Реконструированный эпидермис человека in vitro — модель для фундаментальных и прикладных исследований кожи человека

Обложка

Цитировать

Полный текст

Аннотация

Реконструированный эпидермис человека (РЭ) — тканеинженерная конструкция in vitro, подобная нативному эпидермису.

Цель исследования. Разработать полнослойный РЭ. Охарактеризовать его структуру: определить наличие всех слоев эпидермального компонента, в том числе базального, шиповатого, гранулярного и рогового слоев эпидермиса; детектировать базальную мембрану, границу между эпидермальным и мезенхимальным компонентом.

Материалы и методы. Выделение кератиноцитов и фибробластов из донорской кожи человека. Культивирование кератиноцитов и фибробластов в 2D-условиях in vitro, пересев клеток и формирование 3D-модели РЭ, получение криосрезов, гистологическая окраска, иммуногистохимическое (ИГХ) исследование с антителами к цитокератинам 14 и 10, белку Ki67, лорикрину, ламинину 5 и плектину.

Результаты. Разработана методика формирования РЭ. Гистологическое исследование показало, что при формировании РЭ происходит стратификация слоев кератиноцитов. Формируются слои базальных, шиповатых, гранулярных и ороговевающих кератиноцитов. С помощью ИГХ-исследования показали пролиферативную активность кератиноцитов базального слоя и детектировали наличие белков-маркеров, характерных для кератиноцитов на разных стадиях дифференцировки. Базальные кератиноциты РЭ подобно нативным формируют гемидесмосомы и синтезируют белки базальной мембраны.

Заключение. Получен отвечающий всем характеристикам нативного эпидермиса полнослойный РЭ человека in vitro, пригодный для фундаментальных и практических исследований в области биологии кожи, дерматологии и косметологии.

Об авторах

Аркадий Константинович Бейлин

Институт биологии развития им. Н.К. Кольцова РАН; РНИМУ им. Пирогова

Email: arkadii.beilin@gmail.com
ORCID iD: 0000-0001-9868-5623

аспирант лаборатории клеточной биологии; младший научный сотрудник отдела регенеративной медицины НИИ трансляционной медицины

Россия, Москва

Александра Леонидовна Риппа

Институт биологии развития им. Н.К. Кольцова РАН

Email: rippa86@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0001-7300-8466
ResearcherId: I-2103-2014

к.б.н., научный сотрудник лаборатории клеточной биологии

Россия, Москва

Валентин Ильич Шаробаро

РНИМУ им. Пирогова

Email: sharobarovi@mail.ru

проф. РАН, д.м.н., профессор, профессор кафедры пластической, реконструктивной хирургии, косметологии и клеточных технологий

Россия, Москва

Надежда Георгиевна Гурская

РНИМУ им. Пирогова; Институт биологии развития им. Н.К. Кольцова РАН

Email: ngurskaya@mail.ru

к.б.н., старший научный сотрудник отдела регенеративной медицины НИИ трансляционной медицины; научный сотрудник лаборатории клеточной биологии 

Россия, Москва

Екатерина Андреевна Воротеляк

Институт биологии развития им. Н.К. Кольцова РАН

Автор, ответственный за переписку.
Email: vorotelyak@yandex.ru

чл.-корр. РАН, д.б.н., заведующий лабораторией клеточной биологии

Россия, Москва

Список литературы

  1. Vorotelyak E.A., Tsitrin E.B., Vasiliev A.V., Terskikh V.V. Cultured human keratinocytes retaining label for a long time. Dokl Biol Sci. 2005; 402:221-223. doi: 10.1007/s10630-005-0094-x.
  2. Chermnykh E.S., Vorotelyak E.A., Tkachenko S.B., Vasiliev A.V., Terskikh V.V. Proliferation of K19+ human epidermal keratinocytes in vitro. Dokl Biol Sci. 2007; 416: 406—408. doi: 10.1134/s0012496607050250.
  3. Blanpain C., Fuchs E. Epidermal homeostasis: a balancing act of stem cells in the skin. Nat Rev Mol Cell Biol. 2009; 10 (3): 207—217. doi: 10.1038/nrm2636.
  4. Воротеляк Е.А., Терских В.В. Стволовые клетки эпителиальных тканей. Биология стволовых клеток и клеточные технологии. 2009; 2: 53—74. ISBN 5-225-03377-6. [Vorotelyak E.A., Terskikh V.V. Stem cells of epithelial tissues. Stem cell biology and cell technology. 2009; 2: 53—74.]
  5. Chermnykh E.S., Vorotelyak E.A., Gnedeva K.Y. et al. Dermal papilla cells induce keratinocyte tubulogenesis in culture. Histochem Cell Biol. 2010; 133 (5): 567—576. doi: 10.1007/s00418-010-0691-0.
  6. Terskikh V.V., Vasiliev A.V., Vorotelyak E.A. Label retaining cells and cutaneous stem cells. Stem Cell Rev Rep. 2012; 8 (2): 414—425. doi: 10.1007/s12015-011-9299-6.
  7. Vorotelyak E., Terskikh V., Vasiliev A.V. Epithelial-to-mesenchymal transition in epidermal keratinocytes. Keratinocytes: Structure, Molecular Mechanisms and Role in Immunity. January 2013; 69—107.
  8. Takeo M., Lee W., Ito M. Wound healing and skin regeneration. Cold Spring Harb Perspect Med. 2015; 5 (1): a023267. doi: 10.1101/cshperspect.a023267.
  9. Kalabusheva E.P., Chermnykh E.S., Terskikh V.V., Vorotelyak E.A. Hair Follicle Reconstruction and Stem Cells. Hair and Scalp Disorders. 2017. doi: 10.5772/66707.
  10. Rognoni E., Watt F.M. Skin Cell Heterogeneity in Development, Wound Healing, and Cancer. Trends Cell Biol. 2018; 28 (9): 709—722. doi: 10.1016/j.tcb.2018.05.002.
  11. Potten C.S. The epidermal proliferative unit: the possible role of the central basal cell. Cell Tissue Kinet. 1974; 7 (1): 77—88. doi: 10.1111/j.1365-2184.1974.tb00401.x.
  12. Slack J.M. Stem cells in epithelial tissues. Science. 2000; 287 (5457): 1431—1433. doi: 10.1126/science.287.5457.1431.
  13. Терских В.В., Васильев А.В., Воротеляк Е.А. Структурно-функциональные единицы эпидермиса. Известия РАН. Сер. Биол. 2003; 6: 645—649. [Terskikh V.V., Vasiliev A.V., Vorotelyak E.A. Structural-Functional Units of Epidermis. Biol. Bull. 2003; 30 (6): 535—539 (Russia).]
  14. Kulukian A., Fuchs E. Spindle orientation and epidermal morphogenesis. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 2013; 368 (1629): 20130016. doi: 10.1098/rstb.2013.0016.
  15. Schindelin J., Arganda-Carreras I., Frise E. et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat Methods. 2012; 9 (7): 676—682. doi: 10.1038/nmeth.2019.
  16. Ando M., Kawashima T., Kobayashi H., Ohkawar A. Immunohistological Detection of Proliferating Cells in Normal and Psoriatic Epidermis Using Ki-67 Monoclonal Antibody. J Dermatol Sci. 1990; 1 (6): 441—446. doi: 10.1016/0923-1811(90)90014-5.
  17. Watt F.M. Role of integrins in regulating epidermal adhesion, growth and differentiation. EMBO J. 2002; 21 (15): 3919—26. doi: 10.1093/emboj/cdf399.
  18. Fuchs E., Raghavan S. Getting under the skin of epidermal morphogenesis. Nat Rev Genet. 2002; 3 (3): 199—209. doi: 10.1038/nrg758.
  19. Риппа А.Л., Воротеляк Е.А., Васильев А.В., Терских В.В. Роль интегринов в формировании и гомеостазе эпидермиса и придатков кожи. Acta Naturae. 2013; 5 (4 (19)): 24—36. [Rippa A.L., Vorotelyak E.A., Vasiliev A.V., Terskikh V.V.THE ROLE OF INTEGRINS IN THE DEVELOPMENT AND HOMEOSTASIS OF THE EPIDERMIS AND SKIN APPENDAGES. Acta Naturae 2013. Т. 5. № 4. С. 22—33.]
  20. Vig K., Chaudhari A., Tripathi S., et al. Advances in Skin Regeneration Using Tissue Engineering. Int J Mol Sci. 2017; 18 (4). doi: 10.3390/ijms18040789.
  21. Pedrosa T. do N., Catarino C.M., Pennacchi P.C. et al. A new reconstructed human epidermis for in vitro skin irritation testing. Toxicol In Vitro. 2017; 42: 31—37. doi: 10.1016/j.tiv.2017.03.010.
  22. Kallis P.J., Friedman A.J., Lev-Tov H. A Guide to Tissue-Engineered Skin Substitutes. J Drugs Dermatol. 2018; 17 (1): 57—64.
  23. Rippa A.L., Kalabusheva E.P., Vorotelyak E.A. Regeneration of Dermis: Scarring and Cells Involved. Cells. 2019; 8 (6). doi: 10.3390/cells8060607.
  24. Chermnykh E., Kalabusheva E., Vorotelyak E. Extracellular Matrix as a Regulator of Epidermal Stem Cell Fate. Int J Mol Sci. 2018; 19 (4). doi: 10.3390/ijms19041003.
  25. Алпеева Е.В., Сидоренкова А.Ф., Воротеляк Е.А. Экспериментальные клеточные системы: от органов в чашке Петри до «органов-на-чипах». Вестник Московского ун-та. Серия 16. Биология. 2017. [Alpeeva E.V., Sidorenkova A.F., Vorotelyak E.A. OVERVIEW OF CELL MODELS: FROM ORGANS CULTURED IN A PETRI DISH TO “ORGANS-ON-CHIPS”. Vestnik Moskovskogo universiteta. Seriya 16. Biologiya. 2017;72(4):187—198]
  26. Di W.-L., Larcher F., Semenova E., et al. Ex-vivo gene therapy restores LEKTI activity and corrects the architecture of Netherton syndrome-derived skin grafts. Mol Ther. 2011; 19 (2): 408—416. doi: 10.1038/mt.2010.201.
  27. Takashima S., Shinkuma S., Fujita Y., et al. Efficient Gene Reframing Therapy for Recessive Dystrophic Epidermolysis Bullosa with CRISPR/Cas9. J Invest Dermatol. 2019; 139 (8): 1711—1721. e4. doi: 10.1016/j.jid.2019.02.015.
  28. March O.P., Lettner T., Klausegger A., et al. Gene Editing-Mediated Disruption of Epidermolytic Ichthyosis-Associated KRT10 Alleles Restores Filament Stability in Keratinocytes. J Invest Dermatol. 2019; 139 (8): 1699—1710. e6. doi: 10.1016/j.jid.2019.03.1146.
  29. Woodley D.T., Keene D.R., Atha T., et al. Injection of recombinant human type VII collagen restores collagen function in dystrophic epidermolysis bullosa. Nat Med. 2004; 10 (7): 693—695. doi: 10.1038/nm1063.
  30. Gómez-Grau M., Garrido E., Cozar M. et al. Evaluation of Aminoglycoside and Non-Aminoglycoside Compounds for Stop-Codon Readthrough Therapy in Four Lysosomal Storage Diseases. PLoS One. 2015; 10 (8). doi: 10.1371/journal.pone.0135873.
  31. Matalonga L., Arias Á., Tort F. et al. Effect of Readthrough Treatment in Fibroblasts of Patients Affected by Lysosomal Diseases Caused by Premature Termination Codons. Neurotherapeutics. 2015; 12 (4): 874—886. doi: 10.1007/s13311-015-0368-4.
  32. Woodley D.T., Cogan J., Hou Y. et al. Gentamicin induces functional type VII collagen in recessive dystrophic epidermolysis bullosa patients. J Clin Invest. 2017; 127 (8): 3028—3038. doi: 10.1172/JCI92707.
  33. Lincoln V., Cogan J., Hou Y. et al. Gentamicin induces LAMB3 nonsense mutation readthrough and restores functional laminin 332 in junctional epidermolysis bullosa. Proc Natl Acad Sci USA. 2018; 115 (28): E6536—E6545. doi: 10.1073/pnas.1803154115.
  34. Yuki T., Tobiishi M., Kusaka-Kikushima A., Ota Y., Tokura Y. Impaired Tight Junctions in Atopic Dermatitis Skin and in a Skin-Equivalent Model Treated with Interleukin-17. PLoS ONE. 2016; 11 (9): e0161759. doi: 10.1371/journal.pone.0161759.
  35. Barker C.L., McHale M.T., Gillies A.K. et al. The development and characterization of an in vitro model of psoriasis. J Invest Dermatol. 2004; 123 (5): 892—901. doi: 10.1111/j.0022-202X.2004.23435.x.
  36. Jung J.P., Lin W.-H., Riddle M.J., Tolar J., Ogle B.M. A 3D in vitro model of the dermoepidermal junction amenable to mechanical testing. J Biomed Mater Res A. 2018; 106 (12): 3231—3238. doi: 10.1002/jbm.a.36519.
  37. Swope V.B., Supp A.P., Schwemberger S., Babcock G., Boyce S. Increased expression of integrins and decreased apoptosis correlate with increased melanocyte retention in cultured skin substitutes. Pigment Cell Res. 2006; 19 (5): 424—433. doi: 10.1111/j.1600-0749.2006.00325.x.
  38. Nissan X., Larribere L., Saidani M., et al. Functional melanocytes derived from human pluripotent stem cells engraft into pluristratified epidermis. Proc Natl Acad Sci USA. 2011; 108 (36): 14861—14866. doi: 10.1073/pnas.1019070108.
  39. Facy V., Flouret V., Régnier M., Schmidt R. Reactivity of Langerhans cells in human reconstructed epidermis to known allergens and UV radiation. Toxicol In Vitro. 2005; 19 (6): 787—795. doi: 10.1016/j.tiv.2005.03.018.
  40. Meier F., Nesbit M., Hsu M.Y., et al. Human melanoma progression in skin reconstructs : biological significance of bFGF. Am J Pathol. 2000; 156 (1): 193—200. doi: 10.1016/S0002-9440(10)64719-0.
  41. Kiesewetter L., Littau L., Walles H., Boccaccini A.R., Groeber-Becker F. Reepithelialization in focus: Non-invasive monitoring of epidermal wound healing in vitro. Biosens Bioelectron. 2019; 142:111555. doi: 10.1016/j.bios.2019.111555.
  42. Netzlaff F., Lehr C.-M., Wertz P.W., Schaefer U.F. The human epidermis models EpiSkin, SkinEthic and EpiDerm: an evaluation of morphology and their suitability for testing phototoxicity, irritancy, corrosivity, and substance transport. Eur J Pharm Biopharm. 2005; 60 (2): 167—178. doi: 10.1016/j.ejpb.2005.03.004.
  43. Chakrabarty K.H., Heaton M., Dalley A.J., et al. Keratinocyte-driven contraction of reconstructed human skin. Wound Repair Regen. 2001; 9 (2): 95—106. doi: 10.1046/j.1524-475x.2001.00095.x.
  44. Portes P., Pygmalion M.J., Popovic E., Cottin M., Mariani M. Use of human reconstituted epidermis Episkin for assessment of weak phototoxic potential of chemical compounds. Photodermatol Photoimmunol Photomed. 2002; 18 (2): 96—102. doi: 10.1034/j.1600-0781.2002.180207.x.
  45. Чаплин А.В., Ребриков Д.В., Болдырева М.Н. Микробиом Человека. Вестник Росс. гос. мед. ун-та. 2017; (2): 5—13. [Chaplin AV, Rebrikov DV, Boldyreva MN. The human microbiome. Bulletin of RSMU. 2017; (2): 5–13. doi: 10.24075/brsmu.2017-02-01]
  46. Hoffmann J., Heisler E., Karpinski S. et al. Epidermal-skin-test 1,000 (EST-1,000)--a new reconstructed epidermis for in vitro skin corrosivity testing. Toxicol In Vitro. 2005; 19 (7): 925—929. doi: 10.1016/j.tiv.2005.06.010.
  47. Jung K.-M., Lee S.-H., Jang W.-H. et al. KeraSkin-VM: a novel reconstructed human epidermis model for skin irritation tests. Toxicol In Vitro. 2014; 28 (5): 742—750. doi: 10.1016/j.tiv.2014.02.014.

Дополнительные файлы

Доп. файлы
Действие
1. JATS XML
Скачать
2. Рис. 1. Структура эпидермиса: А — РЭ, Б — кожа человека (1 — базальный слой; 2 — шиповатый слой; 3 — гранулярный слой; 4 — роговой слой). Окраска гематоксилином и эозином, ×400

Скачать (108KB)
Метаданные
3. Рис. 2. Пролиферация базальных клеток в РЭ: А — РЭ, Б — кожа человека. Стрелка указывает на пролиферирующие ядра. ИГХ-исследование, ×400

Скачать (88KB)
Метаданные
4. Рис. 3. Идентификация зоны базальной мембраны и гемидесмосом в РЭ: Экспрессия ламинина 5 (А, А', Б). Экспрессия плектина (В, В', Г). А, А', В, В' — РЭ; Б, Г — кожа человека. ИГХ-исследование, ×400. Положительные по маркерам зоны окрашены коричневым

Скачать (74KB)
Метаданные
5. Рис. 4. Дифференциация и стратификация эпидермиса в РЭ: Экспрессия цитокератина 14 (А, Г); цитокератина 10 (Б, Д); лорикриина (В, Е). А, Б, В — РЭ; Г, Д, Е — кожа человека. ИГХ-исследование, ×400. Положительные по маркерам зоны окрашены коричневым

Скачать (597KB)
Метаданные
6. Схема 1. Строение эпидермиса [14]

Скачать (229KB)
Метаданные
7. Схема 2. Процесс создания 3D РЭ

Скачать (307KB)
Метаданные
8. Схема 3. Сферы применения модели РЭ

Скачать (358KB)
Метаданные

© Бейлин А.К., Риппа А.Л., Шаробаро В.И., Гурская Н.Г., Воротеляк Е.А., 2020

Creative Commons License
Эта статья доступна по лицензии Creative Commons Attribution 4.0 International License.

Согласие на обработку персональных данных с помощью сервиса «Яндекс.Метрика»

1. Я (далее – «Пользователь» или «Субъект персональных данных»), осуществляя использование сайта https://journals.rcsi.science/ (далее – «Сайт»), подтверждая свою полную дееспособность даю согласие на обработку персональных данных с использованием средств автоматизации Оператору - федеральному государственному бюджетному учреждению «Российский центр научной информации» (РЦНИ), далее – «Оператор», расположенному по адресу: 119991, г. Москва, Ленинский просп., д.32А, со следующими условиями.

2. Категории обрабатываемых данных: файлы «cookies» (куки-файлы). Файлы «cookie» – это небольшой текстовый файл, который веб-сервер может хранить в браузере Пользователя. Данные файлы веб-сервер загружает на устройство Пользователя при посещении им Сайта. При каждом следующем посещении Пользователем Сайта «cookie» файлы отправляются на Сайт Оператора. Данные файлы позволяют Сайту распознавать устройство Пользователя. Содержимое такого файла может как относиться, так и не относиться к персональным данным, в зависимости от того, содержит ли такой файл персональные данные или содержит обезличенные технические данные.

3. Цель обработки персональных данных: анализ пользовательской активности с помощью сервиса «Яндекс.Метрика».

4. Категории субъектов персональных данных: все Пользователи Сайта, которые дали согласие на обработку файлов «cookie».

5. Способы обработки: сбор, запись, систематизация, накопление, хранение, уточнение (обновление, изменение), извлечение, использование, передача (доступ, предоставление), блокирование, удаление, уничтожение персональных данных.

6. Срок обработки и хранения: до получения от Субъекта персональных данных требования о прекращении обработки/отзыва согласия.

7. Способ отзыва: заявление об отзыве в письменном виде путём его направления на адрес электронной почты Оператора: info@rcsi.science или путем письменного обращения по юридическому адресу: 119991, г. Москва, Ленинский просп., д.32А

8. Субъект персональных данных вправе запретить своему оборудованию прием этих данных или ограничить прием этих данных. При отказе от получения таких данных или при ограничении приема данных некоторые функции Сайта могут работать некорректно. Субъект персональных данных обязуется сам настроить свое оборудование таким способом, чтобы оно обеспечивало адекватный его желаниям режим работы и уровень защиты данных файлов «cookie», Оператор не предоставляет технологических и правовых консультаций на темы подобного характера.

9. Порядок уничтожения персональных данных при достижении цели их обработки или при наступлении иных законных оснований определяется Оператором в соответствии с законодательством Российской Федерации.

10. Я согласен/согласна квалифицировать в качестве своей простой электронной подписи под настоящим Согласием и под Политикой обработки персональных данных выполнение мною следующего действия на сайте: https://journals.rcsi.science/ нажатие мною на интерфейсе с текстом: «Сайт использует сервис «Яндекс.Метрика» (который использует файлы «cookie») на элемент с текстом «Принять и продолжить».