Effect of the HSF1 inhibitor Cl-43 on tumors and non-transformed cells

Full Text

Принятые сокращения: HSF1 и pHSF1 – фактор белков теплового шока и его фосфорилированная форма по Ser326 соответственно; ДМСО – диметилсульфоксид.

Химиотерапия является одним из наиболее простых и эффективных способов борьбы с онкологическими заболеваниями. В большинстве случаев она способствует продлению жизни, но не гарантирует полного излечения. Химиотерапия использует препараты, уменьшающие вероятность возвращения опухоли и облегчающие симптомы заболевания (боль и прочие тяжелые последствия) (Ajmeera, Ajumeera 2023). Химиотерапия останавливает или замедляет рост быстрорастущих трансформированных клеток, но может оказывать токсическое воздействие и на нормальные клетки. Повреждение и гибель нормальных клеток, окружающих злокачественные клетки, является ключевым побочным эффектом, связанным с текущими стратегиями лечения (Gao et al., 2019). В связи с этим существует необходимость в поиске новых противоопухолевых соединений и стратегий лечения.

Сердечные гликозиды являются ингибиторами Na⁺/K⁺-АТФазы и в течение продолжительного времени используются в медицине для лечения некоторых сердечно-сосудистых заболеваний (Cerella et al., 2013). Однако они являются кандидатами на перепрофилирование, поскольку около 50 лет назад был обнаружен их противоопухолевый потенциал, который активно исследуют до сих пор. Несмотря на это, одним из серьезных ограничений работы с сердечными гликозидами как с противоопухолевыми препаратами является их высокая токсичность по отношению к здоровым тканям (Botelho et al., 2019).

В 2018 г. обнаружили сердечный гликозид из семейства карденолидов, который был назван CL-43 (Nikotina et al., 2018). Мишенью этого соединения является фактор теплового шока 1 (HSF1), уровень которого повышен у раковых клеток (Richard, Carpenter, 2019). Активный HSF1 совместно со своими мишенями поддерживает биосинтетические потребности раковой клетки, а также регулирует ответ на стресс, что в итоге приводит к поддержанию пролиферации, а затем инвазии и метастазированию (Carpenter et al., 2015). Во время исследования противоопухолевых способностей CL-43 было обнаружено, что эта молекула нетоксична в отношении опухолевых клеток, однако за счет подавления активности HSF1 и синтеза некоторых из ее мишеней (молекулярных шаперонов) молекулы CL-43 способствуют увеличению чувствительности опухолевых клеток к химиотерапевтическим препаратам (позволяя применять более низкие дозы), что в перспективе снизит негативное воздействие химиотерапии на организм (Nikotina et al., 2018). Однако для более качественной оценки потенциала этого соединения необходимо выяснить его влияние в отношении здоровой ткани.

В нашей работе мы сравнили влияние CL-43 на статус HSF1 в нетрансформированных клетках DF-2 и колоректальной карциномы DLD1, а также эффективность комбинированного воздействия CL-43 и этопозида на клетки этих линий.

Материал и методика

Клетки. Клетки колоректальной карциномы человека DLD1 были любезно предоставлены д-ром Н. А. Барлевым (ИНЦ РАН), линия нормальных фибробластов человека DF-2 была получена из ЦКП “Коллекция культур клеток позвоночных” Института цитологии РАН (Санкт-Петербург). Клетки линии DLD1 культивировали в среде DMEM (“БиолоТ”, Россия), DF-2 культивировали в среде DMEM F-12 (“БиолоТ”, Россия) при 37 °C и 5% CO₂. В среду для культивирования дополнительно вносили 10% фетальной эмбриональной бычьей сыворотки, 100 ед/мл пенициллина G и 0.1 мг/мл стрептомицина (“БиолоТ”, Россия).

Соединение CL-43 получали из коллекции InterBioScreen, растворяли в диметилсульфоксиде (ДМСО) до финальной концентрации 20 мМ и хранили при ‒20 °С. В текущем исследовании CL-43 использовали в следующих рабочих концентрациях: 0.125, 0.25 и 0.5 мкМ. В качестве противоопухолевого препарата мы использовали этопозид (SigmaAldrich, США) в концентрации 10 мкМ.

Анализ цитотоксичности в системе xCELLigence. Для сравнения чувствительности опухолевых и нетрансформированных клеток к комбинации препаратов CL-43 и этопозида использовали прибор xCELLigence (Agilent Technologies, США), который позволяет измерить в режиме реального времени клеточный индекс – безразмерный параметр, отражающий изменение сопротивления клеток (импеданс) в определенный момент, который коррелирует с количеством живых клеток на дне лунки.

Для анализа клеточного индекса в лунки 16-луночной E-платы, на дне которой вмонтированы золотые микроэлектроды, рассевали клетки DLD1 (8 тыс./лунка) и DF-2 (2 тыс./лунка) На следующий день меняли среду и одновременно вносили противоопухолевый препарат этопозид (10 мкМ) и/или CL-43 (0.25 мкМ) и далее на протяжении 40 ч каждые 10 мин оценивали клеточный индекс. Контролем служили клетки, в среду которых добавляли только ДМСО в концентрации, соответствующей таковой в среде с внесенным CL-43. Результаты обрабатывали в программе RTCA Data Analysis Software 2.0 (Acea Bio, США).

Иммуноблотинг. Для определения количества активного HSF1, фосфорилированного по Ser326, клетки линии DLD1 и DF-2 культивировали в присутствии 0.125, 0.25 или 0.5 мкМ CL-43 в течение 18 ч, затем их центрифугировали и трижды отмывали в фосфатно-солевом буферном растворе. Далее к клеточному осадку добавляли лизирующий буфер High RIPA (20 мМ Tris-HCl pH 7.5, 150 мМ NaCl, 0.1% Тритона X-100, 0.5% SDS, 1% дезоксихолата натрия, 2 мМ EDTA) и ингибитор протеаз PMSF. После этого пробы подвергали сонификации, центрифугировали при 13 400 об/мин и определяли концентрацию белка по методу Брэдфорд. Лизаты клеток (30 мкг на дорожку) использовали для проведения электрофореза и иммуноблотинга.

В работе использовали следующие первичные антитела: ранее полученные в лаборатории клоны 3B5 и 2H9 антител к HSP70, а к фосфорилированной по Ser326 форме HSF1 (SU31-03, ThermoFisher, США) антитела к тубулину (MA1-80017, ThermoFisher, США). Для визуализации белков готовили раствор для проявления (2 мМ TrisHCl pH 8.5, 1.25 мМ люминола, 68 мМ кумаровой кислоты, 0.1% H₂O₂) или раствор Femto-ECL (ThermoFisher, США), съемку мембраны проводили на приборе ChemiDoc (Bio-Rad, США).

Иммунофлуоресцентное окрашивание. Клетки DLD1 и DF-2 рассевали в лунки 24-луночного планшета, в которые предварительно помещали покровные стекла. На следующий день в среду добавляли 0.25 мкМ CL-43. После этого клетки промывали в PBS, фиксировали в 4%-ном растворе формалина и пермеабилизировали с помощью 0.1%-ного Тритона Х100. Далее проводили иммунологическое окрашивание во влажной камере с антителами к фосфорилированной форме pHSF1 (по Ser326) (Abcam, Великобритания), в качестве вторичных антител использовали флуоресцентные антитела с меткой GAR Alexa 488 (ThermoFisher, США). После этого трижды промывали PBS, далее окрашивали ядра флуоресцентным красителем DAPI (Sigma Aldrich, США). Для заключения препаратов использовали DAKO fluorescent mounting medium (DAKO corporation, США). Препараты исследовали с помощью конфокального микроскопа (OLYMPUS FV3000, Германия). Обработку результатов проводили с помощью программы Image J.

Статистический анализ. Использовали программу GraphPad Prism 8.0 (GraphPad Software, США). Для оценки различий между группами использовали t-тест Стьюдента, а также однофакторный дисперсионный анализ (One-way ANOVA) с апостериорными сравнениями по критерию Тьюки. Статистически значимыми считались различия при р < 0.05.

Результаты и обсуждение

Отличительной чертой карденолида CL-43 является его низкая способность влиять на жизнеспособность трансформированных клеток. Другие соединения из этой группы, оуабаин или дигитоксин, показывают противоопухолевые эффекты, но при более высоких концентрациях и обладают значительной токсичностью в отношении нормальных клеток, что затрудняет их применение в клинике (Kim et al., 2016; Shen et al., 2020).

В нашей работе мы решили более подробно осветить влияние CL-43 на опухолевые клетки, сравнив его с действием CL-43 на нормальные нетрансформированные клетки. В качестве модели последних мы выбрали дермальные фибробласты, полученные от здорового донора мужского пола (DF-2). Для этого мы использовали систему xCELLigence, которая позволяет наблюдать за пролиферативной активностью в режиме реального времени. Мы установили, что культивирование клеток DLD1 после добавления CL-43 (0.25 мкМ) и этопозида (10 мкМ) приводит через 24 ч к снижению клеточного индекса в 10 раз (2.46 ± 0.034) по сравнению с вариантом, когда вносится только этопозид (0.28 ± 0.15), что свидетельствует об усилении цитотоксического эффекта этопозида при его совместном использовании с CL-43 (рис. 1, верхняя панель). Аналогичный эксперимент, проведенный с клетками DF-2, показал, что внесение в среду только этопозида в той же концентрации приводит к снижению клеточного индекса до значения 0.3±0.34, в то время как внесение комбинации препаратов этопозида и CL-43 приводило к росту клеточного индекса до 1.1 ± 0.1. Эти данные свидетельствуют о возможных цитопротекторных свойствах CL-43 (рис. 1, нижняя панель).

 

Рис. 1. Изменения клеточного индекса клеток DLD1 и DF-2 в присутствии этопозида и/или CL-43. Клетки высевали в 16-луночные E-платы и культивировали в присутствии 10 мкМ этопозида и/или 0.25 мкМ CL-43 в течение 20 ч; съемку проводили с регистрацией клеточного индекса каждые 10 мин.

 

Так как СL-43 был обнаружен нами как ингибитор синтеза белка теплового шока HSP70, мы предположили, что различное влияние на чувствительность опухолевых и нормальных клеток может быть связано с разницей во влиянии на транскрипционный фактор белков теплового шока HSF1 и сам HSP70. Для проверки этой гипотезы мы культивировали клетки обеих линий в присутствии 0.125, 0.25 или 0.5 мкМ CL-43 в течение 20 ч, после чего их лизировали и подвергали электрофорезу и последующему иммуноблотингу.

Мы заметили, что CL-43 имеет разнонаправленный эффект в нетрансформированных фибробластах человека и опухолевых клетках. В клетках линии DLD1 наблюдали снижение количества HSP70 (на 65 ± 2%) и количества активной формы его транскрипционного фактора HSF1 (pHSF1, фосфорилированного поSer326) на 53 ± 1.4% при использовании рабочей концентрации CL-43 250 нМ (рис. 2а). В то же время действие CL-43 в такой же концентрации на клетки фибробластов человека DF-2 приводило к активации HSF1 и синтезу HSP70, о чем свидетельствовало возрастание их количества на 43 ± 1.7 и 37 ± 2.1% соответственно (рис. 2б).

 

Рис. 2. Изменение количества pHSF1 и его мишени HSP70 в клетках DLD1 (а) и DF-2 (б) под действием CL-43. Слева – иммуноблоты лизатов клеток после их культивирования в течение 20 ч в присутствии 0.125, 0.25 и 0.5 мкМ CL-43. Справа – графическое представление изменения интенсивности полос на блотах; интенсивность каждой зоны нормировали на тубулин, который использовали как контроль нагрузки. Интенсивность зон оценивали с помощью программы ImageLab.

 

Известно, что активация транскрипционного фактора белков теплового шока – это сложный и многоступенчатый процесс, включающий несколько стадий: 1) под действием высоких температур или других стрессовых воздействий, нарушающих нативную конформацию белков, шапероны рекрутируются для выполнения своих фолдирующих функций, высвобождая тем самым мономеры HSF1 (Guo et al., 2001; Neef et al., 2014); 2) HSF1 подвергается пост-трансляционным модификациям (в основном фосфорилированию), тримеризуется и транслоцируется в ядро (Dai, 2016); 3) в ядре проходят связывание с промоторной областью HSE (heat shock elements) благодаря ДНК-связывающему домену и гидрофобным повторам и активация транскрипции благодаря трансактивирующему домену (Neudegger et al., 2016). Как результат, проходит активация транскрипции ряда генов белков, задействованных в ответе на тепловой шок, и к ним относятся не только белки семейства HSP70.

Поскольку изложенные результаты обнаружили разницу количества активной формы pHSF1 после обработки CL-43 трансформированных и нетрансформированных клеток, мы предположили, что наше соединение может также влиять на транспорт pHSF1 в ядро клетки. Для проверки этого предположения мы использовали иммунофлуоресцентное окрашивание: клетки DF-2 и DLD1 культивировали при 250 нМ CL-43 в течение 20 ч, после чего окрашивали флкоресцентно меченными антителами к pHSF1. Мы установили, что обработка клеток DLD1 карденолидом CL-43 приводит к снижению количества активного pHSF1 (Ser326) как в цитоплазме, так и в ядре клетки на 49 ± 2.4% и 42 ± 2.2% соответственно (рис. 3a, б).

 

Рис. 3. Локализация активного HSF1(pHSF1) в клетках DLD1 (а) и его количественное распределение (б) после обработки CL-43 в концентрации 250 нм; а – конфокальная микроскопия; после фиксации клетки взаимодействовали с первичными антителами к pHSF1 и вторичными, конъюгированными с меткой Alexa 488. Ядра дополнительно окрашивали DAPI (синий цвет). Контролем служили клетки, в среду которых добавляли ДМСО в концентрации, соответствующей варианту с добавлением раствора CL-43; масштабная линейка: 5 мкм; б – гистограммы показывают средние значения и среднеквадратичные отклонения (из 100 клеток) интенсивности флуоресценции (усл. ед.) pHSF1 в цитоплазме и ядре; (***) – различие достоверно при p < 0.005.

 

Аналогичные исследования на линии клеток дермальных фибробластов вновь продемонстрировали отличные от опухолевых клеток результаты, а именно: после обработки клеток CL-43 не было значимых изменений уровня pHSF1 в цитоплазме, однако в ядре сигнал возрастал в 1.4 раза (рис. 4а, б).

 

Рис. 4. Локализация активного HSF1 (pHSF1) и его количественное распределение (б) в клетках DF-2 (а) после обработки CL-43 в концентрации 250 нм. Объяснения те же, что и к рис. 3. (*) – различие достоверно при p < 0.05; # – отсутствие достоверных различий.

 

Таким образом, мы установили, что найденное вещество по-разному действует на активность HSF1, активируя реакцию на стресс в нормальных и подавляя ее в раковых клетках. Существенным ограничением работы является то, что мы использовали клеточные линии разного происхождения, но сам факт ее выявления говорит, что нам удалось найти агент с двойным действием и с возможным перспективным применением в терапии сложных онкологических заболеваний. Механизм действия CL-43 на фактор стрессовой реакции до сих пор неизвестен, но несмотря на это, мы можем предполагать, что основной его мишенью, как представителя группы карденолидов, являются Na⁺/K⁺-АТФаза и связанная с ней Src-киназа (Banerjee et al., 2018), которая является важнейшим центром up-регуляции многих каскадов, в том числе и MEK/ERK (Wang et al., 2015). Помимо этого известно, что Src-киназа является важнейшим онкогеном и сверхэкспрессирована во многих опухолях, в отличие от нетрансформированных клеток (Irby, Yeatman, 2000). В то же время в литературе есть данные об участии MEK/ERK сигнального каскада в регуляции активности HSF1 как транскрипционного фактора, которые в числе прочего могут обеспечивать его фосфорилирование по Ser326 (Dai, 2018).

Таким образом, CL-43 является своего рода уникальным веществом, так как способен не только ингибировать главный активатор защитных механизмов в опухолевых клетках, но и повышать его уровень в здоровых клетках, что важно в контексте борьбы с побочными эффектами терапии. Несмотря на это, механизмы его работы все еще неизвестны и остаются предметом наших дальнейших исследований.

Благодарности

Авторы выражают благодарность д-ру Н. А. Барлеву за предоставление клеточной линии DLD1. Фибробласты линии DF-2 получены из ЦКП “Коллекция культур клеток позвоночных” Института цитологии РАН (Санкт-Петербург), которая поддержана Министерством науки и высшего образования РФ (соглашение № 075-15-2021-683).

Финансирование работы

Работа финансирована за счет средств Российского научного фонда (проект № 23-24-00538).

Соблюдение этических стандартов

В работе отсутствуют исследования человека или животных.

Конфликт интересов

Авторы работы заявляют, что у них нет конфликта интересов.

About the authors

S. A. Vladimirova

Institute of Cytology, Russian Academy of Sciences

Email: nikotina.ad@gmail.com
Russian Federation, St. Petersburg, 194064

B. A. Margulis

Institute of Cytology, Russian Academy of Sciences

Email: nikotina.ad@gmail.com
Russian Federation, St. Petersburg, 194064

I. V. Guzhova

Institute of Cytology, Russian Academy of Sciences

Email: nikotina.ad@gmail.com
Russian Federation, St. Petersburg, 194064

A. D. Nikotina

Institute of Cytology, Russian Academy of Sciences

Author for correspondence.
Email: nikotina.ad@gmail.com
Russian Federation, St. Petersburg, 194064

References

Supplementary files