Коамплификация участков генома Mycobacterium leprae методом ПЦР в реальном времени: обнаружение возбудителя и возможность полуколичественной оценки бактериальной нагрузки

Обложка

Цитировать

Полный текст

Аннотация

Цель исследования. Разработка метода коамплификации однокопийных генов и повторяющихся элементов генома Mycobacterium leprae при анализе клинического материала от больных лепрой с оценкой клинической значимости результатов подобного исследования.
Материалы и методы. Материалом для исследования явились образцы скарификатов и биоптатов кожи от больной Р. с диагнозом «А30.5 Лепра. Мультибациллярная форма. Лепроматозный тип. Активная стадия». Поиск ДНК M. leprae в клиническом материале проводили методом ПЦР в реальном времени (РТ-ПЦР) с использованием праймеров и гидролизуемых зондов к однокопийным видоспецифичным генам rpoB (кодирует β-субъединицу бактериальной РНК-полимеразы), sodA (кодирует фермент супероксиддисмутазу) и mntH (кодирует белок марганцевый транспортер), а также некодирующему многокопийному элементу генома — RLEP.
Результаты. С использованием различных вариантов РТ-ПЦР получен согласующийся результат о присутствии или отсутствии ДНК M. leprae в отдельных исследованных клинических образцах. Подтверждена высокая чувствительность ПЦР-детекции многокопийного элемента генома RLEP в сравнении с однокопийными генами rpoB, sodA и mntH, заключающаяся в уменьшении количества циклов амплификации (Ct), необходимых для превышения порогового уровня флуоресценции гидролизующихся зондов, и приводящая к максимальной интенсивности сигнала флуоресценции. При построении стандартных графиков калибровки накопления флуоресцентного сигнала к одновременно анализируемым участкам генома M. leprae в разведениях от 1 до 1000 продемонстрированы четкие различия результатов коамплификации в зависимости от количественного присутствия детектируемой ДНК.
Выводы. Коамплификация участков генома M.leprae с разной степенью копийности методом РТ-ПЦР обеспечивает эффективную детекцию ДНК возбудителя лепры в клиническом материале и формирует основу для полуколичественной оценки бактериальной нагрузки в кожных биоптатах и скарификатах.

Об авторах

Д. А. Вербенко

Государственный научный центр дерматовенерологии и косметологии
Министерства здравоохранения Российской Федерации

Автор, ответственный за переписку.
Email: verbenko@gmail.com
ORCID iD: 0000-0002-1104-7694
к.б.н., и. о. заведующего отделом лабораторной диагностики ИППП и дерматозов 

107076, Российская Федерация, г. Москва, ул. Короленко, д. 3, стр. 6 Россия

А. Э. Карамова

Государственный научный центр дерматовенерологии и косметологии
Министерства здравоохранения Российской Федерации

Email: fake@neicon.ru
ORCID iD: 0000-0003-3805-8489
к.м.н., заведующий отделом дерматологии 

107076, Российская Федерация, г. Москва, ул. Короленко, д. 3, стр. 6 Россия

В. С. Соломка

Государственный научный центр дерматовенерологии и косметологии
Министерства здравоохранения Российской Федерации

Email: fake@neicon.ru
ORCID iD: 0000-0002-6841-8599
д.б.н., заместитель директора по научной работе 

107076, Российская Федерация, г. Москва, ул. Короленко, д. 3, стр. 6 Россия

А. А. Кубанов

Государственный научный центр дерматовенерологии и косметологии
Министерства здравоохранения Российской Федерации

Email: fake@neicon.ru
ORCID iD: 0000-0002-7625-0503

д.м.н., профессор, член-корреспондент РАН, и. о. директора 

107076, Российская Федерация, г. Москва, ул. Короленко, д. 3, стр. 6

Россия

Д. Г. Дерябин

Государственный научный центр дерматовенерологии и косметологии
Министерства здравоохранения Российской Федерации
107076, Российская Федерация, г. Москва, ул. Короленко, д. 3, стр. 6

Email: fake@neicon.ru
ORCID iD: 0000-0002-2495-6694
д.б.н., ведущий научный сотрудник отдела лабораторной диагностики ИППП и дерматозов 

107076, Российская Федерация, г. Москва, ул. Короленко, д. 3, стр. 6 Россия

Список литературы

  1. Fischer M. Leprosy — an overview of clinical features, diagnosis, and treatment. J Dutsch Dermatol Ges. 2017;15(8):801–827.
  2. Ridley D. S., Jopling W. H. Classification of leprosy according to immunity. A five-group system. Int J Lepr Other Mycobact Dis. 1966;34(3):255–273.
  3. МКБ 10 — Международная классификация болезней 10-го пересмотра. Версия: 2019. https://mkb-10.com/index.php?pid=174
  4. World Health Organization. Regional Office for South-East Asia, Global Leprosy Programme. Global leprosy strategy 2016–2020: monitoring and evaluation guide accelerating towards a leprosy-free world. New Delhi: WHO Regional Office for South East Asia; 2017. http://apps.who.int/iris/bitstream/handle/10665/254907/9789290225492
  5. Образцова О. А. Молекулярно-биологические методы исследования в лабораторной диагностике лепры: эпидемиологический анализ, генетические детерминанты резистентности к антимикробным препаратам. Вестник дерматологии и венерологии. 2017;6:34–40.
  6. Cho S. N., Yanagihara D. L., Hunter S. W., Gelber R.H., Brennan P. J. Serological specificity of phenolic glycolipid 1 from M. leprae and use in serodiagnosis of leprosy. Infect Immun. 1983;41(3):1077–1083.
  7. Duthie M. S., Balagon M. F., Maghanoy A., Orcullo F. M., Cang M., Dias R. F. et al. Rapid quantitative serological test for detection of infection with Mycobacterium leprae, the causative agent of leprosy. J Clin Microbiol. 2014:52(2):613–619.
  8. Fujiwara T., Hunter S. W., Cho S. N., Aspinall G. O., Brennan P. J. Chemical synthesis and serology of the disaccharides and trisaccharides of phenolic glycolipid antigen from leprosy bacillus and preparation of a disaccharide protein conjugate for serodiagnosis of leprosy. Infect Immun. 1984;43(1):245–252.
  9. Santos A. R., De Miranda A. B., Sarno E. N., Suffys P. N., Degrave W. M. Use of PCR-mediated amplification of Mycobacterium leprae DNA in different types of clinical samples for the diagnosis of leprosy. J Med Microbiol. 1993;39(4):298–304.
  10. Martinez A. N., Talhari C., Moraes M. O., Talhari S. PCR-based techniques for leprosy diagnosis. From the laboratory to the clinic. PLoS Negl Trop Dis. 2014;8(4):e2655. doi: 10.1371/journal.pntd.0002655
  11. Pathak V. K., Singh I., Turankar R. P., Lavania M., Ahuja M., Singh V. et al. Utility of multiplex PCR for early diagnosis and household contact surveillance for leprosy. Diagn Microbiol Infect Dis. 2019;95(3):114855. doi: 10.1016/j.diagmicrobio.2019.06.0078
  12. Turankar R. P., Pandey S., Lavania M., Singh I., Nigam A., Darlong J. et al. Comparative evaluation of PCR amplification of RLEP, 16S rRNA, rpoT and SodA gene targets for detection of Mycobacterium leprae DNA from clinical and environmental samples. Int J Mycobacteriol. 2015;4(1):54–59.
  13. Azevedo M. C., Ramuno N. M., Fachin L. R., Tassa M., Rosa P. S., Belone A. F. et al. qPCR detection of Mycobacterium leprae in biopsies and slit skin smear of different leprosy clinical forms. Braz J Infect Dis. 2017;21(1):71–78. doi: 10.1016/j.bjid.2016.09.017
  14. Образцова О. А., Вербенко Д. А., Карамова А. Э., Семенова В. Г., Кубанов А. А., Дерябин Д. Г. Совершенствование ПЦР-диагностики лепры путем амплификации видоспецифичного повторяющегося фрагмента генома Mycobacterium leprae. Клиническая лабораторная диагностика. 2018;63(8):511–516. doi: 10.18821/0869-2084-2018-63-8-511-516
  15. Woods S. A., Cole S. T. A family of dispersed repeats in Mycobactenium leprae. Mol Microbiol. 1990;4:1745–1751.
  16. Martinez A. N., Lahiri R., Pittman T. L., Scollard D., Truman R., Moraes M.O. et al. Molecular determination of Mycobacterium leprae viability by use of real-time PCR. J Clin Microbiol. 2009;47(7):2124–2130.
  17. Chaitanya V. S., Cuello L., Das M., Sudharsan A., Ganesan P., Kanmani K. et al. Analysis of a novel multiplex polymerase chain reaction assay as a sensitive tool for the diagnosis of indeterminate and tuberculoid forms of leprosy. Int J Mycobacteriol. 2017;6(1):1–8.
  18. Banerjee S., Sarkar K., Gupta S., Mahapatra P. S., Gupta S., Guha S. et al. Multiplex PCR technique could be an alternative approach for early detection of leprosy among close contacts: a pilot study from India. BMC Infect Dis. 2010;10:252.

Дополнительные файлы

Доп. файлы
Действие
1. JATS XML
Скачать

© Вербенко Д.А., Карамова А.Э., Соломка В.С., Кубанов А.А., Дерябин Д.Г., 2019

Creative Commons License
Эта статья доступна по лицензии Creative Commons Attribution 4.0 International License.

Согласие на обработку персональных данных с помощью сервиса «Яндекс.Метрика»

1. Я (далее – «Пользователь» или «Субъект персональных данных»), осуществляя использование сайта https://journals.rcsi.science/ (далее – «Сайт»), подтверждая свою полную дееспособность даю согласие на обработку персональных данных с использованием средств автоматизации Оператору - федеральному государственному бюджетному учреждению «Российский центр научной информации» (РЦНИ), далее – «Оператор», расположенному по адресу: 119991, г. Москва, Ленинский просп., д.32А, со следующими условиями.

2. Категории обрабатываемых данных: файлы «cookies» (куки-файлы). Файлы «cookie» – это небольшой текстовый файл, который веб-сервер может хранить в браузере Пользователя. Данные файлы веб-сервер загружает на устройство Пользователя при посещении им Сайта. При каждом следующем посещении Пользователем Сайта «cookie» файлы отправляются на Сайт Оператора. Данные файлы позволяют Сайту распознавать устройство Пользователя. Содержимое такого файла может как относиться, так и не относиться к персональным данным, в зависимости от того, содержит ли такой файл персональные данные или содержит обезличенные технические данные.

3. Цель обработки персональных данных: анализ пользовательской активности с помощью сервиса «Яндекс.Метрика».

4. Категории субъектов персональных данных: все Пользователи Сайта, которые дали согласие на обработку файлов «cookie».

5. Способы обработки: сбор, запись, систематизация, накопление, хранение, уточнение (обновление, изменение), извлечение, использование, передача (доступ, предоставление), блокирование, удаление, уничтожение персональных данных.

6. Срок обработки и хранения: до получения от Субъекта персональных данных требования о прекращении обработки/отзыва согласия.

7. Способ отзыва: заявление об отзыве в письменном виде путём его направления на адрес электронной почты Оператора: info@rcsi.science или путем письменного обращения по юридическому адресу: 119991, г. Москва, Ленинский просп., д.32А

8. Субъект персональных данных вправе запретить своему оборудованию прием этих данных или ограничить прием этих данных. При отказе от получения таких данных или при ограничении приема данных некоторые функции Сайта могут работать некорректно. Субъект персональных данных обязуется сам настроить свое оборудование таким способом, чтобы оно обеспечивало адекватный его желаниям режим работы и уровень защиты данных файлов «cookie», Оператор не предоставляет технологических и правовых консультаций на темы подобного характера.

9. Порядок уничтожения персональных данных при достижении цели их обработки или при наступлении иных законных оснований определяется Оператором в соответствии с законодательством Российской Федерации.

10. Я согласен/согласна квалифицировать в качестве своей простой электронной подписи под настоящим Согласием и под Политикой обработки персональных данных выполнение мною следующего действия на сайте: https://journals.rcsi.science/ нажатие мною на интерфейсе с текстом: «Сайт использует сервис «Яндекс.Метрика» (который использует файлы «cookie») на элемент с текстом «Принять и продолжить».