Comparison of bioinformatic methods and databases for metabarcoding of Lactobacillus starter cultures

Cover Page

Cite item

Full Text

Abstract

Next-generation sequencing methods allow to fully characterize the qualitative composition of microbiota in fermented foods such as yoghurts and kefirs. However, to properly use high-throughput sequencing for food composition analysis, it is necessary to find out the optimal combination of bioinformatics software and database. In our study, we aimed to characterize the microbiota composition of fermented dairy products using high-throughput sequencing and to analyze how the choice of software affects the obtained data. We sequenced 7 samples of fermented dairy product metagenomes to compare the composition and identify the main components. Reads obtained from sequencing the 16S rRNA gene region of 7 fermented dairy samples were analyzed using BLASTN against the NCBI 16S Microbial database, as well as MEGAN and MG-RAST. Mixtures of generated pseudoreads from “mixtures” of Lactococcus lactis, Levilactobacillus brevis, Lactobacillus kefiri and Leuconostoc mesenteroides species were also analyzed. The bioinformatics tools used differ in their applicability depending on the acceptable error level. BLASTN without binning allows for species-level identification of samples that MEGAN and MG-RAST only identify up to the genus level, but at the same time allows for more false positive errors when using different databases with incorrectly identified reference sequences. Thus, further identification of the bacterial composition of fermented milk products requires the creation of a curated database for correct identification up to the species level.

About the authors

E. A. Konorov

Gorbatov Federal Research Center for Food Systems; Vavilov Institute of General Genetics, Russian Academy of Sciences

Email: casqy@yandex.ru
Moscow, Russia; Moscow, Russia

D. V. Khvostov

Gorbatov Federal Research Center for Food Systems

Email: casqy@yandex.ru
Moscow, Russia

M. Yu. Minaev

Gorbatov Federal Research Center for Food Systems

Author for correspondence.
Email: casqy@yandex.ru
Moscow, Russia

References

  1. Шеховцов С.В., Шеховцова И.Н., Пельтек С.Е. ДНК- штрихкодирование: методы и подходы // Успехи соврем. биол. 2019. Т. 139 (3). С. 211–220.
  2. Adiloğlu A.K., Gönülateş N., Işler M., Senol A. The effect of kefir consumption on human immune system: a cytokine study // Mikrobiyoloji bulteni. 2013. V. 47 (2). P. 273–281.
  3. de Andrade G.R., Neves I.V., Marques V.D. et al. Influence of a kefir-derived antimicrobial fraction on Zika virus cytopathic effects and lymphocyte proliferation // J. Virol. Curr. Res. 2017. V. 2. P. 555584.
  4. Brasil G.A., de Almeida Silva-Cutini M., Moraes F.D.S.A. et al. The benefits of soluble non-bacterial fraction of kefir on blood pressure and cardiac hypertrophy in hypertensive rats are mediated by an increase in baroreflex sensitivity and decrease in angiotensin-converting enzyme activity // Nutrition. 2018. V. 51. P. 66–72.
  5. Dobson A., O’Sullivan O., Cotter P.D. et al. High-throughput sequence-based analysis of the bacterial composition of kefir and an associated kefir grain // FEMS Microbiol. Lett. 2011. V. 320 (1). P. 56–62.
  6. Ellatif S.A., Abdel Razik E.S., Abu-Serie M.M. et al. Immunomodulatory efficacy-mediated anti-HCV and anti-HBV potential of kefir grains; unveiling the in vitro antibacterial, antifungal, and wound healing activities // Molecules. 2022. V. 27 (6). P. 2016.
  7. Endo A., Okada S. Lactobacillus farraginis sp. nov. and Lactobacillus parafarraginis sp. nov., heterofermentative lactobacilli isolated from a compost of distilled shochu residue // Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 2007. V. 57 (4). P. 708–712.
  8. Ferchichi M., Valcheva R., Prévost H. et al. Rapid identification of Lactobacillus nantensis, Lactobacillus spicheri and Lactobacillus hammesii species using species-specific primers // Int. J. Food Microbiol. 2008. V. 123 (3). P. 269–276.
  9. Fujiwara M., Kuwahara D., Hayashi M. et al. Lowering effect of viable Pediococcus pentosaceus QU 19 on the rise in postprandial glucose // Biosci. Microb. Food Health. 2020. V. 39 (2). P. 57–64.
  10. Gao J., Gu F., He J. et al. Metagenome analysis of bacterial diversity in Tibetan kefir grains // Eur. Food Res. Technol. 2013. V. 236. P. 549–556.
  11. Hamida R.S., Shami A., Ali M.A. et al. Kefir: a protective dietary supplementation against viral infection // Biomed. Pharmacother. 2021. V. 133. P. 110974.
  12. Hong S.H., Bunge J., Leslin C. et al. Polymerase chain reaction primers miss half of rRNA microbial diversity // ISME J. 2009. V. 3 (12). P. 1365–1373.
  13. Huson D.H., Auch A.F., Qi J., Schuster S.C. MEGAN analysis of metagenomic data // Gen. Res. 2007. V. 17 (3). P. 377–386.
  14. Korsak N., Taminiau B., Leclercq M. et al. Evaluation of the microbiota of kefir samples using metagenetic analysis targeting the 16S and 26S ribosomal DNA fragments // J. Dairy Sci. 2015. V. 98 (6). P. 3684–3689.
  15. Li H., Durbin R. Fast and accurate short read alignment with Burrows–Wheeler transform // Bioinformatics. 2009. V. 25 (14). P. 1754–1760.
  16. Lindgreen S., Adair K.L., Gardner P.P. An evaluation of the accuracy and speed of metagenome analysis tools // Sci. Rep. 2016. V. 6 (1). P. 19233.
  17. Macori G., Cotter P.D. Novel insights into the microbiology of fermented dairy foods // Curr. Opin. Biotechnol. 2018. V. 49. P. 172–178.
  18. Mande S.S., Mohammed M.H., Ghosh T.S. Classification of metagenomic sequences: methods and challenges // Brief. Bioinform. 2012. V. 13 (6). P. 669–681.
  19. Marsh A.J., O’Sullivan O., Hill C. et al. Sequencing-based analysis of the bacterial and fungal composition of kefir grains and milks from multiple sources // PLoS One. 2013. V. 8 (7). P. e69371.
  20. de Melo Pereira G.V., de Carvalho Neto D.P., Maske B.L. et al. An updated review on bacterial community composition of traditional fermented milk products: what next-generation sequencing has revealed so far? // Crit. Rev. Food Sci. Nutr. 2022. V. 62 (7). P. 1870–1889.
  21. Meola M., Rifa E., Shani N. et al. DAIRYdb: a manually curated reference database for improved taxonomy annotation of 16S rRNA gene sequences from dairy products // BMC Genom. 2019. V. 20. P. 1–16.
  22. Meyer F., Paarmann D., D’Souza M. et al. The metagenomics RAST server – a public resource for the automatic phylogenetic and functional analysis of metagenomes // BMC Bioinform. 2008. V. 9. P. 1–8.
  23. Nalbantoglu U., Cakar A., Dogan H. et al. Metagenomic analysis of the microbial community in kefir grains // Food Microbiol. 2014. V. 41. P. 42–51.
  24. O’Rourke D.R. Bokulich N.A., Jusino M.A. et al. A total crapshoot? Evaluating bioinformatic decisions in animal diet metabarcoding analyses // Ecol. Evol. 2020. V. 10 (18). P. 9721–9739.
  25. Ounit R., Wanamaker S., Close T.J., Lonardi S. CLARK: fast and accurate classification of metagenomic and genomic sequences using discriminative k-mers // BMC Genomics. 2015. V. 16. P. 1–13.
  26. Palmnäs-Bédard M., de Santa Izabel A., Dicksved J., Landberg R. Characterization of the bacterial composition of 47 fermented foods in Sweden // Foods. 2023. V. 12 (20). P. 3827.
  27. Patuzzi I., Baruzzo G., Losasso C. et al. metaSPARSim: a 16S rRNA gene sequencing count data simulator // BMC Bioinform. 2019. V. 20. P. 1–13.
  28. Portik D.M., Brown C.T., Pierce-Ward N.T. Evaluation of taxonomic classification and profiling methods for long-read shotgun metagenomic sequencing datasets // BMC Bioinform. 2022. V. 23 (1). P. 541.
  29. Ramesh M., Sen A., Vachher M., Nigam A. Delineating bacteria using DNA barcoding // Mol. Genet. Microbiol. Virol. 2021. V. 36 (1). P. S65–S73.
  30. Seshadri R., Kravitz S.A., Smarr L. et al. CAMERA: a community resource for metagenomics // PLoS Biol. 2007. V. 5 (3). P. e75.
  31. da Silva Ghizi A.C., de Almeida Silva M., de Andrade Moraes F.S. et al. Kefir improves blood parameters and reduces cardiovascular risks in patients with metabolic syndrome // PharmaNutrition. 2021. V. 16 (1). P. 100266.
  32. Syromyatnikov M.Yu., Grabovich M.Yu. Study of the microbiological composition of dairy products and mayonnaise using DNA barcoding and metabarcoding // Foods Raw Mater. 2018. V. 6 (1). P. 144–153.
  33. Tenorio-Salgado S., Castelán-Sánchez H.G., Dávila-Ramos S. et al. Metagenomic analysis and antimicrobial activity of two fermented milk kefir samples // MicrobiologyOpen. 2021. V. 10 (2). P. e1183.
  34. Vinderola G., Perdigon G., Duarte J., et al. Effects of kefir fractions on innate immunity // Immunobiology. 2006. V. 211 (3). P. 149–156.
  35. Wang X., Xiao J., Jia Y. et al. Lactobacillus kefiranofaciens, the sole dominant and stable bacterial species, exhibits distinct morphotypes upon colonization in Tibetan kefir grains // Heliyon. 2018. V. 4 (6). P. e00649.
  36. Wood D.E., Salzberg S.L. Kraken: ultrafast metagenomic sequence classification using exact alignments // Gen. Biol. 2014. V. 15. P. 1–12.
  37. Yu Z., Du F., Ban R., Zhang Y. SimuSCoP: reliably simulate Illumina sequencing data based on position and context dependent profiles // BMC Bioinform. 2020. V. 21. P. 1–18.
  38. Yun S.I., Park H.O., Kang J.H. Effect of Lactobacillus gasseri BNR17 on blood glucose levels and body weight in a mouse model of type 2 diabetes // J. Appl. Microbiol. 2009. V. 107 (5). P. 1681–1686.
  39. Zamberi N.R., Mohamad N.E., Yeap S.K. et al. 16S meta- genomic microbial composition analysis of kefir grain using MEGAN and BaseSpace // Food Biotechnol. 2016. V. 30 (3). P. 219–230.
  40. Zheng J., Wittouck S., Salvetti E. et al. A taxonomic note on the genus Lactobacillus: description of 23 novel genera, emended description of the genus Lactobacillus Beijerinck 1901, and union of Lactobacillaceae and Leuconostocaceae // Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 2020. V. 70 (4). P. 2782–2858.

Supplementary files

Supplementary Files
Action
1. JATS XML
Download

Copyright (c) 2025 Russian Academy of Sciences

Согласие на обработку персональных данных с помощью сервиса «Яндекс.Метрика»

1. Я (далее – «Пользователь» или «Субъект персональных данных»), осуществляя использование сайта https://journals.rcsi.science/ (далее – «Сайт»), подтверждая свою полную дееспособность даю согласие на обработку персональных данных с использованием средств автоматизации Оператору - федеральному государственному бюджетному учреждению «Российский центр научной информации» (РЦНИ), далее – «Оператор», расположенному по адресу: 119991, г. Москва, Ленинский просп., д.32А, со следующими условиями.

2. Категории обрабатываемых данных: файлы «cookies» (куки-файлы). Файлы «cookie» – это небольшой текстовый файл, который веб-сервер может хранить в браузере Пользователя. Данные файлы веб-сервер загружает на устройство Пользователя при посещении им Сайта. При каждом следующем посещении Пользователем Сайта «cookie» файлы отправляются на Сайт Оператора. Данные файлы позволяют Сайту распознавать устройство Пользователя. Содержимое такого файла может как относиться, так и не относиться к персональным данным, в зависимости от того, содержит ли такой файл персональные данные или содержит обезличенные технические данные.

3. Цель обработки персональных данных: анализ пользовательской активности с помощью сервиса «Яндекс.Метрика».

4. Категории субъектов персональных данных: все Пользователи Сайта, которые дали согласие на обработку файлов «cookie».

5. Способы обработки: сбор, запись, систематизация, накопление, хранение, уточнение (обновление, изменение), извлечение, использование, передача (доступ, предоставление), блокирование, удаление, уничтожение персональных данных.

6. Срок обработки и хранения: до получения от Субъекта персональных данных требования о прекращении обработки/отзыва согласия.

7. Способ отзыва: заявление об отзыве в письменном виде путём его направления на адрес электронной почты Оператора: info@rcsi.science или путем письменного обращения по юридическому адресу: 119991, г. Москва, Ленинский просп., д.32А

8. Субъект персональных данных вправе запретить своему оборудованию прием этих данных или ограничить прием этих данных. При отказе от получения таких данных или при ограничении приема данных некоторые функции Сайта могут работать некорректно. Субъект персональных данных обязуется сам настроить свое оборудование таким способом, чтобы оно обеспечивало адекватный его желаниям режим работы и уровень защиты данных файлов «cookie», Оператор не предоставляет технологических и правовых консультаций на темы подобного характера.

9. Порядок уничтожения персональных данных при достижении цели их обработки или при наступлении иных законных оснований определяется Оператором в соответствии с законодательством Российской Федерации.

10. Я согласен/согласна квалифицировать в качестве своей простой электронной подписи под настоящим Согласием и под Политикой обработки персональных данных выполнение мною следующего действия на сайте: https://journals.rcsi.science/ нажатие мною на интерфейсе с текстом: «Сайт использует сервис «Яндекс.Метрика» (который использует файлы «cookie») на элемент с текстом «Принять и продолжить».