Альфа-токоферилсукцинат индуцирует стресс ЭПР, нарушение метаболизма липидов и апоптоз в культуре нормальных и опухолевых клеток эпидермального происхождения

Полный текст

Принятые сокращения: АИ – апоптотический индекс; АФК – активные формы кислорода; СВЕ – сукцинат витамина Е; ЭПР – эндоплазматический ретикулум; грЭПР – гранулярный ЭПР.

Ежегодно у огромного числа людей во всем мире развиваются злокачественные новообразования; в результате таким лицам приходится подвергаться порой изнурительному лечению, которое далеко не всегда бывает эффективным. Часто злокачественные опухоли приводят к смерти, являясь одной из самых распространённых ее причин. Поэтому необходимо разрабатывать новые противоопухолевые соединения, которые бы обладали селективностью по отношению к опухолевым клеткам, не затрагивая в значительной степени жизнедеятельность нормальных клеток и тканей. В качестве таких агентов можно рассматривать низкомолекулярные вещества с селективным противоопухолевым эффектом, воздействующие в первую очередь на митохондрии злокачественных клеток, которые получили название митоканы (Bjelakovic et al., 2004, Rodriguez-Enriquez et al., 2009; Dong et al., 2011). Среди них наиболее известны производные антиоксиданта витамина Е, в том числе α-токоферилсукцинат (или сукцинат витамина Е – СВЕ), который представляет собой сложный эфир α-токоферола и янтарной кислоты. Изначально он был выделен из зеленых листьев ячменя и описан как соединение, стимулирующее выделение гормона роста клетками передней доли гипофиза (Badamchian et al., 1994).

Биологические эффекты СВЕ разнообразны. Так, он способен подавлять активность холинэстераз, ингибировать активность NF-κB, а также обладает широким спектром противоопухолевых эффектов (Савицкая и др., 2016; Majima et al., 2019).

Противоопухолевую активность СВЕ чаще всего связывают с его воздействием на митохондрии и индукцией апоптоза по митохондриальному механизму (Weber et al., 2003; Yu et al., 2003; Wang et al., 2005; Neuzil et al., 2007; Dong et al., 2008; Zhao et al., 2009; Prochazka et al., 2010; Савицкая и др., 2012; dos Santos et al., 2012; Gruber et al., 2014; Rauchová et al., 2014). Однако такой митохондриальный путь может быть не единственным. Например, известно, что в апоптозе, индуцированном воздействием СВЕ, может участвовать и стресс эндоплазматического ретикулума (ЭПР) (Huang et al., 2010, 2013).

Стресс ЭПР – клеточное состояние, наступающее в случае накопления неправильно свернутых белков. Он может быть вызван недостатком питательных веществ, изменениями статуса гликозилирования, гипоксией, нарушениями гомеостаза кальция и воздействием разнообразных агентов (Huang et al., 2010). В ответ на стресс ЭПР активируются высокоспецифичные сигнальные пути, направленные на устранение белковой нагрузки и восстановление гомеостаза. В таком ответе на несвернутые белки (unfolded protein response, UPR) участвуют шапероны, например, BiP (GRP78), сенсоры (IRE1, PERK, ATF6) и транскрипционные факторы (например, ATF6, ATF4 и CHOP). Если восстановить гомеостаз не удается, UPR также может индуцировать апоптотическую клеточную гибель. В предыдущем исследовании нами подробно описана индукция митохондриального механизма апоптоза под действием СВЕ в клетках эпидермоидной карциномы А431 (Савицкая и др., 2012).

В нынешней работе охарактеризована гибель иммортализованных кератиноцитов HaCaT при воздействии СВЕ, а также исследовано участие ЭПР и аппарата Гольджи в апоптотической гибели клеток А431 при воздействии этого соединения.

Материал и методика

Биологический материал. Работа проведена на культурах клеток эпидермоидной карциномы человека А431 (из Коллекции культур клеток позвоночных; ЦКП Института цитологии РАН, Санкт-Петербург) и иммортализованных кератиноцитов человека НаСаТ (УНУ: Коллекция клеточных культур; ЦКП Института биологии развития им. Н. К. Кольцова РАН, Москва; любезно предоставлены Е. А. Воротеляк). Для культивирования клеток использовали среду DMEM (“ПанЭко”, Россия), содержащую 10% фетальной сыворотки теленка (“ПанЭко”, Россия), 2 мМ L-глутамина (“ПанЭко”, Россия), 80 мкг/мл гентамицина (“ПанЭко”, Россия) и 100 мкг/мл амфотерицина B (“Синтез”, Россия). Культуру клеток поддерживали при 37 °С и 5% СО₂. Пассирование проводили смесью раствора Версена и 0.25% трипсина (7:3) (“ПанЭко”, Россия).

Постановка эксперимента. Клетки высаживали на стекла в чашки Петри в концентрации 200–300 тыс./мл. Необходимые концентрации α-токоферилсукцината СВЕ (Sigma, CША) получали из маточного спиртового (96% этанол) раствора (100 мМ) и хранили при –20 °С. Агент вносили в среду культивирования через 24 ч после посадки в концентрации 20, 40, 60 или 100 мкМ. Так как в качестве растворителя для СВЕ применяли этанол, в каждом эксперименте использовали два контроля: без добавления каких-либо растворов и с добавлением спирта в объеме, соответствующем максимальному вносимому объему СВЕ. Далее клетки фиксировали или окрашивали прижизненно через 24, 48 или 72 ч после добавления СВЕ в соответствии с поставленной задачей. Каждый эксперимент имел не менее трех биологических повторов.

Оценка жизнеспособности клеток. Использовали МТТ-тест. Для этого клетки высаживали в 96-луночный планшет, при этом в каждую лунку вносили 90 мкл среды с суспензией клеток. Через 24 ч культивирования в каждую лунку добавляли по 10 мкл 96%-ного этилового спирта или 10 мкл спиртового раствора СВЕ в необходимой концентрации и культивировали далее на протяжении 48 ч. Затем реактив МТТ разводили культуральной средой до концентрации 1.5 мг/мл и в каждую лунку добавляли по 20 мкл полученного раствора (конечная концентрация составляла 0.25 мг/мл). Через 1–2 ч отбирали среду и на 15–30 мин добавляли в лунку по 60 мкл DMSO для растворения образовавшихся гранул формазана. Оптическую плотность полученного раствора определяли на спектрофотометре Униплан (“Пикон”, Россия).

Световая микроскопия в светлом поле. Клетки фиксировали через 24, 48 и 72 ч после внесения в среду культивирования раствора СВЕ в концентрациях 20, 40, 60 или 100 мкМ. Для этого стекла с клетками промывали 0.1 M раствором PBS рН 6.9 (Sigma, США) и фиксировали в течение 30 мин фиксатором Буэна (15 частей насыщенного раствора пикриновой кислоты, 5 частей 40%-ного раствора формальдегида, 1 часть ледяной уксусной кислоты), после чего трижды промывали PBS, окрашивали гематоксилином в течение 2–3 мин, промывали проточной водой и докрашивали эозином в течение 30 с. Далее клетки обезвоживали в спиртах (70, 96%) и двух сменах толуола и заключали в канадский бальзам. На готовых препаратах подсчитывали число апоптотических клеток на 1000–1500 клеток (апоптотический индекс). Идентификацию апоптотических клеток проводили по морфологическим признакам, таким как уплотнение цитоплазмы, конденсация хроматина, блеббинг и распад на апоптотические тельца.

Оценка уровня активных форм кислорода (АФК). Для оценки доли клеток с избытком АФК использовали прижизненное наблюдение. В среду культивирования вносили 2′,7′-дихлорофлуоресцеиндиацетат (DCFH-DA) (BioChemika, США; рабочая концентрация 10 мкМ), который служит маркером присутствия пероксида водорода и других перекисных соединений, а также гидроксильного аниона. В присутствии активных форм кислорода (пероксида) в клетке образуется флуоресцирующий продукт окисления 2′,7′-дихлорофлуоресцеиндиацетата – дихлорофлуоресцеин. Клетки прижизненно исследовали на люминесцентном микроскопе Axiovert 200M (Carl Zeiss Inc., Германия) при увеличении объектива 63× с масляной иммерсией (PlanApo 63×/1.4) (Carl Zeiss Inc., Германия), снабженном черно-белой цифровой камерой Carl Zeiss AxioCam и программным обеспечением AxioVision 3.1.

Цитохимическое и иммуноцитохимическое окрашивание фиксированных клеток. Для визуализации митохондрий использовали флуоресцентный краситель MitoTracker Orange CMTMRos (Thermo Fischer Scientific, CША). Красители вносили в среду культивирования в концентрации 100 нМ на 30 мин, после чего клетки отмывали в среде DMEM, не содержащей сыворотки, помещали в PBS и далее фиксировали 4%-ным формальдегидом на PBS. Полученные препараты заключали в смесь PBS с глицерином (1:1).

Для иммуноцитохимического окрашивания клетки фиксировали 4%-ным формалином на 0.1 М PBS в течение 20 мин и трижды промывали 0.1 М PBS. Для пермеабилизации мембран фиксированные клетки на 3–5 мин помещали в 1%-ный раствор Triton X100 при комнатной температуре.

При иммуноцитохимическом окрашивании клетки помещали в раствор бычьего сывороточного альбумина на PBS и далее последовательно инкубировали с первыми и вторыми антителами. В качестве первых антител использовали моноклональные антитела мыши к активной форме каспазы 3 (1:100, клон 84803.111, C5737; Sigma, США), моноклональные антитела мыши к белку аппарата Гольджи 58K (1 : 50, клон 58K-9, G2404; Sigma, США) и поликлональные антитела овцы к цитохрому с (1 : 100, С5723; Sigma, США). В качестве вторых антител использовали моноклональные антитела к IgG мыши, конъюгированные с FITC (F9006, Sigma, США) или Alexa-488 (А11001; Invitrogen, США) и антитела к IgG овцы, конъюгированные с Alexa Fluor-546 (А21098; Invitrogen, США).

Полученные препараты заключали в смесь глицерина и PBS (1:1), смесь глицерина и PBS (1:1), содержащую 100 нМ DAPI (Merck, Германия) или Мовиол 4-88 (Hoecst, Германия), и исследовали на люминесцентном микроскопе Axiovert 200M (Carl Zeiss Inc., Германия) при увеличении объектива 63× с масляной иммерсией (PlanApo 63×/1.4) (Carl Zeiss Inc., Германия), снабженном черно-белой цифровой камерой Carl Zeiss AxioCam (Carl Zeiss Inc., Германия) и программным обеспечением AxioVision 3.1 (Германия).

Трансмиссионная электронная микроскопия. Клетки фиксировали 2.5%-ным глутаровым альдегидом с добавлением 2%-ного формалина на 0.1 М PBS рН 7.2 (Sigma, США), дважды промывали PBS и дофиксировали 1%-ным OsO₄. Далее проводили стандартную процедуру проводки для трансмиссионной электронной микроскопии и заключали материал в Epon 812 (Fluka, Швейцария). Срезы толщиной 60–80 нм изготавливали на ультрамикротоме Ultratom-5 (LKB, Германия) и окрашивали 1.5%-ным раствором уранилацетата 30 мин в темноте и 5 мин цитратом свинца по Рейнольдсу в наличии гидроксида натрия.

Готовые препараты анализировали с помощью трансмиссионного электронного микроскопа JEM-1011 (JEOL, Япония) с цифровой фотокамерой GATAN ES500W, работающей под управлением программы Digital Micrograph фирмы GATAN (Япония), и трансмиссионного электронного микроскопа JEM-100B (JEOL, Япония) с цифровой фотокамерой OLYMPUS C-770 под управлением программы ImageScope (Великобритания).

Выявление нейтрального жира. Клетки фиксировали в 10%-ном нейтральном формалине на проточной воде 24 ч, промывали проточной водой 2 ч. Затем материал переносили в 50%-ный этиловый спирт и сразу помещали в раствор судана III (70%-ный раствор на 96%-ном этаноле (“ХимПром”, Россия) на 25 мин. Далее препарат помещали в 50%-ный спирт, промывали в дистиллированной воде и заключали в смесь PBS (Sigma, США) с глицерином (CDH, Индия).

Полимеразная цепная реакция в реальном времени (ПЦР-РВ). Чтобы оценить влияние СВЕ на экспрессию генов, участвующих в стрессе ЭПР, использовали количественную ПЦР-РВ. Для анализа были выбраны ген CHOP, продукт которого представляет собой транскрипционный фактор, участвующий в индукции апоптоза при стрессе ЭПР, GRP78, кодирующий шаперон, и ATF4, продукт которого также является транскрипционным фактором и контролирует экспрессию ряда генов стресса ЭПР, в том числе CHOP. Реакцию проводили, как описано в работе (Potashnikova et al., 2015), с использованием следующих праймеров (Sintol, Россия): для гена CHOP – 5′-AGTCTAAGGCACTGAGCGTATC-3′/5′-TCTGTTTCCGTTTCCTGGTT-3′ (Fu et al., 2015); для гена GRP78 – 5′-TCTGCTTGATGTGTGTCCTCTT-3′/5′-GTCGTTCACCTTCGTAGACCT-3′ (Murugan et al., 2015); для гена ATF4 – 5′-TGGCTGGCTGTGGATGG-3′/5′-TCCCGGAGAAGGCATCCT-3′ (Plaisance et al., 2016). Для амплификации референсных генов были использованы следующие праймеры (Vandesompele et al., 2002): для гена убиквитина (ubiquitin) – 5′-ATTTGGGTCGCGGTTCTTG-3′/5′-TGCCTTGACATTCTCGATGGT-3′; для гена HPRT – 5′-TGACACTGGCAAAACAATGCA-3′/5′-GGTCCTTTTCACCAGCAAGCT-3′; для гена GAPDH – 5′-TGCACCACAACTGCTTAGC-3′/5′- GGCATGGACTGTGGTCATGAG-3′; для гена YWHAZ – 5′-ACTTTTGGTACATTGTGGCTTCAA-3′/5′-CCGCCAGGACAAACCAGTAT-3′. UBC – 5′-ATTTGGGTCGCAGTTCTTG-3′/5′-TGCCTTGACATTCTCGATGGT-3′. Все образцы были обработаны трижды. Один образец кДНК, введенный в каждый цикл ПЦР, служил межсерийным калибратором для объединения данных в один эксперимент. Специфичность праймеров подтверждали анализом кривой плавления и обнаружением продуктов с предсказанной длиной с использованием электрофореза в 1.5%-ном агарозном геле. Эффективность амплификации E рассчитывали как [10(–1 / наклон) – 1], используя наклон графика полулогарифмической регрессии Cq в зависимости от логарифмического входа кДНК. Каждую реакцию проводили в трехкратной повторности. Подбор референсных генов и нормализации результатов был проведен согласно Vandesompele et al. (2002), а также на основании меры стабильности (наименьшего коэффициента вариации) М в программе geNorm (https://genorm.cmgg.be/). Для нормализации полученных результатов ПЦР во всех экспериментах использовали геометрическое среднее трех референсных генов: UBC, GAPDH и YWHAZ. Результаты анализировали согласно Vandesompele et al. (2002).

Обработка и анализ результатов. Обработку фотографий проводили в программе Adobe Photoshop CS3. Обработка количественных данных, построение гистограмм и вычисление величин стандартного отклонения проводили с использованием языка программирования R (пакеты tidyverse, rstatix и ggpubr) и программы RStudio. Данные на гистограммах представлены в виде среднего значения и стандартного отклонения.

Каждый эксперимент имел не менее трех независимых биологических повторов на отдельных пассажах клеток. Значение P вычисляли по непараметрическому критерию Манна–Уитни с поправкой Бенджамини–Хохберга на множественные сравнения там, где это применимо. Значение P < 0.05 использовали как статистически значимое. Статистические значимые отличия обозначены на гистограммах звездочкой (*).

Результаты

СВЕ снижает жизнеспособность клеток эпидермоидной карциномы А431 и иммортализованных кератиноцитов НаСаТ. Жизнеспособность клеток при воздействии СВЕ оценивали с помощью МТТ-теста. Важно отметить, что для использования в экспериментах СВЕ растворяли в 96%-ном этаноле, а культивирование клеток культуры HaCaT в присутствии спирта, объем которого которого соответствует максимальному объему вносимого раствора СВЕ (0.57%), вызывает статистически значимое снижение жизнеспособности клеток. В связи с этим за контроль (100%-ную жизнеспособность) принимали вариант культивирования клеток в среде, содержащей этанол.

Показано, что спустя 48 ч культивирования клеток А431 в присутствии СВЕ жизнеспособность клеток статистически значимо снижается при концентрации СВЕ 40 мкМ и выше. Так, после воздействия 40 мкМ СВЕ жизнеспособность уменьшается на 8.6%, 60 мкМ – на 58.2, 100 мкМ – на 73% (рис. 1а). Концентрация 40 мкМ была выбрана для дальнейших исследований, поскольку она оказывает статистически значимое влияние на жизнеспособность клеток, но массовой гибели еще не вызывает.

 

Рис. 1. Реакция культивируемых клеток линий А431 и HaCaT на воздействие сукцината витамина Е (СВЕ): а – жизнеспособность клеток после культивирования в присутствии СВЕ в течение 48 ч; б – величина апоптотического индекса клеток НаСаТ при различных концентрациях и времени воздействия СВЕ. Данные представлены в виде среднего значения и стандартного отклонения; тест Манна–Уитни с поправкой Бенджамини–Хохберга на множественные сравнения; различия с контролем с добавлением спирта достоверны при (*) P < 0.05, (**) P < 0.01, (***) P < 0.001 или (****) P < 0.0001; n = 3–4 (а) и n = 3 (б).

 

В клетках линии НаСаТ продемонстрировано, что (в отличие от клеток А431) спустя 48 ч после добавления СВЕ значимое снижение жизнеспособности вызывают концентрации агента 60 и 100 мкМ: при действии 60 мкМ – на 23.8%, при действии 100 мкМ – на 42.2%; при этом воздействие 40 мкМ СВЕ не приводит к снижению жизнеспособности клеток. Таким образом, клетки HaCaT более устойчивы к воздействию СВЕ по сравнению с A431, поскольку значимое снижение их жизнеспособности проходит при более высоких концентрациях агента.

СВЕ вызывает апоптоз в клетках НаСаТ. Более раннее исследование, проведенное на клетках А431, показало, что СВЕ вызывает дозозависимую апоптотическую гибель этих клеток при концентрациях 40, 60 и 100 мкМ и культивировании в течение 48 и 72 ч (Савицкая и др., 2012). Анализ клеток НаСаТ после воздействия СВЕ показал, как и в случае клеток А431, наличие только апоптотического типа клеточной гибели. В пользу этого говорят морфологические признаки (конденсация хроматина, блеббинг, уплотнение цитоплазмы, распад клетки на апоптотические тельца) и результат иммуноцитохмического выявления активной формы каспазы 3 (рис. 2).

 

Рис. 2. Апоптоз в клетках НаСаТ при действии 60 мкМ СВЕ: а – окрашивание гематоксилином и эозином; б, в – соответственно фазовый контраст и иммуноцитохимическое выявление каспазы 3 в одной и той же клетке. Показан репрезентативный результат из трех независимых экспериментов.

 

По результатам количественной оценки уровня гибели клеток НаСаТ на основе морфологических признаков после окрашивания препаратов гематоксилином и эозином значимое увеличение количества апоптотических клеток (значения АИ) выявляется только на вторые и третьи сутки при концентрациях 60 и 100 мкМ, однако и в этом случае величина апоптотического индекса остается на уровне не более 4% (см. рис. 1б).

СВЕ не вызывает изменений структуры митохондрий в клетках НаСаТ. В более ранней работе показано, что СВЕ в концентрации 40 мкМ вызывает в клетках А431 изменение структуры митохондрий, заметное как на световом, так и на электронно-микроскопическом уровне, выход цитохрома c из митохондрий в цитозоль, усиление образования АФК и апоптоз по митохондриальному механизму (Савицкая и др., 2012). В нынешней работе исследовано влияние СВЕ на митохондрии в клеточной линии НаСаТ.

В клетках НаСаТ митохондрии визуализировали с помощью прижизненного окрашивания потенциал-зависимым красителем Mitotracker Orange. Оказалось, что клетки в контроле имеют многочисленные мелкие митохондрии, форма которых чаще всего удлиненная (рис. 3а). После воздействия 40 мкМ СВЕ в течение 48 ч значительных изменений морфологии митохондрий не выявляли (рис. 3б). Примечательно, что более высокие концентрации СВЕ, а именно 60 мкМ (рис. 3в) и 100 мкМ (рис. 3г) также не оказывают существенного влияния на морфологию и распределение митохондрий в клетке.

 

Рис. 3. Митохондрии в клетках линии НаСаТ после воздействия СВЕ в течение 48 ч: а–г – митохондрии в клетках НаСаТ, окрашенные MitoTracker Orange в контроле (а) и после действия СВЕ в концентрации 40 (б), 60 (в) и 100 (г) мкМ; д–и – иммуноцитохимическое выявление цитохрома с в клетках НаСаТ в контроле без спирта (д) и с добавлением его (е), а также после действия СВЕ в концентрации 40 (ж), 60 (з) и 100 (и) мкМ. Показан репрезентативный результат из трех независимых экспериментов.

 

Иммуноцитохмическое выявление белка цитохрома с (рис. 3д–и) демонстрирует, что в результате инкубации клеток НаСаТ в присутствии 40 мкМ СВЕ не происходит выход цитохрома с из митохондрий в цитозоль (рис. 3ж). В пользу этого говорит также отсутствие изменения формы и размера митохондрий, выявляемых при окрашивании митотрекером. Таким образом, воздействие 40 мкМ СВЕ на протяжении 48 ч не приводит к изменениям структуры хондриома и выходу цитохрома с. Более высокие концентрации СВЕ – 60 и 100 мкМ – также не индуцируют выход цитохрома с из митохондрий в цитозоль клеток НаСаТ (рис. 3з, и).

Для оценки влияния СВЕ на изменения ультраструктуры митохондрий, которые не выявляются на световом уровне, использовали трансмиссионную электронную микроскопию. На ультратонких срезах митохондрии клеток в контроле обычно выглядят как небольшие овальные структуры со светлым матриксом и тонкими кристами. У некоторых митохондрий в матриксе могут встречаться отдельные электронно-плотные области (рис. 4а). Иногда встречаются митохондрии с уплотненным матриксом; у них может быть расширено внутреннее пространство крист (рис. 4б). При воздействии СВЕ во всех изученных концентрациях наблюдается похожая картина (рис. 4в–и).

 

Рис. 4. Ультраструктура митохондрий в клетках НаСаТ в контроле (а, б) и после действия СВЕ в течение 48 ч в концентрации 40 (в, г), 60 (д–ж) и 100 (з–и) мкМ; нж – липидные включения (нейтральный жир).

 

Стоит отметить гетерогенность популяции митохондрий как в контроле, так и при всех изученных воздействиях: в одной и той же клетке могли встречаться митохондрии с немного различной ультраструктурой; при этом значительных ультраструктурных изменений митохондрий в клетках после действия СВЕ по сравнению с контрольными клетками не выявили.

СВЕ вызывает усиление продукции АФК в клетках НаСаТ. Чтобы выяснить, вызывает ли СВЕ повышение уровня кислородных радикалов, прижизненно окрашивали клетки красителем DCFH-DA. Оказалось, что количество окрашенных клеток после воздействия СВЕ значительно превышает таковое в контроле (рис. 5). Согласно результатам подсчета, доля клеток НаСаТ с гиперпродукцией АФК существенно возрастает, подобно тому, что было показано для клеток А431 (Савицкая и др., 2012).

 

Рис. 5. Прижизненное выявление пероксида водорода в клетках НаСаТ в контроле (а, в) и после действия 40 мкМ СВЕ в течение 48 ч (б, г); фазовый контраст (а, б) и окрашивание с помощью зонда DCFH-DA (в, г); д – доля АФК-положительных клеток после культивирования при наличии СВЕ. Данные представлены в виде среднего значения и стандартного отклонения; тест Манна–Уитни, различие с контролем с добавлением спирта, достоверно при (*) P < 0.05 (n = 3).

 

СВЕ вызывает накопление липидных включений в цитоплазме. Известно, что при ряде стрессовых воздействий в цитоплазме клеток увеличивается содержание жировых включений; так, накопление липидных капель показано при индукции апоптоза, в частности по митохондриальному механизму (Boren, Brindle, 2012). Для их выявления при действии СВЕ проводили окрашивание суданом III.

В клетках А431 при действии 40 мкМ СВЕ количество жировых капель в цитоплазме заметно возрастало по сравнению с контролем, часто наблюдали и увеличение размера отдельных включений (рис. 6а, б).

 

Рис. 6. Выявление нейтрального жира в клетках А431 (а, б) и НаСаТ (в, г) после культивирования в контроле (а, в) и в присутствии 40 мкМ СВЕ (б, г).

 

Подобную картину наблюдали и для клеток линии НаСаТ. Тем не менее стоит отметить, что в контроле в клетках НаСаТ липидных капель гораздо меньше, чем в клетках А431, и они практически незаметны (см. рис. 5в, г). Жировые капли в цитоплазме клеток, подвергавшихся воздействию СВЕ, видны и на ультраструктурном уровне (рис. 7к–м).

 

Рис. 7. Ультраструктура гранулярного ЭПР в клетках А431 (а–е) и НаСаТ (ж–м) в контроле и после 48-часового воздействия СВЕ. Клетки А431: а – контроль; б, в – контроль с добавлением спирта; г–е – 40 мкМ СВЕ. Клетки НаСаТ: ж – контроль, з – 40 мкМ СВЕ, и, к – 60 мкМ СВЕ, л, м – 100 мкМ СВЕ. Обозначения: ЭПР – эндоплазматический ретикулум, МТХ – митохондрии, НЖ – липидные капли (нейтральный жир).

 

СВЕ вызывает изменение структуры гранулярного ЭПР и аппарата Гольджи в клетках А431 и НаСаТ. Гранулярный ЭПР (грЭПР) в клетках А431 в контроле на ультраструктурном уровне представляет собой удлиненные каналы, на мембранах которых расположены полирибосомы (рис. 7а–в). В клетках, подвергавшихся воздействию СВЕ, встречаются как каналы грЭПР, по ультраструктуре сходные с таковыми в контроле (рис. 7г), так и значительно отличающиеся от контрольных (рис. 7д–е). Так, могут появляться протяженные участки, на мембранах которых отсутствуют рибосомы; встречаются и локальные расширения каналов ЭПР (рис. 7, показаны стрелками).

Обнаруженные изменения состояния ЭПР могут служить признаками его стресса (Sriburi et al., 2004; Bommiasamy et al., 2009). Известно, что стресс грЭПР может сопровождаться стрессом аппарата Гольджи (Wlodkowic et al., 2009). На световом уровне аппарат Гольджи выявляли методом иммуноцитохмического окрашивания антителами к матриксному белку p58K (рис. 8). Оказалось, что в контроле аппарат Гольджи лежит вблизи ядра клетки в виде протяженных областей. В клетках А431 после действия СВЕ аппарат Гольджи образует достаточно мелкие компактные кластеры, которые также располагаются около ядра.

 

Рис. 8. Иммуноцитохимическое выявление белка p58k в составе аппарата Гольджи в клетках A431 (а, б) и НаСаТ (в–е) в контроле и после 48-часового действия СВЕ. Клетки А431: а – контроль, б – 40 мкМ СВЕ. Клетки НаСаТ: в – контроль, г – 40 мкМ СВЕ, д – 60 мкМ СВЕ, е – 100 мкМ СВЕ.

 

Изменения аппарата Гольджи в клетках А431 выявляются не только на световом, но и на ультраструктурном уровне. Так, в контроле (рис. 9а) аппарат Гольджи имеет типичный вид стопки плоских цистерн с ампулярными расширениями на краях. В клетках, культивированных в присутствии СВЕ (рис. 9б, г, д), цистерны аппарата Гольджи значительно расширяются; такое расширение затрагивает как цис-, так и медиальные и транс-части. Форма цистерн может становиться овальной, а окружающие их везикулы – увеличиваться в размерах.

 

Рис. 9. Ультраструктура аппарата Гольджи в клетках А431 (а–д) и НаСаТ (е–о) в контроле и после 48-часового действия СВЕ. Клетки А431: а, в – контроль; б, г, д – 40 мкМ СВЕ. Клетки НаСаТ: е, з, и, к – контроль; ж, н – 60 мкМ СВЕ; л, м – 40 мкМ СВЕ; о – 100 мкМ СВЕ. Обозначения: АГ – аппарат Гольджи, МТХ – митохондрии.

 

В клетках линии НаСаТ в контроле грЭПР выглядит практически так же, как в клетках А431, но в отличие от них, такая морфология сохраняется и при воздействии 40 мкМ СВЕ; изредка встречаются расширенные цистерны.

При действии 60 или 100 мкМ СВЕ в клетках НаСаТ появляются участки гранулярного ЭПР со значительными расширениями (см. рис. 7к, м). Наиболее выражено расширение каналов ЭПР в клетках после культивирования в присутствии 100 мкМ СВЕ (см. рис. 7м).

Визуализация аппарата Гольджи в клетках НаСаТ с помощью иммуноцитохимического выявления белка p58K (см. рис. 8в–е) показала, что в контроле и после воздействия 40 мкМ СВЕ картина практически одинакова и соответствует той, которая наблюдается в контроле в культуре клеток А431. В результате культивирования клеток в присутствии 60 или 100 мкМ СВЕ аппарат Гольджи становится более компактным и формирует кластеры вблизи ядра подобно тем, которые появляются в клетках А431 уже при действии 40 мкМ СВЕ. Таким образом, в клетках линии НаСаТ изменения формы аппарата Гольджи при действии СВЕ сходны с таковыми в линии А431, но требуют более высоких концентраций агента (см. рис. 8д, е).

Ультраструктура аппарата Гольджи в клетках НаСаТ может различаться как внутри одной клетки, так и между различными клетками при одних и тех же условиях культивирования. Так, в контроле наряду со стопками плоских цистерн (см. рис. 9з) встречаются стопки, в которых расширены некоторые (см. рис. 9и) или практически все (см. рис. 9к) цистерны. Последние два варианта ультраструктуры встречаются на срезах относительно редко. После воздействия СВЕ на клетки НаСаТ в целом обнаруживается сходная картина. При более высоких концентрациях агента расширенные цистерны аппарата Гольджи присутствуют практически во всех стопках (рис. 9н, о).

СВЕ повышает уровни экспрессии маркеров стресса ЭПР. Для того, чтобы выяснить, оказывает ли СВЕ влияние на уровень экспрессии генов маркеров стресса ЭПР, была проведена ПЦР-РВ. В обеих исследуемых линиях оценивали экспрессию маркеров стресса ЭПР GRP78, ATF4 и CHOP. Было обнаружено, что при воздействии 40 мкМ СВЕ в клетках линии А431 происходит статистически значимое повышение уровня экспрессии мРНК GRP78 и ATF4 в 51 и 28 раз соответственно, а в клетках линии НаСаТ – повышение уровня экспрессии ATF4 и CHOP в 10 и 22 раза соответственно. Наблюдается тенденция к повышению уровня экспрессии GRP78 в клетках НаСаТ и CHOP в клетках А431, однако оно не является статистически значимым (рис. 10).

 

Рис. 10. Относительная экспрессия генов-маркеров стресса ЭПР: GRP78, ATF4 и CHOP в клетках линий А431 и НаСаТ при воздействии 40 мкМ СВЕ. ПЦР в реальном времени. Данные представлены в виде среднего значения и стандартного отклонения; тест Манна–Уитни; различия с контролем достоверны при (*) P < 0.05 или (***) P < 0.001 (n = 3).

 

Обсуждение

Сукцинат витамина Е способен избирательно вызывать апоптоз в опухолевых клетках, вследствие чего его можно рассматривать в качестве потенциального противоопухолевого агента. Тем не менее данных о механизме его действия на клетки в настоящее время недостаточно; при этом обычно каждое отдельно взятое исследование посвящено лишь одному или небольшому числу реакций клетки (Weber et al., 2003; Yu et al., 2003; Wang et al., 2005; Neuzil et al., 2007; Dong et al., 2008; Zhao et al., 2009; Prochazka et al., 2010; dos Santos et al., 2012; Савицкая и др., 2012; Gruber et al., 2014).

Одни авторы демонстрируют, что клеточная гибель сопровождается нарушением проницаемости мембран лизосом (Neuzil et al., 2002), другие описывают запуск апоптоза по митохондриальному механизму (Dong et al., 2008; Zhao et al., 2009; Prochazka et al., 2010; dos Santos et al., 2012; Gruber et al., 2014). Также стоит отметить, что лишь немногочисленные данные литературы посвящены действию СВЕ на нормальные/нетуморогенные клетки, которые в большинстве случаев демонстрируют селективность эффекта СВЕ (Israel et al., 2000; Neuzil et al., 2001; Zhao et al., 2009, Majima et al., 2019).

Таким образом, в настоящее время нет полной картины влияния СВЕ на нормальные/нетуморогенные клетки и не изучены механизмы, общие для нормальных и опухолевых клеток. Отсутствует также подробное исследование особенностей гибели клеток разного происхождения, в частности клеток многослойных плоских эпителиев, образующих кожные покровы и эпителиальные выстилки ряда слизистых оболочек.

В более ранней работе (Савицкая и др., 2012) показано, что СВЕ вызывает снижение жизнеспособности и апоптотическую гибель клеток эпидермоидной карциномы А431 по сравнению с контролем; при этом эффект зависит от концентрации агента и времени воздействия. В иммортализованных нетуморогенных кератиноцитах НаСаТ СВЕ также вызывает снижение жизнеспособности клеток, и выраженность эффекта зависит от времени воздействия и концентрации вещества. Индукция апоптоза в клетках НаСаТ показана с помощью подсчета АИ на препаратах клеток, окрашенных гематоксилином и эозином. Примечательно, что хотя СВЕ, как и в клетках А431, вызывает значимое повышение АИ через 48 ч после внесения агента, даже при 60 и 100 мкМ СВЕ величина АИ не превышает 4%.

При использовании метода МТТ значимые различия жизнеспособности клеток выявляются при культивировании в присутствии 40, 60 и 100 мкМ СВЕ. Клетки НаСаТ более устойчивы к снижению жизнеспособности при действии СВЕ в концентрации 60 и 100 мкМ по сравнению с клетками эпидермоидной карциномы А431. Такие данные согласуются с результатами исследований, свидетельствующих о селективном действии СВЕ по отношению к опухолевым клеткам (Israel et al., 2000; Neuzil et al., 2001; Zhao et al., 2009).

Ранее было показано, что в клетках А431 СВЕ способствует запуску апотпоза по митохондриальному пути (Савицкая и др., 2012). Поэтому в настоящей работе клетки линии НаСаТ исследовали по тем же параметрам, что и А431. Выявление АФК продемонстрировало, что даже при действии 40 мкМ СВЕ доля окрашенных на АФК клеток значительно возрастает, как и в клетках A431. Однако АИ в линии клеток НаСаТ значительно ниже, чем в линии А431 при таком же воздействии. В качестве объяснения этого наблюдения можно предположить активацию характерной для нормальных клеток мощной системы антиоксидантной защиты (Kogure et al., 2002; Neuzil et al., 2007).

Далее в клетках НаСаТ, подвергнутых действию СВЕ в концентрации 40, 60 и 100 мкМ, прижизненно окрашивали митохондрии клеток, выявляли цитохром с методом иммуноцитохимии, а также исследовали состояние митохондрий на ультраструктурном уровне. Было обнаружено, что по сравнению с контролем СВЕ в концентрации до 100 мкМ включительно существенно не влияет ни на форму, ни на размер митохондрий как на светомикроскопическом, так и на ультраструктурном уровне. Оказалось также, что цитохром с сохраняется в составе митохондрий даже в тех клетках, у которых присутствуют морфологические признаки апоптоза, такие как блеббинг.

Таким образом, клетки НаСаТ проявляют устойчивость к СВЕ в концентрации 40 мкМ; более высокие концентрации хоть и вызывают апоптотическую гибель, но происходит она по механизму, отличному от митохондриального. Чтобы оценить вклад других органелл и компонентов клетки в развитие гибели, мы изучали ЭПР, аппарат Гольджи и накопление липидных капель.

С помощью окрашивания, позволяющего на световом уровне визуализировать нейтральный жир, нами было показано, что при действии СВЕ в клетках как линии А431, так и НаСаТ, увеличиваются количество и размеры липидных капель в цитоплазме. Накопление липидных капель в целом характерно для апоптоза (Boren, Brindle, 2012). Оно может быть связано с усилением синтеза липидов de novo, которое происходит вследствие подавления β-окисления жирных кислот в митохондриях, в результате чего жирные кислоты используются для синтеза липидов.

В свою очередь, ингибирование β-окисления может быть следствием повышения уровня АФК, поскольку кислородные радикалы инактивируют соответствующие ферменты, реагируя с их тиольными группами (Boren, Brindle, 2012). В литературе можно встретить и другие объяснения накопления липидных капель в апоптотических клетках: перераспределение различных видов липидов между разными компартментами клетки (Quintero et al., 2010), повышение количества липидов вследствие деградации органелл и аутофагии (Delikatny et al., 2002) или усиления активности фосфолипазы А2 (Hakumaki et al., 1999).

Известно, что накопление липидных капель может происходить вследствие стресса ЭПР, и наоборот – стресс ЭПР способен возникать в результате накопления липидов в цитоплазме. Нарушение обновления липидных капель также может вызвать стресс ЭПР (Hapala et al., 2011; Jarc, Petan, 2019). Для объяснения роли воздействии СВЕ в увеличении количества липидных включений необходимо более детальное изучение нарушения метаболизма липидов при стрессе ЭПР в нормальных и опухолевых клетках разного происхождения.

Поскольку разные пути апоптоза нередко могут пересекаться, затрагивая различные органеллы (Yang et al., 2018; Gao et al., 2021; Qiu et al., 2021), мы также исследовали состояние органелл синтетического компартмента, чтобы оценить их участие и изменение в процессе индукции клеточной гибели как в клетках А431, так и НаСаТ.

Анализ аппарата Гольджи на светомикроскопическом и ультраструктурном уровнях показал, что в клетках А431 при концентрации СВЕ 40 мкМ аппарат Гольджи кластеризуется на световом уровне, а на ультраструктурном может наблюдаться расширение цистерн. При этом с помощью трансмиссионной электронной микроскопии мы также выявили расширение каналов ЭПР. В клетках линии НаСаТ эффекты сходны с таковыми для А431, но встречаются при концентрациях СВЕ 60 и 100 мкМ. Интересно отметить, что повышенная устойчивость клеток HaCaT к структурным изменениям их синтетического компартмента под воздействием СВЕ сопровождает меньшее снижение жизнеспособности клеток.

Известно, что расширение каналов грЭПР может сопровождать состояние его стресса (Sriburi et al., 2004; Bommiasamy et al., 2009). Стресс ЭПР был подтвержден с помощью ПЦР-РВ, которая показала усиление экспрессии по крайней мере двух молекулярных маркеров стресса ЭПР из трех, проанализированных для каждой культуры клеток.

Апоптоз, вызываемый стрессом ЭПР, чаще всего реализуется по митохондриальному механизму (Gorman et al., 2012). В частности, большую роль при этом может играть концентрация свободного Са²⁺ в цитозоле. После выхода из ЭПР в результате стресса Са²⁺ поступает в митохондрии, где может нарушать работу комплексов дыхательной цепи и приводить к гиперпродукции АФК (Hapala et al., 2011).

Однако есть отдельные редкие данные, указывающие на то, что переключение на митохондриальный механизм происходит не всегда, и в этом случае в процессе апоптоза могут участвовать не только каспаза 9, но и каспазы 4 и 12 (у мышей) и даже 8, однако эти данные скудны и неоднозначны (Hitomi et al., 2004; Gorman et al., 2012). Тем не менее можно предположить, что в клетках НаСаТ апоптоз индуцируется при участии стресса ЭПР, не затрагивая митохондрии, поскольку мы не обнаружили ни морфологических изменений митохондрий, ни, что более важно, выхода в цитозоль цитохрома с.

О различиях механизмов индукции апоптоза при действии СВЕ на нормальные и опухолевые клетки могут говорить и данные о тех сигнальных путях, которые активируются стрессом ЭПР в этих клеточных линиях. Поскольку мы показали, что именно в клетках HaCaT уровень экспрессии CHOP статистически значимо повышается, можно предположить, что этот белок вовлечен в индукцию программы апоптоза. Роль этого транскрипционного фактора в индукции апоптоза хорошо известна. CHOP опосредует клеточную гибель с помощью индукции экспрессии различных генов, включая GADD34 и ERO1α, которые могут способствовать апоптозу в условиях продолжительного стресса ЭПР (Verfaillie et al., 2013).

В настоящее время в литературе не описаны эффекты СВЕ или его аналогов по отношению к аппарату Гольджи. Выявленное в настоящей работе расширение его цистерн, возможно, представляет собой следствие индукции стресса ЭПР и активации программы апоптоза.

Таким образом, нами показано, что как в клетках А431, так и в клетках НаСаТ при действии СВЕ индукцируется стресс ЭПР, происходят морфологические изменения структуры ЭПР и аппарата Гольджи, а также накапливаются липидные капли в цитоплазме, однако ключевое различие механизмов индукции апоптотической гибели в клетках А431 и НаСаТ при действии СВЕ лежит в реакции митохондрий: в клетках А431 запуск апоптоза осуществляется по митохондриальному механизму, в то время как в линии НаСаТ этого не происходит, и клетки вступают в апоптоз без участия митохондрий. Поскольку СВЕ, как правило, в первую очередь направленно действует на митохондрии (Савицкая и др., 2016), можно предположить, что митохондриальный путь апоптоза в клетках А431 является основным и дополнительно усиливается стрессом ЭПР. Возможно, такое различие лежит в основе разной чувствительности клеток А431 и НаСаТ к воздействию СВЕ.

Исследование воздействия СВЕ на нормальные и опухолевые клетки актуально как с теоретической, так и практической точки зрения. Изучение эффектов СВЕ по отношению к клеткам опухолей поможет лучше понять механизмы лежащих в их основе процессов, а в перспективе – разработать противоопухолевый препарат с селективным действием и минимальным количеством побочных эффектов.

Финансирование работы

Работа финансирована за счет средств бюджета Московского государственного университета им. М. В. Ломоносова (госзадание № 121032300098-5). Никаких дополнительных грантов на проведение или руководство данным конкретным исследованием получено не было.

Соблюдение этических стандартов

В работе отсутствуют исследования человека или животных.

Конфликт интересов

Авторы работы заявляют, что у них нет конфликта интересов.

Об авторах

М. А. Савицкая

Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова

Email: nakomis@mail.ru

Кафедра клеточной биологии и гистологии

Россия, Москва, 119234

И. И. Захаров

Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова

Email: nakomis@mail.ru

Кафедра клеточной биологии и гистологии

Россия, Москва, 119234

А. А. Саидова

Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова

Email: nakomis@mail.ru

Кафедра клеточной биологии и гистологии

Россия, Москва, 119234

Е. А. Смирнова

Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова

Email: nakomis@mail.ru

Кафедра клеточной биологии и гистологии

Россия, Москва, 119234

Г. Е. Онищенко

Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова

Автор, ответственный за переписку.
Email: nakomis@mail.ru

Кафедра клеточной биологии и гистологии

Россия, Москва, 119234

Список литературы

Дополнительные файлы