Leptin fragment modulates the stimulatory effects of chorionic gonadotropin on testicular steroidogenesis in a model of diet-induced obesity in rats

Texto integral

ВВЕДЕНИЕ

Ожирение является одной из наиболее актуальных проблем современной медицины. Факторы, сопровождающие ожирение, такие как избыточная масса тела, гиперинсулинемия и гиперлептинемия, наряду со значительным повышением продукции провоспалительных факторов в крови и тканях негативно влияют на функции гипоталамо-гипофизарно-тестикулярной оси (ГГТ). Гонадолиберин (GnRH)-экспрессирующие нейроны гипоталамуса регулируют синтез и секрецию лютеинизирующего (ЛГ) и фолликулостимулирующего гормонов клетками передней доли гипофиза, которые, в свою очередь стимулируют процессы синтеза тестостерона и сперматогенеза в семенниках. Информация о метаболическом состоянии организма, которая аккумулируется и перерабатывается нейромедиаторными системами гипоталамуса, в значительной степени влияет на функциональную активность GnRH-нейронов и работу ГГТ оси [1, 2].

Лептин, пептидный гормон, секретируемый белой жировой тканью, в гипоталамусе стимулирует секрецию α-меланоцистимулирующего гормона (α-МСГ) и кисспептина (Kiss) соответственно проопиомеланокортин (POMC)- и Kiss-экспрессирующими нейронами, и подавляет экспрессию орексигенных факторов – нейропептида Y (NPY) и агути-подобного пептида (AgRP) NPY/AgRP-экспрессирующими нейронами, снижая тем самым потребление пищи и активируя катаболические процессы. Не менее важной функцией лептина является регуляция активности гипоталамических GnRH-экспрессирующих нейронов, опосредованная стимуляцией POMC- и Kiss-нейронов и ингибированием NPY/AgRP нейронов [3, 4]. Способность лептина регулировать и модулировать секрецию GnRH обеспечивается наличием функционально активных, полноразмерных лептиновых рецепторов ObRb и других компонентов лептиновой сигнальной системы в POMC-, Kiss- и NPY/AgRP-экспрессирующих нейронах, проекции которых направлены к GnRH-нейронам. Взаимодействие лептина с рецепторами ObRb приводит к запуску внутриклеточных каскадов, результатом чего является изменение экспрессии и секреции нейропептидов, воздействующих на GnRH-нейроны [4]. Недавно было установлено, что рецептор лептина ObRb и компоненты лептиновой системы присутствуют и в других звеньях ГГТ оси: гонадотропоцитах аденогипофиза и в тестикулярных клетках Лейдига. Однако, на уровне семенников, влияние лептина имеет разнонаправленный характер, в отличие от более однозначного стимулирующего эффекта на уровне гипоталамуса [5]. Ряд других подтипов рецептора лептина участвуют в транспорте гормона через гематоэнцефалический барьер (ГЭБ), который носит, как предполагают, рецептор-опосредованный характер [6]. Одним из событий, сопровождающих развитие ожирения и сахарного диабета 2-го типа является развитие системной лептиновой резистентности, которая возникает на фоне значительного повышения уровня лептина в крови. Следствием ее является снижение рецептор-опосредованного транспорта лептина через ГЭБ, в результате чего возникает дефицит лептина в структурах головного мозга, включая гипоталамус [6]. Предполагается, что развитие лептиновой резистентности не только вызывает нарушение баланса анорексигенных и орексигенных процессов на уровне гипоталамуса, но и может привести к функциональным изменениям активности центрального, гипоталамического, звена ГГТ оси.

В настоящее время активно исследуется способность фрагментов лептина активировать лептиновые сигнальные пути, заменяя полноразмерную молекулу этого гормона. Одним из наиболее перспективных аналогов является миристилированный N-концевой фрагмент лептина 116–122 MA-[D-Leu4]-OB3 (ФЛ), который продемонстрировал выраженный анорексигенный эффект в моделях диета-индуцированного ожирения (ДИО) у мышей. У животных с ожирением было показано снижение потребления пищи, массы тела, отмечалось частичное восстановление толерантности к глюкозе. В отличие от полноразмерной молекулы лептина, ФЛ характеризуется большей стабильностью в кровотоке и не вызывает развития лептиновой резистентности при длительном применении [7, 8]. Наиболее впечатляющие результаты были показаны при интраназальном способе введения ФЛ. Показано, что интраназально вводимый ФЛ накапливается в аркуатном ядре гипоталамуса, проникая в него, используя для этого наиболее проницаемые участки ГЭБ, что является преимуществом перед другими способами введения, особенно в условиях лептиновой резистентности при ожирении и диабете 2-го типа [9, 10].

Ранее на самцах крыс, которые находились на стандартной диете, нами была продемонстрирована способность ФЛ модулировать эффекты хорионического гонадотропина человека (ХГЧ) на уровень тестостерона в крови и на экспрессию гена Star, кодирующего холестерин-транспортирующий белок StAR, ключевой компонент системы тестикулярного стероидогенеза [11]. Было установлено, что влияние ФЛ на тестикулярный стероидогенез обусловлено в первую очередь его эффектами на гипоталамо-гипофизарном уровне, так как на фоне введения цетрореликса, антагониста рецептора GnRH (АНТ), его эффекты на тестикулярный стероидогенез исчезали [11].

В настоящем исследовании мы использовали аналогичную схему эксперимента для изучения влияния ФЛ на тестикулярный стероидогенез у крыс с ДИО. Ожирение вызывали длительной комбинированной высокожировой и высокоуглеводной диетой (ВЖВУД). Поскольку ожирение, с одной стороны, характеризуется гиперлептинемией и лептиновой резистентностью и, с другой стороны, может сопровождаться изменениями тестикулярного стероидогенеза, то изучение влияния ФЛ на компоненты ГГТ оси представляет значительный интерес для эндокринологии и репродуктивной медицины.

Целью работы является изучение способности ФЛ модулировать стимулирующие эффекты ХГЧ на уровень тестостерона в крови, на экспрессию генов, контролирующих тестикулярный стероидогенез и на уровень рецептора ЛГ в семенниках у крыс на фоне ВЖВУД, а также исследование мишеней ФЛ в ГГТ оси с помощью АНТ, блокирующего GnRH-опосредуемую стимуляцию секреции ЛГ аденогипофизом.

МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Для экспериментов использовали 75 половозрелых самцов крыс линии Wistar, которые содержались в стандартных условиях вивария со свободным доступом к воде (или раствору сахарозы) и корму. Животные содержались в пластиковых клетках по пять особей в каждой с нормальным циклом день/ночь (12 ч/12 ч, свет включается в 9.00 утра) и комнатной температуре (24 ± 2 °C). В возрасте двух месяцев животные были разделены на две группы. Первая (65 животных) получала в течение 20 недель ВЖВУД, включающую корм с долей жира (свиное сало) не менее 60 % и 30 %-ный раствор сахарозы вместо питьевой воды. Вторая группа (10 животных) находилась на нормальной диете, получая стандартный корм и обычную воду. По истечении 20 недель потребления ВЖВУД у крыс оценивали толерантность к глюкозе, для чего использовали интраперитонеальный глюкозотолерантный тест (ИГТТ), как описано ранее [12]. До и через 120 мин после в/б введения глюкозы (2 г/кг) оценивали уровни глюкозы, инсулина и лептина в крови. До начала и в течение диеты измеряли массу тела животных. Далее отбирали 48 самцов крыс с уровнем глюкозы через 120 мин после ГТТ выше 7.0 мМ и с массой тела на 7 % выше таковой в контроле, рассматриваемых в дальнейшем, как животные с ДИО, после чего формировали 8 групп (в каждой n = 6).

Самцы крыс из групп “ВЖВУД+АНТ”, “ВЖВУД+АНТ+ФЛ”, “ВЖВУД+АНТ+ХГЧ” и “ВЖВУД+АНТ+ФЛ+ХГЧ” в течение трех дней получали инъекции цетрореликса ацетата (“Xingtai Yuanao Technology Co.”, КНР), антагониста GnRH рецептора (АНТ), который растворяли в физиологическом растворе и вводили крысам п/к в суточной дозе 75 мкг/кг. Самцам крыс из групп “ВЖВУД+ФЛ”, “ВЖВУД+ФЛ+ХГЧ”, “ВЖВУД+ АНТ+ФЛ” и “ВЖВУД+АНТ+ФЛ+ХГЧ” в течение трех дней интраназально вводили фрагмент лептина миристоил-Ser-Cys-Ser-D-Leu-Pro-Gln-Thr-амид (ФЛ) в суточной дозе 200 мкг/крысу. Самцы крыс из остальных групп вместо АНТ и ФЛ в течении 3 дней получали физиологический раствор (ФР). Самцы крыс из групп “ВЖВУД+ХГЧ”, “ВЖВУД+ ФЛ+ХГЧ”, “ ВЖВУД+АНТ+ХГЧ” и “ВЖВУД+ АНТ+ФЛ+ХГЧ” на третий день эксперимента были обработаны с помощью ХГЧ (“Московский эндокринный завод”, Россия) в дозе 10 МЕ/крысу (п/к) через 90 мин после последней инъекции АНТ и/или ФЛ или ФР. Животные, находящиеся на стандартной диете, из которых сформировали группу “Контроль”, вместо препаратов получали ФР. Дозы и продолжительность введения препаратов ФЛ, АНТ и ХГЧ были подобраны в предварительных сериях экспериментов и были апробированы нами в ранее опубликованных работах [11, 12].

Уровень тестостерона в крови определяли: (1) до введения препаратов в 1-й день эксперимента, а также на третий день эксперимента – (2) через 90 мин после введения ФЛ и(или) АНТ, (3) через 180 мин после введения ФЛ и(или) АНТ и через 90 мин после введения ХГЧ, (4) через 270 мин после введения ФЛ и(или) АНТ и через 180 мин после введения ХГЧ.

Образцы ткани семенников забирали в последний день эксперимента, через 270 мин после введения ФЛ и/или АНТ или через 180 мин после введения ХГЧ. Декапитация животных осуществлялась под общей анестезией (хлоралгидрат, 400 мг/кг). Уровень тестостерона в крови определяли с помощью наборов “ИФА-Тестостерон” (“Алкор-Био”, Россия). Уровень лептина и инсулина в крови определяли с помощью наборов “ELISA Kit for Leptin” и “ELISA Kit for Insulin” (“Cloud-Clone Corp.”, США). Для анализа уровней мРНК генов тестикулярного стероидогенеза из семенников выделяли тотальную РНК с помощью реагента “ExtractRNA” (“Евроген”, Россия). Для получения кДНК проводили реакцию обратной транскрипции с помощью набора “MMLV RT Kit” (“Евроген”, Россия), для которой брали 1мкг тотальной РНК на реакцию. ПЦР в реальном времени проводили с помощью амплификатора “Applied Biosystems® 7500 Real-Time PCR System” (“Life Technologies, Thermo Fisher Scientific Inc.”, США) в смеси, содержащей кДНК, 0.4 мкМ прямого и обратного специфичных праймеров, реагент “qPCR-HS SYBR+Low ROX” (“Евроген”, Россия). Для контроля выхода продукта реакции и отсутствия образования димеров праймеров использовали анализ кривой плавления в соответствии с функцией “ABI Melt Curve program”. В работе использовали ранее описанные и апробированные последовательности комплементарных прямого и обратного праймеров для генов крысы – гена Star, кодирующего холестерин-транспортирующий белок StAR, Cyp11a1, кодирующего цитохром P450scc, а также для гена Actb, кодирующего белок Actin-B и используемого в качестве референсного (табл. 1) [12].

 

Таблица 1. Последовательности праймеров к генам крысы, использованных в исследовании

Название	Последовательность праймера	Т отжига, °C	NCBI Reference Sequence
Star Forward	AAGGCTGGAAGAAGGAAAGC	55	NM_031558.3
Star Reverse	CACCTGGCACCACCTTACTT
Cyp11a1 Forward	TATTCCGCTTTGCCTTTGAG	55	NM_017286.3
Cyp11a1 Reverse	CACGATCTCCTCCAACATCC
Actb Forward	CTGGCACCACACCTTCTACA	55	NM_031144.3
Actb Reverse	AGGTCTCAAACATGATCTGGGT

 

Для иммуногистохимических исследований семенники фиксировали погружением в 4 %-ный раствор параформальдегида в течение 48 ч (4 °C). Далее промывали в холодном 0.9 %-ном натрий-фосфатном буфере (PBS) и помещали в 30 % раствор сахарозы, растворенный на PBS (при +4 ^оС). После криопротекции ткани семенников замораживали на сухом льду с использованием среды Tissue-Tek (“Sacura Finetek Europe”, Нидерланды). Серии поперечных срезов (толщина 6 мкм) готовили с помощью криостата Leica CM-1520 (“Leica Biosystems”, Германия) и монтировали на стеклах SuperFrost/plus (“Menzel”, Германия). Срезы из разных экспериментальных групп помещали на одно и то же стекло и сушили при комнатной температуре в течение ночи. Иммуногистохимическую реакцию проводили согласно протоколу, который был подробно описан ранее [12]. Для реакций были использованы первичные поликлональные кроличьи антитела к рецептору ЛГ (“LSBio”, США) в разведении 1:1000, вторичные антикроличьи IgG-антитела козы (“VectorLabs”, Великобритания) в разведении 1:600, конъюгированные с биотином (VectorLabs., Великобритания) и раствор стрептовидин–пероксидазы (BioLegend, США), разведенной 1:1000. Срезы обрабатывали 0.05 %-ным диаминобензидином (“Sigma-Aldrich”, США) и 0.03 %-ной перекисью водорода в PBS. Реакцию останавливали промывкой дистиллированной водой, затем срезы помещали под покровное стекло с глицерином. Специфичность иммуногистохимической реакции проверяли с использованием отрицательного контроля (образцы без первичных или вторичных антител). Микрофотографии (по 10 для каждого животного) с разных уровней семенников получали с помощью микроскопа Carl Zeiss Imager A1, объектив ×20 (“Carl Zeiss”, Германия). Оптическую плотность иммунопозитивного к рецептору ЛГ материала оценивали с помощью программы Image J (NIH, США). Результаты представлены в арбитражных единицах.

Статистическую обработку полученных данных осуществляли с помощью пакета программ GraphPad Prism (версия 8.0.1). Уровни глюкозы, инсулина и лептина в крови оценивали с помощью дисперсионного анализа ANOVA. Уровни тестостерона в крови, значения AUC_0–270 для концентрационных кривых для тестостерона, мРНК исследуемых генов, а также изменения оптической плотности при иммуноокрашивании рецептора ЛГ в семенниках анализировали с помощью критерия Краскела– Уоллиса (с попарным сравнением критерием Данна).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Влияние ВЖВУД на метаболические показатели и тестикулярный стероидогенез у самцов крыс

Длительная ВЖВУД привела к значительному изменению метаболических показателей у самцов крыс. Масса абдоминального и эпидидимального жира, а также масса тела были повышены на 169, 80 и 16 % соответственно. При проведении глюкозотолерантного теста через 120 мин после глюкозной нагрузки уровни глюкозы, инсулина и лептина были повышены на 43, 25 и 60 % соответственно (табл. 2). Таким образом, самцы крыс, получавшие ВЖВУД, характеризовались выраженным ожирением (ДИО), нарушенной толерантностью к глюкозе, сниженной чувствительностью к инсулину и лептину.

 

Таблица 2. Изменение уровней глюкозы, инсулина и лептина в крови, а также массы тела и жировой ткани у самцов крыс, находящихся на стандартной диете или на ВЖВУД

Параметр	Контроль	ВЖВУД
Уровень глюкозы в крови натощак, мМ	5.17±0.57	5.71±0.61
Уровень глюкозы в крови через 120 мин после глюкозной нагрузки, мМ	6.12±0.74	8.18±1.20*
Уровень инсулина в крови натощак, нг/мл	2.33±0.46	2.67±0.46
Уровень инсулина в крови через 120 мин после глюкозной нагрузки, нг/мл	2.62±0.95	3.33±0.63*
Уровень лептина в крови натощак, нг/мл	2.63±0.93	3.87±1.50
Уровень лептина в крови через 120 мин после глюкозной нагрузки, нг/мл	2.77±1.08	6.19±1.98*
Масса тела, г	362±43	420±41#
Масса абдоминального жира, г	3.6±1.1	9.7±2.4#
Масса эпидидимального жира, г	4.5±1.0	8.1±2.5#

Данные представлены как M ± SD, n = 24. # – отличия между группами “Контроль” и ВЖВУД, * – отличия между временными точками 0 и 120 мин статистически значимы при p < 0.05.

 

После изучения влияния ВЖВУД на уровень тестостерона в крови и на уровень мРНК гена Star, кодирующего холестерин-транспортирующий белок StAR в семенниках, нами не было выявлено значимых различий между контрольными крысами и животными с ДИО (рис. 1, 2). При этом в семенниках ДИО-крыс на 40 % была повышена экспрессия гена Cyp11a1, кодирующего цитохром P450scc, один из ключевых ферментов синтеза тестостерона. Кроме того, данные иммуногистохимического анализа демонстрировали снижение на 74 % содержания рецепторов ЛГ в клетках Лейдига у ДИО-крыс (рис. 3). Тем самым, несмотря на то что ВЖВУД существенно не влияла на уровень тестостерона, в семенниках наблюдали снижение уровня рецептора ЛГ и повышение экспрессии гена Cyp11a1, которое, по-видимому, носит компенсаторных характер.

 

Рис. 1. Влияние трехдневного введения фрагмента лептина MA-[D-Leu4]-OB3 и/или цетрореликса и однократной инъекции ХГЧ на уровень тестостерона в крови самцов крыс в условиях потребления ими ВЖВУД.

Образцы крови для измерения уровня тестостерона были взяты из хвостовой вены в нулевой день эксперимента (0 min), а также на третий день обработки ФЛ и(или) АНТ через 90 мин после введения препаратов (90 min), через 180 мин после введения ФЛ и(или) АНТ и через 90 мин после введения ХГЧ (180 min), через 270 мин после введения ФЛ и(или) АНТ и через 180 мин после введения ХГЧ (270 min). (a) – Изменение уровня тестостерона в крови у ДИО-крыс, которым в течение трех дней интраназально вводили ФЛ в дозе 200 мкг/кг (H+LF и H+LF+hCG – группы “ ВЖВУД+ФЛ” и “ ВЖВУД+ФЛ+ХГЧ”) и однократно, подкожно вводили ХГЧ в дозе 15 МЕ/крысу (H+hCG и H+LF+hCG – группы “ВЖВУД+ХГЧ” и “ВЖВУД+ФЛ+ХГЧ”). (b) – Изменение уровня тестостерона в крови у ВЖВУД-крыс, которым в течение трех дней вводили АНТ в дозе 75 мкг/кг (подкожно) и/или ФЛ в дозе 200 мкг/кг (интраназально) (H+ANT – группа “ВЖВУД+АНТ”, H+ANT+LF – группа “ВЖВУД+АНТ+ФЛ”, H+ANT+hCG – группа “ВЖВУД+АНТ+ХГЧ”, H+ANT+LF+hCG – группа “ВЖВУД+АНТ+ФЛ+ХГЧ”) и однократно, подкожно вводили ХГЧ в дозе 15 МЕ/крысу (H+ANT+hCG и H+ANT+LF+hCG). (c) и (d) – Изменение значений AUC_0–270, которые соответствуют площади под кривой зависимости концентрации тестостерона в крови от времени, показанных на диаграммах (a) и (b). (a) и (b): * – отличия от базового уровня тестостерона (0 min) при внутригрупповом сравнении статистически значимы при p < 0.05, C и D: * – отличия от группы “Контроль” (Control), # – отличия от группы “ВЖВУД” (HFHCD), ** – отличия от группы “ВЖВУД+АНТ” (H+ANT) статистически значимы при p < 0.05, M±SEM, n = 6.

 

Рис. 2. Уровни мРНК генов Star и Cyp11a1 в семенниках крыс, получавших ВЖВУД, на фоне введения фрагмента лептина MA-[D-Leu4]-OB3 и/или цетрореликса, а также стимуляции стероидогенеза с помощью ХГЧ.

Образцы тканей семенников были взяты через 270 мин после введения ФЛ и/или АНТ и через 180 мин после введения ХГЧ. (a) – Уровни мРНК гена Star в семенниках ВЖВУД-крыс, которым в течение трех дней интраназально вводили ФЛ в дозе 200 мкг/кг (H+LF и H+LF+hCG – группы “ ВЖВУД+ФЛ” и “ВЖВУД+ФЛ+ХГЧ”) и однократно, подкожно вводили ХГЧ в дозе 15 МЕ/крысу (H+hCG и H+LF+hCG – группы “ВЖВУД+ХГЧ” и “ВЖВУД+ФЛ+ХГЧ”). (b) – Уровни мРНК гена Star в семенниках ВЖВУД-крыс, которым в течение трех дней вводили АНТ в дозе 75 мкг/кг (подкожно) и/или ФЛ в дозе 200 мкг/кг (интраназально) (H+ANT – группа “ВЖВУД+АНТ”, H+ANT+LF – группа “ВЖВУД+АНТ+ФЛ”, H+ANT+hCG – группа “ВЖВУД+АНТ+ХГЧ”, H+ANT+LF+hCG – группа “ВЖВУД+АНТ+ФЛ+ХГЧ”) и однократно, подкожно вводили ХГЧ в дозе 15 МЕ/крысу (H+ANT+hCG и H+ANT+LF+hCG). (c) и (d) – Уровни мРНК гена Cyp11a1 в семенниках ДИО- крыс на фоне введения ФЛ, АНТ, ХГЧ или их комбинаций. Препараты вводили как описано выше. Данные представлены как медиана, максимальное и минимальное значение, n = 6 в каждой группе. * – отличия от группы “Контроль” (Control), # – отличия от группы “ВЖВУД” (HFHCD) статистически значимы при p < 0.05.

 

Рис. 3. Содержание белка рецептора ЛГ (a, b) и иммуногистохимическая реакция к рецептору ЛГ (c) в семенниках крыс, получавших ВЖВУД, на фоне трехдневного введения фрагмента лептина MA-[D-Leu4]-OB3 и/или цетрореликса, а также однократной инъекции ХГЧ.

Образцы тканей семенников были взяты через 270 мин после введения ФЛ и/или АНТ и через 180 мин после введения ХГЧ. (а) – Содержание рецептора ЛГ в семенниках ДИО-крыс, которым в течение трех дней интраназально вводили ФЛ в дозе 200 мкг/кг (H+LF и H+LF+hCG – группы “ ВЖВУД+ФЛ” и “ВЖВУД+ФЛ+ХГЧ”) и однократно, подкожно вводили ХГЧ в дозе 15 МЕ/крысу (H+hCG и H+LF+hCG – группы “ВЖВУД+ХГЧ” и “ ВЖВУД+ФЛ+ХГЧ”). (b) – Содержание рецептора ЛГ в семенниках ДИО-крыс, которым в течение трех дней вводили АНТ в дозе 75 мкг/кг (подкожно) и/или ФЛ в дозе 200 мкг/кг (интраназально) (H+ANT – группа “ВЖВУД+АНТ”, H+ANT+LF – группа “ ВЖВУД+АНТ+ФЛ”, H+ANT+hCG – группа “ВЖВУД+АНТ+ХГЧ”, H+ANT+LF+hCG – группа “ВЖВУД+АНТ+ФЛ+ХГЧ”) и однократно, подкожно вводили ХГЧ в дозе 15 МЕ/крысу (H+ANT+hCG и H+ANT+LF+hCG). (c) – Иммуногистохимическая реакция к рецептору ЛГ в семенниках ДИО-крыс. Масштаб на всех изображениях: 50 мкм. Данные представлены как медиана, максимальное и минимальное значение, n = 6 в каждой группе. * – отличия от группы “Контроль” (Control), # – отличия от группы “ВЖВУД” (HFHCD), ## – отличия от группы “ВЖВУД+АНТ+ХГЧ” (H+ANT+hCG) статистически значимы при p < 0.05.

 

Влияние ФЛ на эффекты ХГЧ на уровень тестостерона в крови, экспрессию генов тестикулярного стероидогенеза и содержание рецептора ЛГ в семенниках ДИО-крыс

Трехдневная интраназальная обработка самцов ДИО-крыс с помощью ФЛ приводила к усилению эффекта ХГЧ на уровень тестостерона в крови. В группе “ВЖВУД+ФЛ+ХГЧ” уровень тестостерона был повышен на 178 % уже через 90 мин после введения ХГЧ, а через 180 мин прирост составил 400 %. В группе “ВЖВУД+ХГЧ” уровень тестостерона повышался на 231 % лишь через 180 мин после однократной инъекции ХГЧ (рис. 1a). Значение AUC_0–270 под концентрационными кривыми для тестостерона в группе “ВЖВУД+ФЛ+ХГЧ” было значимо выше по сравнению с группами “Контроль” и “ВЖВУД” (рис. 1c). Уровень мРНК гена Star в семенниках был на 184 % повышен у крыс, получавших инъекцию ХГЧ на фоне предобработки ФЛ. Трехдневное введение ФЛ вызвало повышение количества белка рецептора ЛГ в семенниках крыс в группах “ ВЖВУД+ФЛ” и “ВЖВУД+ФЛ+ХГЧ” на 128 и 103 %, соответственно, что указывает на полное восстановление содержания этого рецептора, существенно сниженного на фоне ВЖВУД. Сравнивая группы, получавшие однократную инъекцию ХГЧ, необходимо отметить, что предобработка с помощью ФЛ повышала на 115 % содержание рецептора ЛГ в группе “ВЖВУД+ФЛ+ХГЧ” и по сравнению с группой “ВЖВУД+ХГЧ”.

Влияние трехдневного введения антагониста рецептора гонадолиберина на эффекты фрагмента лептина и ХГЧ на уровень тестостерона в крови, экспрессию стероидогенных генов и уровень рецептора ЛГ в семенниках крыс с ДИО

Трехдневное введение АНТ привело к снижению уровня тестостерона в крови в группах “ ВЖВУД+АНТ” и “ВЖВУД+АНТ+ФЛ” на 85 и 90 % спустя 180 мин после третьего введения АНТ. Введение ХГЧ повышало уровень тестостерона на 593 %, а на фоне введения ФЛ эффект ХГЧ усиливался до 714 %. Однако при оценке интегрального показателя AUC_0–270 картина менялась. Так введение АНТ снижало значение AUC_0–270 в группах “ ВЖВУД+АНТ” и “ ВЖВУД+АНТ+ФЛ” на 244 и 229 % соответственно. В группах, получавших ХГЧ, было показано еще более выраженное влияние однократной инъекции ХГЧ на уровень тестостерона на фоне АНТ, которое привело к повышению AUC_0–270 на 211 % по сравнению с группой “ВЖВУД+АНТ” (рис. 1d). Таким образом, введение ФЛ параллельно с АНТ привело к уменьшению прироста значения AUC_0–270 в группе “ВЖВУД+АНТ+ФЛ+ХГЧ” по сравнению с группой “ВЖВУД+АНТ+ХГЧ”.

Введение АНТ привело к снижению уровня мРНК гена Star на 171 и 217 % в группах “ ВЖВУД+АНТ” и “ВЖВУД+АНТ+ФЛ”, соответственно. При этом стимуляция с помощью ХГЧ в равной степени восстанавливала генную экспрессию в группах “ ВЖВУД+АНТ+ХГЧ” и “ ВЖВУД+АНТ+ФЛ+ХГЧ”. Трехдневное введение ФЛ ДИО-крысам снижало экспрессию гена Cyp11a1 на фоне введения АНТ в группах “ ВЖВУД+АНТ+ФЛ” и “ВЖВУД+АНТ+ФЛ+ХГЧ” на 367 и 250 %, соответственно. При этом в группах “ ВЖВУД+АНТ” и “ВЖВУД+АНТ+ХГЧ” такого снижения показано не было. Введение АНТ восстанавливало содержание белка рецептора ЛГ, сниженное при потреблении ВЖВУД, но в группе “ ВЖВУД+АНТ+ФЛ+ХГЧ” прирост содержания белка рецептора ЛГ был на 24 % выше, чем в группе “ВЖВУД+АНТ+ХГЧ”.

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

Для изучения влияния ожирения на метаболические и гормональные дисфункции, как правило, используют модели ДИО, для которых характерны повышение массы тела, увеличение доли жировой ткани, дислипидемия, нарушенная толерантность к глюкозе, сниженная чувствительность к инсулину и лептину [13]. В нашем исследовании ДИО было индуцировано с помощью комбинированной ВЖВУД, которую животные получали в течение 20 недель, начиная с двухмесячного возраста. У крыс, получавших эту диету, имелись выраженные нарушения глюкозного и липидного метаболизма, которые сопровождались повышением доли жировой ткани, инсулиновой и лептиновой резистентностью (табл. 2).

Ожирение, в том числе ассоциированное с сахарным диабетом 2-го типа и метаболическим синдромом, может приводить к ослаблению функциональной активности ГГТ оси у человека, что выражается в снижении уровня тестостерона в крови и нарушении стероидогенеза и сперматогенеза в семенниках [14, 15]. Несмотря на это, грызуны с ДИО, индуцированным с помощью высокожировой диеты и ВЖВУД, не всегда демонстрируют значимые нарушения тестикулярного стероидогенеза, что, по-видимому, связано с видоспецифичными адаптационными возможностями у грызунов разных линий и запуском компенсаторных процессов, позволяющих, по крайней мере, частично восстановить стероидогенный статус [16]. В настоящем исследовании нами не было выявлено существенных изменений уровня тестостерона в крови и экспрессии гена Star, ответственного за первую, скорость-лимитирующую стадию тестикулярного стероидогенеза, у крыс, находящихся на ВЖВУД. В то же время у них было выявлено снижение содержания рецептора ЛГ в семенниках (рис. 3), что может указывать на начальные стадии резистентности семенников к действию эндогенного ЛГ. Ранее сходные результаты были показаны нами у крыс с экспериментальным сахарным диабетом 2-го типа, которые длительное время получали высокожировую диету и однократно обрабатывались стрептозотоцином в дозе 25 мг/кг [12]. В настоящем исследовании в группе “ВЖВУД” нами обнаружено компенсаторное повышение уровня мРНК гена Cyp11a1, кодирующего цитохром P450scc (рис. 2в). Митохондриальный фермент цитохром P450scc катализирует превращение холестерина в прегненолон, что является первой стадией синтеза тестостерона, и это делает этот фермент важнейшим функциональным компонентом системы тестикулярного стероидогенеза [17].

Ранее было установлено, что фрагмент лептина MA-[D-Leu4]-OB3, обладающий основными фармакологическими свойствами полноразмерного лептина, способен снижать уровень глюкозы в крови и нормализовать потребление пищи [8, 10]. Кроме того, ранее нами было показано, что даже однократное введение ФЛ повышало уровень тестостерона в крови у крыс, находящихся на нормальной диете, а трехдневное введение было способно модулировать стероидогенный эффект ХГЧ [11]. В данной работе мы также исследовали способность ФЛ модулировать эффекты ХГЧ на уровень тестостерона в крови крыс с ожирением, вызванном длительной ВЖВУД. В группе “ВЖВУД+ФЛ+ХГЧ” нами был показан более выраженный эффект ХГЧ как по временной динамике, так и по уровню тестостерона в крови. Уже через 90 мин после введения ХГЧ (10 МЕ/крысу) уровень тестостерона повышался, в то время как ДИО-крысы, не получавшие ФЛ, демонстрировали значимое повышение уровня тестостерона только через 180 мин. Кроме того, значение AUC_0–270, представляющее собой интегральную площадь под концентрационными кривыми для тестостерона, в группе “ВЖВУД+ФЛ+ХГЧ” было выше, чем в группе “ВЖВУД+ХГЧ” (рис. 1). Исследование уровня мРНК гена, кодирующего транспортный белок StAR, показало его увеличение в ответ на стимуляцию ХГЧ на фоне обработки ФЛ. Белок StAR осуществляет транспорт холестерина из цитоплазмы в митохондрии, к месту начала синтеза тестостерона [17]. Таким образом, этот этап становится скорость-лимитирующим в тестикулярном стероидогенезе и повышение экспрессии гена Star свидетельствует о стимуляции синтеза тестостерона. Ранее нами не было показано модулирующего эффекта ФЛ на уровень мРНК гена Star у крыс, получавших стандартную диету [11], что может указывать на более выраженное действие ФЛ на тестикулярный стероидогенез у крыс с ДИО. Одним из возможных объяснений более выраженного эффекта ФЛ у самцов крыс, получавших ВЖВУД, может быть развитие у них лептиновой резистентности и центральной лептиновой недостаточности в условиях ожирения [6, 18, 19]. Интраназальное введение ФЛ позволяет доставить препарат непосредственно к гипоталамическим структурам, где в условиях недостатка лептина эффект ФЛ может быть более выраженным [9, 10].

Способность клеток Лейдига семенников сохранять стероидогенную активность связана, в первую очередь, с нормальным функционированием рецепторного аппарата, являющегося мишенью гипофизарного ЛГ. Показанное нами снижение уровня рецептора ЛГ в семенниках ДИО-крыс было полностью компенсировано введением ФЛ в группах “ВЖВУД+ФЛ” и “ВЖВУД+ФЛ+ХГЧ”, что, как мы полагаем, объясняет модулирующий эффект ФЛ на тестикулярный стероидогенез при обработке крыс гонадотропином. Таким образом, нами показано, что ФЛ способен модулировать эффект ХГЧ на уровень тестостерона и экспрессию гена Star в семенниках у крыс с ВЖВУД-индуцированным ожирением, что, по всей видимости, объясняется способностью ФЛ восстанавливать чувствительность клеток Лейдига к гонадотропинам с ЛГ-активностью.

Секретируемый жировой тканью адипокин лептин, как и его фрагмент, используемый в настоящей работе, действуют в первую очередь на POMC- и NPY/AgRP-экспрессирующие нейроны аркуатного ядра гипоталамуса [3, 4]. Помимо ярко выраженного анорексигенного эффекта лептин также опосредованно влияет на GnRH-экспрессирующие нейроны гипоталамуса, стимулируя продукцию кисспептина и меланокортиновых пептидов, активаторов секреции GnRH, и подавляя продукцию NPY и AgRP, ингибирующих секрецию GnRH. Ранее нами было обнаружено, что основной мишенью ФЛ является гипоталамическое звено ГГТ оси [11]. Введение антагониста рецептора GnRH цетрореликса совместно с ФЛ полностью подавляло его модулирующий эффект при стимуляции ХГЧ на уровень тестостерона в крови самцов крыс, получавших стандартную диету. В настоящем исследовании, нами также было показана способность цетрореликса подавлять модулирующий эффект ФЛ как на уровень тестостерона в крови, так и на экспрессию гена Star в семенниках ДИО-крыс. Таким образом, введение антагониста GnRH нивелирует модулирующий эффект ФЛ на тестикулярный стероидогенез у крыс, находящихся на ВЖВУД, что подтверждает полученные нами ранее результаты на животных без ожирения.

Нами показано, что ФЛ на фоне введения АНТ подавляет стимулирующий эффект ХГЧ как на уровень тестостерона в крови, так и на экспрессию гена Cyp11a1 в семенниках крыс, получавших ВЖВУД. Подобный парадоксальный эффект может объясняться периферическими эффектами ФЛ, обусловленными его связыванием с рецепторами лептина, локализованными на поверхности клеток Лейдига. По данным литературы, воздействие лептина на семенники может приводить к разнонаправленным эффектам на тестикулярный стероидогенез и сперматогенез [5], что хорошо соотносятся с нашими результатами.

Таким образом, впервые показано, что миристилированный фрагмент лептина 116–122 MA- [D-Leu4]- OB3 при трехдневном интраназальном введении крысам с ожирением, вызванным ВЖВУД, способен усиливать эффекты ХГЧ на уровень тестостерона в крови, а также на уровень мРНК гена Star в семенниках, и его стимулирующие эффекты обусловлены в основном воздействием на гипоталамические звенья ГГТ оси. Установлено, что в присутствии цетрореликса, антагониста рецептора GnRH, подавляющего активность гонадной оси, выявляются разнонаправленные периферические эффекты ФЛ, которые выражаются, с одной стороны, в подавлении стимулирующего эффекта ХГЧ на уровень тестостерона и экспрессию гена Star и, с другой, в восстановлении уровня рецептора ЛГ в семенниках крыс, сниженном на фоне ВЖВУД. Полученные нами данные указывают на способность ФЛ влиять на различные компоненты мужской гонадной оси в условиях ДИО, а также способствуют более глубокому пониманию роли лептина и его внутриклеточных сигнальных путей во взаимосвязи между метаболическими и гормональными нарушениями при ожирении и сахарном диабете и дисфункциями мужской репродуктивной системы.

СОБЛЮДЕНИЕ ЭТИЧЕСКИХ СТАНДАРТОВ

Все процедуры осуществляли в строгом соответствии с требованиями Комитета по биоэтике ИЭФБ РАН (протокол № 1 от 27.01.2022), “Guide for the Care and Use of Laboratory Animals” и European Communities Council Directive 1986 (86/609/EEC).

ИСТОЧНИКИ ФИНАНСИРОВАНИЯ

Работа выполнена при поддержке Российского научного фонда (проект № 22-75-00130).

КОНФЛИКТ ИНТЕРЕСОВ

Авторы исследования декларируют отсутствие конфликта интересов.

ВКЛАД АВТОРОВ

Идея работы и планирование эксперимента (А.А.Б.), сбор данных (А.А.Б., И.А.Л. и В.С.К., И.Ю.М.), обработка данных (А.А.Б., И.А.Л., В.С.К., И.Ю.М.), написание и редактирование манускрипта (А.А.Б. и А.О.Ш.).

Sobre autores

A. Bakhtyukov

Sechenov Institute of Evolutionary Physiology and Biochemistry of the Russian Academy of Sciences

Autor responsável pela correspondência
Email: bahtyukov@gmail.com
Rússia, St. Petersburg

I. Lebedev

Sechenov Institute of Evolutionary Physiology and Biochemistry of the Russian Academy of Sciences

Email: bahtyukov@gmail.com
Rússia, St. Petersburg

I. Morina

Sechenov Institute of Evolutionary Physiology and Biochemistry of the Russian Academy of Sciences

Email: bahtyukov@gmail.com
Rússia, St. Petersburg

V. Kuznetsova

Sechenov Institute of Evolutionary Physiology and Biochemistry of the Russian Academy of Sciences

Email: bahtyukov@gmail.com
Rússia, St. Petersburg

A. Shpakov

Sechenov Institute of Evolutionary Physiology and Biochemistry of the Russian Academy of Sciences

Email: bahtyukov@gmail.com
Rússia, St. Petersburg

Bibliografia

Arquivos suplementares