Role of calcium channels in glucose uptake regulation in the in vitro model of polarized intestinal epithelium

Full Text

Принятые сокращения: [Са²⁺]_i – внутриклеточная концентрация кальция; FID – FITC-dextran (fluorescein isothiocyanate dextran); ORAI1 – каналы депо-зависимого входа кальция; PBS – фосфатно-солевой буферный раствор; SGLT1 и GLUT2 – транспортеры глюкозы; SOCE – депо-управляемый вход кальция (store-operated calcium entry); STIM1 – сенсор кальция в ЭПР; TEER – трансэпителиальное/трансэндотелиальное электрическое сопротивление.

Кишечный эпителий выполняет множество функций в организме: он служит барьером на пути различных факторов из окружающей среды, обеспечивает транспорт воды и электролитов, а также осуществляет всасывание и переваривание питательных веществ. Сложные углеводы, попадая в тонкий кишечник, сперва гидролизуются до моносахаридов, таких как глюкоза или галактоза, а затем транспортируются через слизистую оболочку кишечника. Поглощение избыточного количества глюкозы в тонком кишечнике сопряжено с развитием ожирения, диабета и сопутствующих тяжелых заболеваний. Терапевтические подходы к лечению таких заболеваний требуют определения четких механизмов регуляции абсорбции глюкозы, которые пока не установлены.

Классический путь абсорбции глюкозы проходит через щеточную мембрану кишечника и преимущественно опосредован мембранным белком-транспортером глюкозы SGLT1, который связывает две молекулы Na⁺ вместе с одной молекулой глюкозы (Alexander, Carey, 2001; Gorboulev et al., 2012). Выход глюкозы с базолатеральной поверхности энтероцитов осуществляется транспортером глюкозы GLUT2, который помогает глюкозе перемещаться из энтероцитов во внеклеточную среду возле кровеносных капилляров (Röder et al., 2014). Любой фактор, меняющий активность SGLT1 и GLUT2, также влияет на абсорбцию и метаболизм глюкозы.

В настоящее время предложена модель регуляции кишечной абсорбции глюкозы, в основе модели лежит изменение уровня внутриклеточной концентрацией кальция [Са²⁺]_i. Согласно этой модели, при низкой концентрации глюкозы в просвете кишечника всасывание глюкозы осуществляется с помощью SGLT1. Однако когда уровень глюкозы в просвете кишечника становится выше, чем транспортная способность SGLT1, другой переносчик GLUT2, находящийся на базальной мембране клеток, перемещается и встраивается в апикальную мембрану, где начинает участвовать в транспорте глюкозы (Helliwell et al., 2003).

Эти процессы регулируются [Са²⁺]_i, который модулирует также и экспрессию GLUT2 в энтероцитах (Tharabenjasin et al., 2014; Kuhre et al., 2017). Предварительные результаты свидетельствуют, что транслокация GLUT2 из внутриклеточного пула запускается SGLT1-зависимой активацией протеинкиназы C и MAP-киназы, от которых зависит рост [Са²⁺]_i (Helliwell et al., 2003). Увеличение [Са²⁺]_i активирует кальмодулин-зависимую киназу легкой цепи миозина (MLCK), дополнительно активируя миозин II путем фосфорилирования регуляторной легкой цепи (RLC20) по Ser19. Эти процессы приводят к перестройке актинового цитоскелета и в итоге – к транслокации GLUT2 к апикальной мембране клетки (Mace, 2007; Bourzac, 2013). Таким образом, транслокация GLUT2 из цитоплазматических пузырьков в апикальную мембрану существенно увеличивает способность энтероцита поглощать глюкозу (Affleck et al., 2003; Zheng et al., 2012; Грефнер, 2014).

Вход Са²⁺ через мембраны щеточной каймы энтероцитов в основном осуществляется с помощью эпителиальных Са²⁺-каналов TRPV6 (transient receptor potential channels vanilloid type 6), которые были впервые клонированы из эпителиальных клеток тонкого кишечника крысы (Peng et al., 1999). Позднее эти каналы были идентифицированы в клетках других млекопитающих и человека (Nijenhuis et al., 2003).

Каналы TRPV6 могут обеспечивать строго дозированное поступление Са²⁺ и участвовать в активной (ре)абсорбции Са²⁺ в эпителиальных клетках почек, тонкого кишечника и плаценты (Hoenderop 2002; Nijenhuis et al., 2003). Согласно ряду сообщений, рост [Са²⁺]_i в энтероцитах может также контролироваться потенциал-управляемыми Са²⁺-каналами L-типа (например, Cav1.3) (Mace et al., 2007) и депо-активируемыми каналами SOCЕ (Chung et al., 2015). Немаловажную роль в кальциевом гомеостазе кишечника играет также Са²⁺-чувствительный рецептор (Brown, 2013), который является членом суперсемейства G-белoк-сопряженных рецепторов (GPCR) и экспрессируется во всей пищеварительной системе (Diaz et al., 1997).

Следует особо отметить, что, хотя спектр Са²⁺-проводящих каналов в энтероцитах довольно хорошо охарактеризован, какие именно каналы участвуют в регуляции всасывания глюкозы в кишечнике, до сих пор не установлено.

Задача нашей работы заключалась в определении роли Ca²⁺-каналов в регуляции всасывания глюкозы. Для этого мы использовали поляризованный монослой клеток Сасо-2 в качестве модели кишечного эпителия. С помощью этого подхода было показано увеличение уровня TRPV6 и снижение уровня STIM1, а также уменьшение депо-зависимого входа кальция в энтероциты в условиях высокой нагрузки клеток глюкозой. Полученные данные указывают на сложное реципрокное взаимодействие двух различных кальциевых путей при поглощении глюкозы клетками кишечного эпителия и на важную роль глюкозы в регуляции этого взаимодействия.

Материал и методика

Клетки. Использовали клетки аденокарциномы толстой кишки человека (линия Сасо-2), полученные из ЦКП “Коллекция культур клеток позвоночных” Института цитологии РАН (Санкт-Петербург). Клетки культивировали при 37 °С и 5% СО₂ в среде DMEM, содержащей 4,5 г/л глюкозы, 15% эмбриональной телячьей сыворотки и 0.008% гентамицина. Для спонтанной дифференцировки в энтероцитоподобный монослой клетки Caco-2 снимали с подложки путем добавления раствора трипсина-версена (0.25 и 0.75% соответственно) и высевали на специальные вставки с полупроницаемой мембраной (размер пор 0.4 мкм), помещенные в многолуночные планшеты (Cell culture insert system; Biofil, Китай). Монослой выращивали в течение 18–21 сут в культуральной среде, при 37 °С и 5% СО₂. Культуральную среду при выращивании клеток меняли через день. Такой подход позволил создать клеточную объемную (3D) модель поляризованного кишечного эпителия.

Для выяснения влияния уровня глюкозы клетки инкубировали в течение 60 мин в солевой среде, содержащей (мМ): 137 NaCl, 4.7 KCl, 1.2 KH₂PO₄, 1.2 MgSO₄, 2.5 CaCl₂, 10 HEPES (pH 7.2), в которую добавляли глюкозу в низкой (2.5, 5 мМ) или высокой концентрации (25, 50 мМ).

Трансэпителиальное/трансэндотелиальное электрическое сопротивление (TEER) измеряли с использованием эпителиального вольтомметра EVOM² (WPI Inc., США), снабженного двумя электродами Ag-AgCl. Для этого один электрод погружали в культуральную среду внутри вставки с клеточным монослоем, а другой размещали в среде снаружи от фильтра (в лунке планшета). Держатель электрода позволял контролировать одинаковый уровень погружения пары электродов. Сопротивление слоя клеток TEER рассчитывали по формуле TEER = = RМ, где R – измеренное сопротивление, из которого вычли сопротивление пустой вставки; М – площадь полупроницаемой мембраны (см²).

Измерение проницаемости слоя с использованием FID (FITC-dextran). Клетки во вставках дважды отмывали раствором Хенкса с 10 мМ HEPES (HBSS-H), далее в базолатеральный отсек вносили 700 мкл HBSS-H, а в апикальный отсек к клеткам вносили 125 мкл раствора FID в концентрации 1 мг/мл в HBSS-H. Затем планшеты помещали в СO₂-инкубатор при 37 °С и каждые 30 мин из нижнего отсека забирали по 100 мкл раствора, восстанавливая прежний объем добавлением 100 мкл свежего HBSS-H.

Образцы собирали и измеряли флуоресцентный сигнал отобранных аликвот с использованием планшетного мультимодального ридера Varioskan LUX (Thermo Scientific, США) при длинах волн возбуждения и испускания соответственно 490 и 520 нм. Коэффициент проницаемости Pарр рассчитывали по формуле Pарр = dQ/dt/C₀ A, где dQ/dt – поток вещества, мкг/с; С₀ – начальная концентрация в донорном отсеке, мкг/мл; А – площадь пористой поверхности вставки, см² (Westerhout et al., 2014).

Для вычисления значений dQ/dt измеряли концентрацию FID в базолатеральном отсеке через 30, 90 и 150 мин после добавления FID в апикальный отсек, а затем строили линейную регрессию концентрации в зависимости от времени. Если полученное уравнение линейной регрессии было статистически значимым (P < 0.1), коэффициент наклона Slope считали равным dQ/dt.

Иммуноэлектронная микроскопия выполнена на участках поляризованного эпителия, которые фиксировали в растворе 2%-ного параформальдегида и 0.5%-ного глутаральдегида в PBS в течение 1 ч, затем обезвоживали в спиртах и заливали в акриловую смолу LR-White (Merck, Германия). Потом участки эпителия изолировали из культуральных вставок и использовали для приготовления ультратонких срезов, которые помещали на никелевые сетки, покрытые формваровой пленкой. Для иммуноокрашивания сетки выдерживали 20 мин в 1%-ном бычьем сывороточном альбумине, а затем инкубировали 1 ч с первичными анти-TRPV6 антителами (в разведении 1:100) и вторичными антителами, конъюгированными с коллоидным золотом размером 10 нм (1:50).

Контролем служили срезы без обработки первыми антителами. Ультратонкие срезы клеток после обработки контрастировали уранил-ацетатом и цитратом свинца и анализировали на электронном микроскопе Librа-120 (Carl Zeiss, Германия).

Иммунофлуоресцентный анализ. Изолированные из культуральных вставок участки кишечного эпителия фиксировали в 3.7%-ном параформальдегиде, пермеабилизовали в присутствии 0.25%-ного Tween 20 и инкубировали с первичными антителами при 4 °С в течение ночи. После отмывки клетки инкубировали с вторичными антителами (1 : 200) в течение 40 мин при 37 °С.

Для визуализации актинового цитоскелета и клеточных ядер клетки окрашивали родамин-фаллоидином и красителем DAPI соответственно. Далее участки эпителия помещали апикальной стороной на покровные стекла, добавляли среду Vectashield mounting medium (Vector Laboratories, США) и исследовали с помощью конфокального микроскопа Olympus FV3000 (Olympus Corporation, Япония), используя масляный объектив 40×. Интенсивность флуоресценции оценивали с помощью ImageJ (NIH, США) и усредняли по меньшей мере для 5–10 образцов в каждом эксперименте.

Интенсивность флуоресценции в клетках после их инкубации в растворах с глюкозой сравнивали с помощью t-критерия Стьюдента. Данные представлены как среднее значение и его ошибка (SEM). Для определения различий использовали U-критерий Манна–Уитни, различия считали достоверными при уровне значимости P < 0.05.

Вестерн-блот-анализ. Клетки промывали теплым раствором PBS и лизировали в лизирующем буфере (100 мM NaF, 50 мM KCl, 2 мM MgCl₂, 1 мM EGTA, 1 M сахарозы, 1% Triton X-100, 100 мкM PMSF, 10 мM K-фосфатного буфера pH 7.0) 10 мин на льду. Полученные лизаты клеток центрифугировали при 2000 g, супернатант собирали и определяли концентрацию белка по методу Бредфорда с помощью прибора NanoDrop One (Thermo Scientific, США).

Электрофоретическое разделение белков проводили методом диск-электрофореза с последующим переносом на нитроцеллюлозную мембрану. Ее инкубировали с первичными антителами против исследуемых белков, а затем – с вторичными антителами, конъюгированными с пероксидазой хрена (HRP). Визуализацию конъюгированных с HRP антител осуществляли путем усиленной хемилюминесценции. Хемилюминесцентное свечение регистрировали с помощью системы SuperSignal Substrate (Thermo Fisher Scientific, США).

Измерение [Са²⁺]_i. Использовали флуоресцентный кальций-чувствительный зонд Fluo-4 (Molecular Probes, США). Изображения клеток получали с помощью лазерного сканирующего конфокального микроскопа Olympus FV3000 (Olympus Corporation, Япония), используя объектив 40× с масляной иммерсией. Интенсивность флуоресценции оценивали с помощью программы ImageJ (NIH, США).

Визуализация актинового цитоскелета. Клетки окрашивали родамин-фаллоидином (Invitrogen, США) в течение 20 мин, ядра окрашивали красителями DAPI (0.05 мкг/мл) или Hoechst 33 342 (1.5 мкг/мл).

Антитела. Использовали коммерческие антитела различных производителей: кроличьи, выработанные против TRPV6 (Santa Cruz Biotech, США, или Alomone, Израиль) в разведении 1 : 100; против STIM1 (Alomone, Израиль) в разведении 1 : 1000; против ORAI1 (Alomone, Израиль) в разведении 1 : 200; против p65 (Thermo Fisher Scientific, Великобритания) в разведении 1 : 1000 и против GLUT2 (Thermo Fisher Scientific, Великобритания) в разведении 1 : 200. В качестве вторичных антител использовали конъюгаты Alexa Fluor 488 (Invitrogen, США), GAR-FITC (Jackson, США) и GAM-Cy3 (Jackson, США) в разведении 1 : 200. Для иммуноэлектронной микроскопии в качестве вторичных антител использовали антикроличьи иммуноглобулины (Sigma, США), конъюгированные с коллоидным золотом (размер частиц 10 нм). Для иммуноблота использовали антикроличьи или антимышиные вторичные антитела, конъюгированные с пероксидазой хрена (Sigma, США). Антитела разводили в PBS, pH 7.4.

Результаты

На протяжении многих лет трансмембранный перенос веществ изучали, как правило, на изолированных препаратах тонкой кишки или в условиях острого (или хронического) опыта на анестезированных животных. Однако такие условия часто вносили изменения в процессы всасывания веществ и работу различных транспортеров. Более того, поглощение веществ в кишечнике грызунов и человека сильно различается. Поэтому в последнее время в качестве модели для изучения процессов всасывания в тонком кишечнике используют клетки аденокарциномы человека линии Caco-2, которые при длительном культивировании могут поляризоваться и формировать микроворсинки на апикальной поверхности эпителия (Blais et al., 1987).

Мы исследовали роль кальциевых каналов в поглощении глюкозы, используя дифференцированный монослой клеток Caco-2 как клеточную модель кишечного эпителия. После 18–21 сут культивирования клеток Сасо-2 на полупроницаемых мембранах (метод transwell assay) исследовали степень дифференцировки и поляризованности монослоя эпителия. Целостность плотных соединений в модели клеточной культуры эпителиального монослоя оценивали путем измерения сопротивления TEER. Этот метод оценки целостности и проницаемости монослоя использовали для мониторинга живых клеток на различных стадиях их роста и дифференцировки (рис. 1). Клетки использовали для проведения эксперимента при достижении значений сопротивления монослоя 400–600 Ом · см².

 

Рис. 1. Схема, демонстрирующая культуральную вставку с клетками на полупроницаемой мембране. Вставка расположена в лунке пластикового планшета для культивирования клеток.

 

С помощью электронного микроскопа оценивали фенотип клеток эпителия для проверки их морфологического и функционального соответствия энтероцитам, выстилающим тонкий кишечник. Рис. 2 демонстрирует изображения клеток эпителиального монослоя, на апикальной поверхности которого присутствуют микроворсинки, а между клетками видны хорошо сформированные щелевые контакты, что в целом отражает степень поляризации кишечного эпителия. В цитоплазме клеток выявлены все присущие большинству энтероцитов органоиды, включая митохондрии, элементы цитоскелета, эндоплазматический ретикулум с рибосомами и др. По всей длине микроворсинок присутствуют пучки микрофиламентов, переходящие в области терминальной сети в корневые нити.

 

Рис. 2. Ультратонкий срез двух соседних клеток эпителия в области межклеточных контактов. Видны корневые нити микроворсинок, межклеточные контакты, митохондрии и мембраны эндоплазматического ретикулума. Контрольный препарат. Стрелками указаны микроворсинки (м), десмосомы (д) в местах межклеточных контактов и рибосомы (ри) на поверхности эндоплазматического ректикулума. Масштабная линейка: 400 нм.

 

Присутствие хорошо сформированного актинового цитоскелета в микроворсинках на апикальной поверхности клеток было подтверждено также флуоресцентным окрашиванием с помощью родамин-фаллоидина (рис. 3). Анализ 3D-изображений, реконструированных из серии оптических срезов X–Y, полученных с помощью сканирующего лазерного конфокального микроскопа, подтвердил формирование поляризованного эпителия с присутствием микроворсинок и формированием сверхплотных контактов между клетками кишечного эпителия.

Способность монослоя поглощать глюкозу оценивали с помощью полисахарида декстрана, конъюгированного с флуоресцентным зондом FID. Оценку проводили с помощью планшетного полимодального ридера в двух независимых экспериментах, в каждом из которых определяли коэффициент проницаемости Pарр.

Проведенный анализ показал постепенное нарастание флуоресцентного сигнала с течением времени. Полученный коэффициент проницаемости, равный (76 ± 19) · 10^–6 см/с, соответствует высокой предсказанной гастроинтестинальной абсорбции in vivo (Yee, 1997) и согласуется со значением Рарр для D-глюкозы, равным (17–20) · 10^–6 см/с для клеток Caco-2 (Westerhout et al., 2014).

 

Рис. 3. Модель поляризованного эпителия кишечника, сформированная клетками Сасо-2 на полупроницаемых мембранах в культуральной среде. Срезы в направлении X–Y (a, б) и Y–Z (в). Окраска родамин-фаллоидином (красный) демонстрирует богатые актином микроворсинки на апикальной поверхности клеток, окраска ядер DAPI (синий) свидетельствует о разделении клеток на апикальную и базальную области. Контрольный препарат. Масштабная линейка: 10 мкм.

 

Для оценки роли кальциевых каналов в транспорте глюкозы мы провели иммунофлуоресцентный анализ пространственного распределения кальциевых каналов TRPV6 и глюкозного транспортера GLUT2 в условиях низкой (5 мМ) и высокой (50 мМ) нагрузки клеток глюкозой. Значения концентраций и время инкубации с глюкозой были выбраны согласно данным работы (Грефнер и др., 2010), в которой концентрация глюкозы в клетках Сасо-2 измерена глюкозооксидазным методом.

Интенсивность флуоресценции GLUT2 анализировали в апикальных и базальных областях с помощью сканирования в направлении осей X–Y и Y–Z. Было установлено, что глюкозный транспортер GLUT2 (рис. 4а, б) локализуется в цитоплазме клеток кишечного эпителия. Численное значение средней интенсивности флуоресценции клеток на каждом выбранном уровне сканирования получали с помощью программы ImageJ.

 

Рис. 4. Поляризованный эпителий кишечника, сформированный клетками Сасо-2 в условиях 3D-культивировании. Срез на уровне середины клетки в направлении X–Y (a, б). Окраска антителами против транспортера глюкозы GLUT2 (зеленый цвет) демонстрирует более высокую его концентрацию при нагрузке клеток 50 мМ глюкозы; масштабная линейка: 10 мкм; в – интенсивность флуоресценции (ИФ) GLUT2 в клетках, инкубированных в присутствии 5 мМ или 50 мМ глюкозы. Вертикальные отрезки – ошибки среднего значения, различия достоверны (*) при P < 0.05.

 

Показано, что иммунореактивность, выявленная с помощью FITС-конъюгированных вторичных антител, существенно увеличивалась при нагрузке клеток 50 мМ глюкозы. Результаты, представленные на рис. 4, демонстрируют, что после инкубации клеток как с 50 мМ, так и с 5 мМ глюкозы распределение сигнала от глюкозного транспортера GLUT2 находится ближе к центральной области поляризованных клеток, а не в ее апикальной или базальной части. Соответственно, у нас нет оснований полагать, что избыточная нагрузка клеток углеводами приводит к перемещению GLUT2 с базальной мембраны и встраиванию в апикальную мембрану (Kellett, 2001).

Анализ иммунофлуоресцентных изображений эпителия, окрашенного антителами против TRPV6, выявил, что уровень сигнала гораздо выше в клетках эпителия, которые испытывали нагрузку 50 мМ глюкозы, чем в клетках с нагрузкой 5 мМ глюкозы. Было замечено, что увеличение флуоресцентного сигнала (и соответственно присутствие каналов TRPV6) наблюдали только на апикальной поверхности мембраны. На уровне базальной мембраны уровень флюоресценции не отличался в клетках, предварительно инкубированных с разными концентрациями глюкозы (рис. 5).

 

Рис. 5. Поляризованый эпителий кишечника, сформированный клетками Сасо-2. Срез на уровне апикальной (a) и базальной (б) мембраны клеток в направлении X–Y. Окраска антителами против TRPV6 (красный цвет) демонстрирует более высокую концентрацию TRPV6 на апикальной поверхности при нагрузке клеток 50 мМ глюкозы; в, г – интенсивность флуоресценции (ИФ) TRPV6; масштабная линейка: 10 мкм. Вертикальные отрезки – стандартные ошибки среднего значения, различия достоверны (*) при P < 0.05.

 

Результаты иммуннофлуоресцентного окрашивания получили подтверждение также в экспериментах с использованием иммуноэлектронной микроскопии. Для электронно-микроскопического анализа предварительно инкубированные в солевом растворе клетки (с концентрациями глюкозы 5 или 50 мМ) обрабатывали специфическими антителами против TRPV6 и вторичными антителами, конъюгированными с золотом. Анализ ультратонких срезов эпителия показал значимо большее количество золотых частиц (10 нм), маркирующих каналы TRPV6, на апикальной мембране энтероцито-подобных клеток после их нагрузки 50 мМ, чем после нагрузки 5 мМ глюкозы (рис. 6б).

 

Рис. 6. Локализации каналов TRPV6 в клетках кишечного эпителия в зависимости от нагрузки глюкозой. Иммуноэлектронная микроскопия. Микрофотографии распределения частиц коллоидного золота (10 нм, стрелки), соответствующих каналам TRPV6 в клетках, нагруженных 5 нм и 50 мМ глюкозы; масштабная линейка: 100 нм; гистограмма показывает численное распределение частиц золота в клетках, инкубированных в присутствии 5 и 50 мМ глюкозы. Показаны средние значения и их ошибки, различия достоверны (*) при P < 0.05.

 

С помощью вестерн-блот-анализа в Тритон X-100-растворимых фракциях лизатов клеток Сасо-2 обнаружено присутствие белков ORAI1 и STIM1, ответственных за депо-зависимый вход кальция в клетки (рис. 7а). Более того, показано, что уровень кальциевого сенсора, белка STIM1, существенно снижается при нагрузке клеток 25 мМ глюкозы, в то время как белок Orai1, формирующий поры, по-видимому, не чувствителен к нагрузке клеток глюкозой. Кроме того, вестерн-блот-анализ выявил, что уровень субъединицы р65 транскрипционного фактора NF-kB, ответственного за экспрессию STIM1 (Eylenstein et al., 2012; DebRoy et al., 2014), также падает при увеличении нагрузки клеток 25 мМ глюкозы (рис. 7а).

 

Рис. 7. Влияние глюкозы на депо-зависимый вход кальция в клетки Сасо-2: а – Вестерн-блотинг: влияние различных концентраций глюкозы на содержание белков STIM1, ORAI1 и субъединицы p65 фактора NF-kB в клетках Сасо-2; б – более низкий депо-зависимый вход кальция (в ответ на действие тапсигаргина Tg) в клетки Сасо-2 после нагрузки их 25 мМ глюкозы (по сравнению с таковым после нагрузки клеток 2.5 мМ глюкозы). Показана зависимость интенсивности флуоресценции (ИФ) кальций-чувствительного зонда Fluo-4 (ось OY) от времени (ось OX) по данным прижизненной конфокальной микроскопии. Цветные линии на графиках показывают сигнал от разных клеток, находящихся в одном поле зрения.

 

Измерение уровня внутриклеточного кальция с использованием флуоресцентного кальций-чувствительного зонда Fluo-4 показало увеличение [Са²⁺]_i в ответ на действие активатора опустошения кальциевых депо-тапсигаргина, подтверждая тем самым активацию депо-зависимого входа кальция в клетки Сасо-2 (рис. 7б). Важно, что кальциевый ответ на действие тапсигаргина в клетках, инкубированных с 2.5 мМ глюкозы, был существенно выше, чем в клетках, насыщенных 25 мМ глюкозы (рис. 7б).

Обсуждение

Несмотря на то, что проблеме транспорта глюкозы в кишечном эпителии посвящено много работ, концепции функционального взаимодействия транспортеров глюкозы с катионными каналами только начинают формироваться в научном мире. Так, было показано, что при исключении Ca²⁺ из люминального перфузата при высоких концентрациях глюкозы всасывание глюкозы прекращается (Morgan et al., 2007). Поступающие данные указывают на участие [Ca²⁺]_i и кальциевых каналов в работе транспортеров глюкозы SGLT1 и GLUT2, однако детали такого взаимодействия остаются неясными. Отчасти это связано с трудностями проведения экспериментальных измерений в просвете кишечника и капиллярах крови.

Для выяснения роли кальциевых каналов в абсорбции глюкозы мы использовали клеточную in vitro модель кишечного эпителия человека, чтобы иметь возможность менять экспериментальные условия и изучать механизмы поглощения глюкозы на участке живой эпителиальной ткани человека (или органа), а не на одиночной клетке.

Наши результаты показали, что количество высокоселективных эпителиальных Ca²⁺-каналов TRPV6 существенно увеличивается при увеличении нагрузки эпителиальных клеток глюкозой. Следует особенно отметить, что присутствие каналов наблюдается в основном на апикальной поверхности мембраны и не меняется на базальной мембране, что указывает на необходимость присутствия каналов на участке, где происходит абсорбция глюкозы.

В работе было обнаружено, что количество кальциевых сенсоров эндоплазматического ретикулума STIM1, отвечающих за другой – депо-зависимый – вход кальция в клетки, напротив, существенно снижался. Эти результаты согласуются с уменьшением входа SOCE в условиях с избыточной нагрузкой глюкозой и указывают на реципрокные взаимодействия между двумя путями входа кальция: через кальциевые каналы TRPV6 и через кальциевый комплекс ORAI1/STIM1. Такой кальциевый баланс критически необходим для нормального функционирования клетки, поскольку избыток кальция, как и его недостаток, может быть губительным для клеток.

Известно, что NF-κB рекрутируется в сайты связывания в промоторах STIM1 и ORAI1 (DebRoy et al., 2014). Полученные результаты вестерн-блот-анализа продемонстрировали, что уровень р65, который был достаточно высок в клетках Сасо-2, существенно снижается при увеличении концентрации глюкозы в среде. Это может свидетельствовать о вероятном влиянии глюкозы на экспрессию STIM1 через регулирование экспрессии транскрипционного фактора NF-κB.

Из литературных источников известно влияние глюкозы на экспрессию многих генов. Например, в ответ на высокий уровень глюкозы изменяется экспрессия генов RASD1, GLRA1, VAC14, SLCO5A1, TMED3, SYT16, LEPREL2 и CHRNA5 (Hall et al., 2018), подтверждая тем самым вероятность влияния высокой концентрации глюкозы на прямую или опосредованную экспрессию генов, кодирующих кальциевые каналы.

Фактически глюкоза регулирует пути поступления Са²⁺, а Са²⁺ регулирует всасывание глюкозы. Считается, что высокая концентрация глюкозы деполяризуют апикальную мембрану энтероцита в результате активации натрий-глюкозного котранспортера, что приводит к увеличению абсорбции Ca²⁺. Связывание Ca²⁺ с белком кальбиндином-D9K предотвращает увеличение поглощения Ca²⁺ и стимулирует трансклеточный транспорт, который в принципе направлен на ослабление потенциального увеличения цитозольного Са²⁺ (Morgan et al., 2007).

Однако исследования поглощения кальция в клетках почек показали, что кинетика связывания Ca²⁺ с кальбиндином-D28K достаточно медленная относительно повышения цитозольного Ca²⁺ (Koster et al., 1995). Поэтому вполне логично предположить, что снижение кальция в клетке при высокой концентрации глюкозы происходит за счет ограничения других путей поступления Са²⁺ в клетку, например снижения входа SOCE.

В целом интеграция абсорбции глюкозы и поступления Ca²⁺ через кальциевые каналы представляет собой сложную систему реципрокных взаимодействий, которая позволяет быстро и точно сбалансировать пути поступления необходимых ионов и молекул при потреблении пищи.

Следует отметить, что мы не получили данных в пользу гипотезы, предполагающей всасывание глюкозы (особенно в диапазоне ее высоких концентраций) с помощью механизма облегченной диффузии с участием глюкозных транспортеров GLUT2 (Kellett, 2001; Kellett, Helliwell, 2000), которые при высоких углеводных нагрузках могут встраиваться в апикальную мембрану клеток кишечника и транспортировать глюкозу. Для понимания полной картины этого сложного процесса необходимы дополнительные исследования.

Благодарности

Клеточная линия Сасо-2 получена из ЦКП «Коллекция культур клеток позвоночных» Института цитологии РАН (Санкт-Петербург), которая поддержана Министерством науки и высшего образования РФ (соглашение № 075-15-2021-683).

Финансирование работы

Работа финансирована Российским научным фондом (проект № 22-25-00365).

Соблюдение этических стандартов

В работе отсутствуют исследования человека или животных.

Конфликт интересов

Авторы работы заявляют, что у них нет конфликта интересов.

About the authors

D. E. Bobkov

Institute of Cytology, Russian Academy of Sciences

Email: svsem@incras.ru
Russian Federation, St. Petersburg, 194064

A. V. Lukacheva

Institute of Cytology, Russian Academy of Sciences

Email: svsem@incras.ru
Russian Federation, St. Petersburg, 194064

L. V. Kever

Institute of Cytology, Russian Academy of Sciences

Email: svsem@incras.ru
Russian Federation, St. Petersburg, 194064

V. V. Furman

Institute of Cytology, Russian Academy of Sciences

Email: svsem@incras.ru
Russian Federation, St. Petersburg, 194064

S. B. Semenova

Institute of Cytology, Russian Academy of Sciences

Author for correspondence.
Email: svsem@incras.ru
Russian Federation, St. Petersburg, 194064

References

Supplementary files