Adsorption complexes of vancomycin with nanodiamonds: formation kinetics, composition, and antimicrobial properties

Full Text

ВВЕДЕНИЕ

Покрытия, содержащие наноалмазы, могут быть использованы для улучшения механических характеристик материалов, которые используются для изготовления протезов сердечного клапана [1]. Важным достоинством таких покрытий является наличие на поверхности наноалмазов антисептического агента для предотвращения развития бактериальных инфекций в постоперационный период. Известно, что доза лекарств может быть снижена при нанесении их на функционально развитую поверхность наноалмазов, при этом будет достигнут нужный лечебный результат [2–6].

Ранее мы показывали, что как положительные, так и отрицательные наноалмазы улучшают механические характеристики коллагеновых матриц в примерно равной степени, хотя количество положительных наноалмазов сорбируется на поверхность матриц, как правило больше, чем отрицательных [1]. Также стоит отметить устойчивость таких покрытий на поверхности материала при эксплуатации. Получаемые покрытия содержат антибиотик на поверхности наноалмазов для предотвращения развития инфекций и слой, предотвращающий отложение кальция, например, из хитозана [7–10]. Необходимо отметить, что антибиотик, входящий в состав покрытия, должен сохранять антимикробную активность при адсорбции на поверхности наноалмазов.

Цель данной работы состояла в получении адсорбционных комплексов ванкомицина с наноалмазами для их использования при получении антимикробных покрытий коллагеновых матриц бычьего перикарда. Ванкомицин является лекарственным средством, относящихся к классу антимикробных препаратов, ингибирующих синтез клеточной стенки, и проявляющих высокую активность против грамположительных бактериальных возбудителей заболеваний [11]. Ранее мы показывали, что ванкомицин может быть адсорбирован на поверхности наноалмазов [12]. При получении адсорбционных комплексов необходимо учитывать сложность работы с данным соединением: его нестабильность в водных растворах при нейтральных значениях рН-условиях, необходимых для образования адсорбционных комплексов с наноалмазами детонационного синтеза, которые обладают функционально развитой поверхностью и способны агрегировать при определенном значении рН и ионной силе раствора. В данной работе мы исследовали кинетику адсорбции ванкомицина на наноалмазах детонационного синтеза, поверхность которых заряжена положительно (ДНА) и отрицательно (SDND).

Количество ванкомицина в растворе и на поверхности определяли с помощью меченного тритием ванкомицина по радиоактивности. Полученные комплексы были охарактеризованы методом ИК-спектрометрии, а также определена антимикробная активность адсорбционных комплексов по отношению к золотистому стафилококку – одному из самых распространенных возбудителей бактериальных инфекций.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Изучение кинетики адсорбции ванкомицина на наноалмазах

В работе использовали [³H]ванкомицин, полученный с помощью метода термической активации трития [12]. Наноалмазы (SDND, PlasmaChem), которые представляют собой водную суспензию 100 мг/мл, разводили водой до нужной концентрации. Из порошка наноалмазов (PlasmaChem) готовили водную суспензию (5 мг/мл) ультразвуковой обработкой с помощью ультразвуковой ванны Град (Россия). По данным метода низкотемпературной адсорбции азота удельная поверхность наноалмазов составляет 390 и 250 м²/г для SDND и ДНА соответственно. ИК-спектры используемых наноалмазов приведены ниже. Значения электрокинетического потенциала водных суспензий составили +21±2 и –41±5 мВ для ДНА и SDND, соответственно. Для ДНА pI составляет 11.4, в то время как для SDND в диапазоне рН от 3 до 13 изоэлектрическая точка отсутствует.

Готовили 1 мл суспензии наноалмазов в растворе [³H]ванкомицина с концентрацией 0.7 мг/мл, удельной радиоактивностью 1 мКи/г, с концентрацией наноалмазов 1 мг/мл. Суспензии инкубировали при 25°С. Через определенные промежутки времени суспензии центрифугировали в течение 20 мин при 12100g и измеряли радиоактивность надосадочного раствора, который затем отбирали полностью. Осадок наноалмазов промывали от несвязанного ванкомицина и заливали сцинтилляционной жидкостью UltimaGold (PerkinElmer) для измерения радиоактивности и определения концентрации ванкомицина на поверхности наноалмазов по уравнению:

$A=\frac{I}{\epsilon a_{уд}{m}_{\text{ND}}},$ (1)

где I – скорость счета бета-излучения трития, ε – эффективность регистрации, а_уд – удельная (массовая) радиоактивность ванкомицина, m_ND – масса наноалмазов в суспензии.

Анализ комплексов наноалмазов с ванкомицином с помощью ИК-спектроскопии

Смешивали 1 мг комплекса наноалмазов с ванкомицином с бромидом калия. Регистрацию спектров проводили с помощью спектрометра Nicolet Protege 460 в диапазоне волновых чисел от 400 до 4000 см^–1 при оптическом разрешении 4 см^–1.

Определение количества комплекса наноалмаз-ванкомицин на поверхности коллагеновых матриц

В работе использовали стабилизированные глутаровым альдегидом и девиталлизированные коллагеновые матрицы бычьего перикарда. Получали адсорбционные комплексы ванкомицина с наноалмазами согласно методике, описанной в п. 2.1. В этих экспериментах использовали меченные тритием наноалмазы, полученные с помощью метода термической активации трития [13]. Через сутки выдерживания наноалмазов в растворе ванкомицина суспензии центрифугировали, осадок декантировали, промывали водой и суспензировали в воде до концентрации наноалмазов 1 мг/мл. В суспензию помещали коллагеновые матрицы из бычьего перикарда и перемешивали в течение суток. После перемешивания матрицы помещали в 0.9% раствор хлорида натрия. Затем матрицы высушивали до постоянной массы и растворяли кипячением в концентрированной азотной кислоте. К раствору добавляли воду, центрифугировали и измеряли радиоактивность осадка наноалмазов, как описано в п. 2.1. Количество наноалмазов на поверхности матриц (Г_ND) определяли по уравнению:

${Г}_{\text{ND}}=\frac{I}{\epsilon a_{\text{NDуд}}{m}_{матрица}},$ (2)

где а_NDуд – удельная радиоактивность наноалмазов, m_{матрица} – масса матрицы.

Определение антимикробных свойств комплексов наноалмазов с ванкомицином

Получали покрытия из комплексов наноалмазов с ванкомицином на поверхности коллагеновых матриц бычьего перикарда согласно методике, приведенной в п. 2.3. Оценку адгезии бактерий к модифицированным и контрольным образцам коллагеновых матриц перикарда проводили в соответствии с ГОСТ Р ИСО 11737-1–2000 [14]. В качестве тест-культур были выбраны клинические штаммы бактерий Staphylococcus aureus (золотистый стафилококк), вызывающие осложнения после проведения операции по замене клапана. Все подготовительные работы и исследования проводили в стерильных условиях при температуре окружающей среды 20–22°C.

Из суточных культур готовили суспензии по Мак-Фарланду с концентрацией 10⁶ клеток/мл. Исследуемые образцы коллагеновых матриц с нанесенным алмазосодержащим покрытием погружали в подготовленные суспензии культур и инкубировали в термостате при 37°C в течение 4 ч. По окончании экспозиции образцы извлекали и отмывали от неадгезированных клеток стерильным 0.9% NaCl и высушивали на стерильной фильтровальной бумаге. Далее делали отпечатки с опытных и контрольных образцов, последовательно прикладывая гладкую и ворсинчатую стороны коллагеновых пластин к поверхности питательной среды Хинтона–Мюллера с последующим растиранием досуха полученных отпечатков.

После проведенной аппликации каждую пластину растирали в 1 мл стерильного физиологического раствора со стерильной стеклянной крошкой. Полученные гомогенаты по 0.5 мл без разведения и с 10-кратным разведением помещали на плотную питательную среду Хинтона–Мюллера и растирали досуха стерильным шпателем. Посевы опытных и контрольных образцов на среде Хинтона–Мюллера инкубировали в термостате в течение суток при температуре 37°C. По окончании инкубации подсчитывали количество колоний жизнеспособных клеток тест-микроорганизмов на исследуемых и контрольных образцах.

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

На рис. 1 показана кинетика адсорбции ванкомицина на поверхности наноалмазов, найденная из изменения концентрации ванкомицина в растворе.

 

Рис. 1. Зависимости адсорбции ванкомицина на наноалмазах ДНА (а) и SDND (б) от времени.

 

Кинетические зависимости адсорбции на наноалмазах обоих типов были описаны уравнением псевдо-второго порядка [15]:

$A=\frac{A_{равн}^2{k}_{2}t}{1+A_{равн}{k}_{2}t}.$ (3)

Подбор параметров осуществляли с помощью программного пакета SciDAVis с использованием алгоритма Левенберга–Марквардта с допуском 0.0001. Результат аппроксимации показан на рис. 1 линией. Параметры уравнения псевдо-второго порядка приведены в табл. 1.

 

Таблица 1. Параметры уравнения кинетики адсорбции псевдо-второго порядка

Тип наноалмазов	Aравн, г/г	k2, день–1	R2
ДНА	0.19 ± 0.01	114.7 ± 51.0	0.974
SDND	0.22 ± 0.01	174.4 ± 97.2	0.973

 

В течение первых суток адсорбция достигает постоянного значения около 0.20 г/г. Важно подчеркнуть, что параметры кинетики адсорбции для обоих типов наноалмазов оказались близкими. Это подтверждает выдвинутое ранее предположение о том, что адсорбция ванкомицина на поверхности наноалмазов происходит посредством образования связей между сорбатом и связанными с поверхностью молекулами воды [12]. Отметим, что серьезные изменения происходят с ванкомицином в воде при концентрациях более 20 г/л и времени хранения более суток [16].

Поскольку комплексы наноалмазы-ванкомицин предполагается использовать как антибактериальные покрытия, то необходимо определить количество ванкомицина, прочно связанного с поверхностью наноалмазов. Поэтому после определения адсорбции ванкомицина по разности начальной концентрации и концентрации в растворе в текущий момент времени проводили отмывку осадка наноалмазов от непрочно связанного ванкомицина, измеряли его радиоактивность и определяли оставшееся количество ванкомицина по радиоактивности (1). Зависимость адсорбции ванкомицина на наноалмазах после промывки образца и измерения непосредственно радиоактивности осадка комплекса наноалмазов с ванкомицином приведены на рис. 2.

 

Рис. 2. Зависимости прочно связанного ванкомицина на наноалмазах ДНА (а) и SDND (б) от времени.

 

Кинетические зависимости для обоих типах наноалмазов имели схожий вид и описывались уравнением псевдо-первого порядка:

$A=A_{равн}(1-e^{-k_{1}t}).$ (4)

Параметры уравнения псевдо-первого порядка приведены в табл. 2, результаты аппроксимации показаны на рис. 2 линией.

 

Таблица 2. Параметры кинетического уравнения псевдо-первого порядка для прочно связанного ванкомицина с наноалмазами

Тип наноалмазов	Aравн, г/г	k2, день–1	R2
ДНА	0.033 ± 0.002	29.2 ± 9.1	0.977
SDND	0.095 ± 0.002	53.1 ± 8.6	0.996

 

Предельное значение количества ванкомицина, прочно связанного с поверхностью наноалмазов обоих типов, достигается за первые сутки адсорбции. Принимая во внимание размер молекулы ванкомицина (3.2 × 2.2 нм) [17] значение остаточного количества ванкомицина на SDND близко к полному заполнению поверхности молекулами ванкомицина с плотной упаковкой. В то время как покрытие ДНА уменьшается в 4.5–5 раз и в три раза меньше, чем на SDND.

Десорбцию ванкомицина с поверхности наноалмазов изучали в воде, в 0.9% растворе хлорида натрия и в растворе бычьего сывороточного альбумина 40 г/л в 0.9% NaCl в течение 10 суток при 25°C. Результаты приведены в табл. 3.

 

Таблица 3. Десорбция ванкомицина с поверхности наноалмазов

Десорбирующий раствор	Количество ванкомицина на поверхности наноалмазов после десорбции, г/г
	ДНА	SDND
Вода	0.030	0.009
0.9% NaCl	0.033	0.010
Сывороточный альбумин 40 г/л в 0.9% NaCl	0.022	0.003

 

Из результатов, приведенных в табл. 2 и 3, видно, что с наноалмазов ДНА ванкомицин не удаляется в присутствии десорбирующих веществ, в то время как с поверхности SDND ванкомицин легко десорбируется. Можно предположить, что удерживание ванкомицина на ДНА происходит за счет электростатического притяжения карбоксильной группы ванкомицина и положительных групп на поверхности ДНА.

Образцы наноалмазов с наибольшим содержанием ванкомицина (адсорбция 1 сут., отмывка водой) проанализировали методом ИК-спектроскопии, а также проверили их антимикробные свойства. На рис 3 и 4 приведены ИК-спектры комплексов ванкомицина с наноалмазами.

В ИК-спектре наноалмазов ДНА (рис. 3) полоса 1795 см^–1 относится к колебаниям С=О-групп в ангидридных и лактонных группах на поверхности наноалмазов [18]. Полоса при 1723 см^–1 относится к колебаниям С=О-групп в карбонилах. Сигнал при 1630 см^–1 объясняется наличием связанной с поверхностью водой. Полоса при 1452 см^–1 относится к деформационным колебаниям СН-связей в СН₂-группах (sp² и sp³) [19]. Сигналы 1319 и 1254 см^–1 относятся к валентным колебаниям С–С-связей в sp²- и sp³- состояниях. Сигнал 1117 см^–1 относится к асимметричным колебаниям С-О-С связей, а при 1063 см^–1 – к валентным колебаниям С-О-связи в гидроксильных или эфирных группах [18]. Сигналы при 902 см^–1 и 878 см^–1 относятся к колебаниям СН-связей в СН₂(sp²)-группах и графитизированной части поверхности, соответственно [19].

 

Рис. 3. ИК-спектры ДНА (1), комплекса ДНА-ванкомицин (2) и ванкомицина (3).

 

На поверхности SDND (рис. 4) также можно видеть ангидридные группы (сигнал С=О-связей при 1776 см^–1). Сигнал 1465 см^–1 связан с деформационными колебаниями СН-связи в СН₃-группах [19]. Полоса при 1254 см^–1 отвечает колебаниям С-О связей в эпокси- и эфирных группах [18].

 

Рис. 4. ИК-спектры SDND (1), комплекса SDND-ванкомицин (2) и ванкомицина (3).

 

Расшифровка ИК-спектра ванкомицина подробно приведена в работах [20–22]. Сигнал при 1668 см^–1 относится к колебаниям С=О-связи амида I, сигналы в области 1587 и 1499 см^–1 связаны с колебанием связей в ароматических кольцах. Также о колебаниях связей С=С в арильных фрагментах свидетельствует полоса 1613 см^–1 [23]. Сигналы при 1424 и 1393 см^–1 относятся к симметричным колебаниям СО₂^–группы [20, 23]. Сигнал 1320 см^–1 является типичной для аминокислот, но происхождение ее не определено [23]. Сигнал при 1231 см^–1 обусловлен колебаниями фенольных групп [22].

При образовании комплексов с наноалмазами SDND в ИК-спектре комплекса сохраняются сигналы, характерные для ванкомицина связанные с колебаниями амида I и ароматических фрагментов, которые отсутствуют в спектре исходного алмаза и подтверждают наличие вещества на его поверхности. В ИК-спектре комплекса ДНА-ванкомицин напротив, присутствуют сигналы, характерные для наноалмазов. При этом исчезают полосы 1063, 902 и 878 см^–1, что позволяет предположить связывание небольшого количества ванкомицина с графитизированными частями положительно заряженных наноалмазов.

Таким образом, данные ИК-спектроскопии подтвердили данные радиохимического метода о существенно меньшем количестве ванкомицина на ДНА по сравнению с SDND, поверхность которых полностью покрыта слоем ванкомицина.

Для проверки антимикробных свойств комплекса было необходимо получить покрытия коллагеновых матриц бычьего перикарда слоем комплексов наноалмаз-ванкомицин [24]. Поэтому с помощью меченных тритием наноалмазов определили количество комплекса, которое адсорбируется на поверхность коллагеновой матрицы. Было показано, что на поверхность матрицы может быть осаждено 5.6±1.7 мг/г комплекса с SDND и 8.6±1.1 мг/г комплекса с ДНА. Эти величины больше, чем ранее полученные для положительно и отрицательно заряженных наноалмазов, поскольку были использованы более тонкие матрицы, по-видимому, лучше сорбирующие наноалмазы. Откуда был сделан вывод, что содержание ванкомицина на поверхности матриц составляет 0.27 и 0.56 мг ванкомицина на 1 г коллагеновой матрицы для комплексов с ДНА и SDND, соответственно. Это значение ниже, чем при нанесении ванкомицина из раствора в угольной кислоте под давлением [25]. Однако результаты исследования антимикробных свойств по отношению к отношению к золотистому стафилококку показали схожие результаты по адгезии (табл. 4). Выживаемость оказалась выше, чем в случае ванкомицина в составе покрытий с гиалуроновой кислотой и хитозаном, но на 3 порядка меньше, чем в случае контрольного образца.

 

Таблица 4. Антимикробные характеристики адсорбционных комплексов наноалмазов с ванкомицином

Тип наноалмазов	Адгезия, lg KOE	Выживаемость, lg KOE
Контрольный образец без наноалмазов	≈ 5	≈ 5
ДНА	2.4	2.1
SDND	2.4	2.2

 

Таким образом, использование наноалмазов позволяет использовать меньшее количество антибиотика для достижения необходимого результата.

ВЫВОДЫ

В результате проведенной работы было показано, что кинетика адсорбции ванкомицина схожа для двух типов наноалмазов и имеет две стадии: образование слоя с плотной упаковкой молекул (состав комплекса 0.2 г/г) происходит за 1 сут, а при увеличении контакта компонентов происходит дальнейшее небольшое снижение концентрации ванкомицина в растворе, однако дополнительная адсорбция ванкомицина обратима и вещество легко удаляется при промывке водой. Количество ванкомицина, прочно связанного с наноалмазами, было меньше и зависело от заряда поверхности – для отрицательно заряженных наноалмазов SDND составляло 0.10 г/г, для положительно заряженных ДНА – 0.03 г/г. Дальнейшая десорбция ванкомицина в воду и 0.9% NaCl в течение 10 сут снижала его содержание до 0.01 г/г в составе комплекса с SDND, но из комплекса с ДНА ванкомицин в этих условиях не извлекался. В присутствии сывороточного альбумина наблюдалось дополнительное освобождение ванкомицина из состава комплексов. Антимикробные свойства обоих комплексов оказались одинаковыми: адгезия и выживаемость бактерий на покрытиях из обоих типов наноалмазов была меньше примерно в 10³ раз, чем для контрольных образцов. Таким образом, полученные комплексы можно рассматривать как потенциальные компоненты протезов сердечного клапана.

Совокупность полученных данных подтверждает предположение о том, что образование водородных связей с молекулами воды играет ключевую роль в адсорбции и удержании ванкомицина на поверхности наноалмазов.

ФИНАНСИРОВАНИЕ РАБОТЫ

Работа выполнена в рамках гос.задания № 122012600116-4 “Получение и использование радионуклидов и меченных соединений для целей ядерной медицины, изучения биологически значимых процессов и взаимодействия живых организмов с ионизирующим излучением”. Подготовка коллагеновых матриксов перикарда для исследований была выполнена в рамках Государственного задания № 075-00277-24-00 Министерства науки и высшего образования Российской Федерации с использованием научного оборудования ИНЭОС РАН.

КОНФЛИКТ ИНТЕРЕСОВ

Авторы заявляют, что у них нет конфликта интересов.

About the authors

Т. Shen

M. V. Lomonosov Moscow State University

Email: chernyshevamg@my.msu.ru
Russian Federation, Moscow, 119991

M. G. Chernysheva

M. V. Lomonosov Moscow State University

Author for correspondence.
Email: chernyshevamg@my.msu.ru
Russian Federation, Moscow, 119991

A. G. Popov

M. V. Lomonosov Moscow State University

Email: chernyshevamg@my.msu.ru
Russian Federation, Moscow, 119991

I. S. Chashchin

A. N. Bakulev Scientific Center for Cardiovascular Surgery; A. N. Nesmeyanov Institute of Organoelement Compounds, Russian Academy of Sciences

Email: chernyshevamg@my.msu.ru
Russian Federation, Moscow, 119334; Moscow, 119334

N. M. Anuchina

A. N. Bakulev Scientific Center for Cardiovascular Surgery

Email: chernyshevamg@my.msu.ru
Russian Federation, Moscow, 119334

G. A. Badun

M. V. Lomonosov Moscow State University

Email: chernyshevamg@my.msu.ru
Russian Federation, Moscow, 119991

References

Supplementary files