофан (Trp), метанол (HPLC-grade), 2-аминофенол 1, 3-аминофенол 2, 4-аминофенол 3, N-(2-гидроксифенил)ацетамид 4, N-(4-гидроксифенил)ацетамид 5 (парацетамол), 2,6-ди-трет-бутил-4-метилфенол 6 (ионол), 2-амино-4-трет-бутилфенол 7 производства фирмы «Sigma-Aldrich» (Германия). Аскорбиновая кислота, азид натрия, ортофосфорная кислота, нитрит натрия (ОСЧ), пероксид водорода (30%) получены от ЗАО «Вектон» (Россия). 2-Амино-4,6-ди-трет-бутилфенол 8, 2-амино-4,6-диизопропилфенол 9, 2-анилино-4,6-ди-трет-бутилфенол 10 (бутаминофен), 3,5-ди-трет-бутил-2-метокси-N-фениланилин 11, N-(2-гидрокси-3,5-ди-трет-бутилфенил)-4-метилбензолсульфонамид 12 и N-(2-метокси-3,5-ди-трет-бутилфенил)-4-метилбезолсульфонамид 13 синтезированы по ранее описанным методикам [68, 81, 82]. Синтез комплексов глицина с ионами меди описан в работе [83]. Все использованные в работе реактивы имели аналитическую степень чистоты.

Исходные растворы аминокислот и их производных готовили в деионизированной воде, производных фенолов – в метаноле. Фосфатно-солевой буфер (PSB) (50 мМ., рН = 7.4) готовили с использованием следующих солей: Na₂HPO₄·12H₂O, KH₂PO₄, NaCl и KCl, необходимую величину рН достигали прибавлением растворов HCl или NaOH. Показатель рН контролировали с помощью милливольтметра рН марки HI 9321, используя комбинированный электрод HI 1131 или HI 1083. Калибровку рН-метра осуществляли в день проведения испытаний по стандартным буферным растворам (рН = 4.00±0.01, 10.00±0.01). В день анализа исходный раствор нитропруссида натрия (100 мМ.) готовили путем растворения твердой соли в 10 или 50 мМ. PSB, предварительно продутом аргоном в течение 1 ч для удаления кислорода. Полученный раствор нитропруссид натрия также продували аргоном и хранили в темной склянке, обернутой алюминиевой фольгой. Для тест-системы отбирали аликвоту (100 мкл) исходного раствора нитропруссида натрия. Исходный 100 мкМ. раствор нитрита натрия готовили путем растворения 69 мг NaNO₂ в 10 мл деионизированной воды.

Генерирование нитрозил-радикала и его активных форм. Тест-система представляет собой аэробную водную среду и имеет следующий состав: нитропруссид натрия (10 мМ.)–PSB (10 либо 50 мМ., рН = 7.4). Общий объем реакционной системы составляет 1 мл. Для изучения NO_х-активности соединений готовили их концентрированные растворы, а затем рассчитанные аликвоты добавляли в тест-систему. В контрольную систему параллельно вводили соответствующие аликвоты растворителей, использованные для приготовления растворов соединений. Реагенты после каждого добавления тщательно перемешивали с помощью прибора Vortex mixer и инкубировали при комнатной температуре в течение 120 мин при стандартизированном искусственном освещении (светодиодная лампа дневного света). Образование ^•NO и его активных форм (^•NO₂, N₂O₃) в тест-системе определяли по уровню нитрит-аниона, стабильного продукта автоокисления нитрозил-радикала в аэробной водной среде.

Исследование NO_х-активности соединений [S] базируется на методе конкурентных реакций. Они могут конкурировать с O₂ за ^•NO, или реагировать с промежуточными продуктами его автоокисления (^•NO₂, N₂O₃), и, тем самым, препятствовать протеканию реакций (1–3). В результате в присутствии соединений, активных в отношении ^•NO, ^•NO₂ и N₂O₃, кроме процессов (1–3) могут протекать реакции (4–6), изображенные на схеме 3.

 

NO + S → Продукты реакции (4)

NO₂ + S → Продукты реакции (5)

N₂O₃ + S → Продукты реакции (6)

Схема 3

 

Активность тестируемых соединений (S) в отношении NO_х оценивали по изменению концентрации нитрит-аниона в тест-системе в их присутствии в сравнении с контролем (%). Количество NO₂^– в контрольной тест-системе, не содержащей исследуемых соединений, принято за 100%. Для определения индекса полуингибирования IC₅₀ (мМ.) строили зависимости ингибирование (I, %)–концентрация (S, мМ.). Процент ингибирования рассчитывали по следующей формуле:

$I (\%) = \left\{\right({А}_{к} – {А}_{иссл})/{А}_{к}\}\times 100$,

где А_к и А_иссл –оптическая плотность контрольной (содержит все реагенты, кроме тестируемого соединения) и исследуемой (добавлено тестируемое соединение) систем соответственно. В качестве соединений сравнения использованы тролокс и аскорбиновая кислота (рKа₁ = 4.1, рKа₂ = 11.8, при рН = 7.4 преимущественно моноанион АscН^–). Аскорбиновая кислота может реагировать с NO, NO₂ (1.8·10⁷ моль^–1·л·с^–1, pH = 6.5) и N₂O₃ [84, 85]. Тролокс взаимодействовует с NO (3.76·10⁴ моль^–1·л·с^–1) и NO₂ [32].

Для выявления возможностей тест-системы тестировали NaN₃, пиперазин, дофамин и Н₂О₂, которые различным образом реагируют с ^•NO и его активными формами. H₂O₂ может окислять ^•NO (2.5·10⁵ и 8.4·10⁵ моль^–1·л·с^–1соответственно при 15 и 30°С) и NO₂ до нитрат-аниона [44, 45]. Азид натрия не взаимодействует с нитрозил-радикалом непосредственно, однако является эффективным акцептором N₂O₃ (2·10⁹ моль^–1·л·с^–1) [46]. Вторичный амин пиперазин (pK_a1 = 9.73, pK_a2 = 5.35) также эффективно реагирует с N₂O₃ (~1.3·10⁸ моль^–1·л·с^–1) [47] с образованием нитрозоаминов (N-мононитрозопиперазин и N,N′-динитрозопиперазин) [48]. Дофамин, производное пирокатехина (при физиологическом рН протонирован по NH₂-группе), реагирует с NO и NO₂ в аэрированных водных растворах [18, 49]. В отсутствие O₂ значимого взаимодействия дофамина с NO не наблюдали [50]. Все указанные соединения, включая стандартные ТхОН и АscН^–, концентрационно-зависимым образом ингибируют накопление нитрит-аниона, уровень NO₂^– снижается с увеличением их количества в тест-системе в сравнении с контролем. Полученные величины IC₅₀ составили: дофамин – 0.045, NaN₃ – 0.1, пиперазин – 0.115, H₂O₂ – 7.55, тролокс – 0.19, Asc – 4.88 мМ.

Определение нитрит-ионов в тест-системе. Нитрит-ионы (NO₂^–) определяли по модифицированной методике, изложенной в работах [86, 87], базирующейся на реакции Грисса. Для оптимального детектирования NO₂^– использовали модифицированный реактив Грисса, состоящий из двух реагентов – сульфаниламида (SA) и N-(1-нафтил)этилендиамина (NED). По истечении времени инкубирования в тест-систему (1 мл) на первом этапе вводили 0.5 мл раствора SA (1%-ный раствор в 5%-ной H₃PO₄) и оставляли на 5 мин при комнатной температуре. В результате диазотирования SA в кислой среде образуется диазоний-катион. На втором этапе добавляли 0.5 мл раствора NED (0.1%-ный раствор в деионизированной воде) и инкубировали тест-систему при комнатной температуре в течение 10 мин. NED реагирует с диазоний-катионом с образованием соединения, содержащего азогруппу N=N. Результирующий продукт, имеющий розово-красную окраску, детектировали по его абсорбции при 540 нм (30000 л·моль^–1·см^–1) с помощью спектрофлуориметра СМ 2203 (Солар, Беларусь) в режиме «спектрофотометрия».

Для количественной оценки содержания NO₂^– применяли метод градуировочного графика. Для приготовления калибровочных растворов в диапазоне концентраций 1–100 мкМ. использовали нитрит натрия. Концентрацию NO₂^– рассчитывали из уравнения линейной регрессии.

Статистический анализ. Для обработки полученных экспериментальных результатов применяли методы математической статистики, включая статистические функции программ Excel и Origin. Достоверность полученных результатов контролировали с помощью t-теста Стьюдента. В каждой экспериментальной серии проводили 3–7 раз параллельных опытов. На рисунках каждый результат представлен как среднее значение ± SD, статистически отличное в сравнении с контролем (p < 0.05).

ФИНАНСОВАЯ ПОДДЕРЖКА

Работа выполнена при финансовой поддержке Государственной научно-технической программы Республики Беларусь «Химические процессы, реагенты и технологии, биорегуляторы и биоорганическая химия» (проект 2.2.03.04) и Министерства образования Республики Беларусь (грант 809/46).

КОНФЛИКТ ИНТЕРЕСОВ

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

About the authors

E. M. Ovsyannikova

Belarussian State University

Author for correspondence.
Email: yurkovail@tut.by
Belarus, Minsk

A. A. Burko

Belarussian State University

Email: yurkovail@tut.by
Belarus, Minsk

G. A. Ksendzova

Belarussian State University

Email: yurkovail@tut.by
Belarus, Minsk

V. L. Sorokin

Belarussian State University

Email: yurkovail@tut.by
Belarus, Minsk

E. G. Karankevich

Institute of Physical Organic Chemistry, National Academy of Sciences of Belarus

Email: yurkovail@tut.by
Belarus, Minsk

I. L. Yurkova

Belarussian State University

Email: yurkovail@tut.by
Belarus, Minsk

References

Supplementary files