Cytotoxic and antiproliferative activity of Helichrysum arenarium (Asteraceae) extract against tumor cell lines

全文:

В лечении онкологических больных остается много нерешенных проблем: выраженная токсичность многокурсовой химиотерапии; формирование множественной лекарственной устойчивости – приобретение опухолевыми клетками перекрестной резистентности к цитостатикам с разными механизмами действия и внутриклеточными мишенями, которые усугубляют друг друга и значительно снижают эффективность лечения [1]. Перспективными веществами для создания противоопухолевых препаратов могут быть биофлавоноиды. Показано, что флавоноиды экстракта аврана лекарственного способствуют активации апоптоза в опухолевых клетках за счет негативной регуляции антиапоптотических белков, оказывая на них избирательное воздействие, препятствуют развитию цитопротекторной аутофагии и, соответственно, развитию резистентности к химиотерапии, а также могут приводить к замещению опухолевой ткани соединительной и переводить клетки опухоли из фазы G1 клеточного цикла в состояние покоя G0 [2–11].

Бессмертник песчаный Helichrysum arenarium (L.) Moench – многолетнее травянистое растение семейства Сложноцветные, в цветках которого накапливаются биологически активные вещества, обусловливающие лекарственные свойства этого растения, в том числе флавоноиды [12]. Известно, что экстракт H. arenarium обладает противоопухолевой активностью в отношении перевиваемой саркомы 45 (уменьшает объем опухоли, вызывает некротические и дистрофические процессы в ней), а также благоприятно влияет на организм животных в целом [13–19].

Цель исследования – определение влияния флавоноидсодержащего экстракта бессмертника песчаного на семь линий опухолевых клеток человека: Jurkat, MCF-7, SK-BR-3, А549, РС-3, HCT-116, A498 и механизма его противоопухолевого воздействия. Для этого использовали флуоресцентные методы визуализации.

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ

Растительное сырье – цветки бессмертника песчаного собирали в Лысогорском районе Саратовской области в июле 2024 г.

Экстракт цветков H. arenarium получали согласно Патенту № 2482863 [20]. Цветки H. arenarium измельчали, экстрагировали 96%-ным спиртом на водяной бане, доводили до кипения и кипятили в течение 14–15 минут, затем выпаривали при температуре 55–60 °С, разводили выпаренный остаток сначала дистиллированной водой при температуре 40–50 °С, затем добавляли хлороформ в пропорции 4/5 части воды и 1/5 части хлороформа, охлаждали до комнатной температуры и центрифугировали со скоростью 1500 оборотов в минуту в течение 15 минут, затем водную фракцию отделяли и высушивали [20]. Методом молекулярной абсорбционной спектроскопии установлено, что данный экстракт содержит 73.48 мг флавоноидов в пересчете на рутин или 17.94 мг в пересчете на кверцетин на 1 г сухой массы экстракта [13]; и имеет следующий состав (с указанием их относительного содержания от всех флавоноидов): нарингин (13.91%) и его растворимый агрегат (21.39%), прунин (6.72%), кверцетин (1.29%), апигенин (13.62%), нарингенин (2.31%), 5-О-глюкозид апигенина (1.70%), а также изосалипурпозид (7.89%) и его агрегат (7.02%).

Полулетальную концентрацию экстракта рассчитывали согласно руководству [21].

Определение апоптоза методом двойного окрашивания аннексином V и йодистым пропидием на проточном цитофлуориметре. Индукцию апоптоза исследовали после инкубации с экстрактом Helichrysum arenarium в концентрации 0.9 мг/мл в течение 24 ч следующих клеточных линий: Т-клеточного лимфобластного лейкоза Jurkat, аденокарцином молочной железы MCF-7 и SK-BR-3, карциномы легкого А549, карциномы простаты РС-3, карциномы толстой кишки HCT-116, карциномы почки A498 из банка опухолевых культур НМИЦ онкологии им. Н. Н. Блохина. Культивирование клеток проводили в пластиковых флаконах в среде RPMI 4 (10% эмбриональной сыворотки, гентамицин, ампициллин, амфотерицин). Клетки культивировали в CO2-инкубаторе при 37 °С в течение 24 ч.

Исследование проводили с помощью Annexin-V FITC Apoptosis Kit (Invitrogen, Life Technologies, USA). Аннексин V связывается с фосфотидилсерином, выходящим наружу клеточной мембраны в ранней стадии апоптоза. Йодистый пропидий связывается с ДНК разрушенных клеток и является маркером поздней стадии апоптоза или некроза. В итоге определяли количество опухолевых клеток, находившихся на разных этапах их гибели (табл. 1): раннего апоптоза (квадрат Q4), позднего апоптоза (квадрат Q2) и некроза (квадрат Q1). Для проведения реакции клетки снимали, отмывали в PBS и ресуспендировали в аннексин-связывающем буфере в количестве 1 млн клеток/мл, затем переносили по 100 мкл клеток в пробирки, содержащие 5 мкл Annexin-V-FITC и 5 мкл PI. Инкубировали при комнатной температуре в темноте 15 минут. Добавляли 400 мкл аннексин-связывающего буфера и считали на проточном цитофлуориметре FACSCantoII (BecktonDickenson, USA.).

 

Таблица 1. Процентное распределение клеток опухолей при воздействии экстракта Helichrysum arenarium в концентрации 0.9 мг/мл по данным проточной цитофлуориметрии

Table 1. Flow cytofluorometric data of percentage distribution of tumor cells treated with 0.9 mg/ml extract of Helichrysum arenarium

Клеточные линии Cell lines	Группа Group	Квадрат Q3 Живые клетки Square Q3 Living cells (AnV–/PI–), %	Квадрат Q4 Ранние апоптотические клетки Square Q4 Early apoptotic cells (AnV+/PI–), %	Квадрат Q2 Поздние апоптотические клетки Square Q2 Late apoptotic cells (AnV+/PI+), %	Квадрат Q1 Некротические клетки Square Q1 Necrotic cells (AnV–/PI+), %
A549	Контроль Control	90.8 ± 3.1	3.0 ± 2.0	4.1 ± 1.2	2.3 ± 0.2
	Экстракт Extract	51.6 ± 4.2	36.1 ± 2.2	10.2 ± 2.4	1.2 ± 1.0
PC-3	Контроль Control	96.0 ± 3.0	1.6 ± 1.1	3.0 ± 1.0	0.2 ± 0.1
	Экстракт Extract	82.0 ± 4.0	6.0 ± 2.1	12.0 ± 2.1	0.7 ± 0.2
HCT-116	Контроль Control	79.4 ± 2.4	10.0 ± 3.0	8.0 ± 2.0	3.0 ± 1.2
	Экстракт Extract	37.4 ± 2.0	49.2 ± 5.2	11.7 ± 2.4	1.9 ± 1.0
MCF-7	Контроль Control	82.0 ± 5.0	0.8 ± 1.0	8.0 ± 2.2	9.9 ± 2.4
	Экстракт Extract	47.8 ± 3.4	8.0 ± 4.0	37.7 ± 4.2	7.0 ± 2.0
SK-BR-3	Контроль Control	97.0 ± 3.0	0.9 ± 0.4	2.3 ± 1.2	0.2 ± 0.1
	Экстракт Extract	94.2 ± 3.1	2.6 ± 0.8	2.7 ± 2.0	0.5 ± 0.3
Jurkat	Контроль Control	97.2 ± 1.5	1.4 ± 0.7	0.4 ± 0.2	1.0 ± 0.4
	Экстракт Extract	88.0 ± 6.0	4.3 ± 1.2	7.5 ± 2.1	0.9 ± 0.4

Примечание: полужирным шрифтом выделены значения, имеющие статистически значимые отличия от контроля при р < 0.05 критерия Крамера–Уэлча.

Note: values with statistically significant differences from the control at p < 0.05 by Cramer–Welch test are highlighted in bold.

 

Для обнаружения морфофункциональных изменений в культуре клеток А498 под воздействием экстракта на микроскопе Nikon применяли двойное окрашивание акридиновым оранжевым и йодистым пропидием, что позволило оценивать гибель опухолевых клеток апоптозом [16]. Эксперименты проводили в культуральных планшетах: три контрольные и три экспериментальных лунки для изучения каждой концентрации через 24 и 48 ч. Исследовали следующие концентрации экстракта: 0.9, 1.8, 3.6, 7.2 мг/мл.

Для анализа механизмов противоопухолевого действия экстракта проводили сравнение в контроле и эксперименте по следующим показателям: 1) цитотоксическая активность: количество мертвых клеток и отношение их числа к общему количеству клеток; 2) цитостатическая активность: общее количество клеток в поле зрения, количество мертвых и живых клеток и отношение их числа к общему количеству клеток, количество делящихся клеток и отношение их числа к количеству живых клеток; 3) апоптотическая активность: количество клеток с серпами, с пикнозом и в апоптозе и отношение их числа к количеству живых клеток; 4) аутофагосомная активность: количество клеток с аутофагосомами и отношение их числа к количеству живых клеток; 5) активность, приводящая к митотической катастрофе: количество полиплоидных клеток и отношение их числа к количеству живых клеток.

Статистическую обработку данных осуществляли с использованием программного обеспечения SPSS 17.0. Нормальность распределения признаков определяли с помощью критерия Шапиро–Уилка. Для сравнения показателей, полученных в исследовании при их параметрическом распределении, но без равенства дисперсий, использовали критерий Крамера–Уэлча (Т), при котором разность средних арифметических двух выборок (контрольной и экспериментальной) делится на естественную оценку среднего квадратического отклонения этой разности. При данном методе отличия средних с вероятностью более 95% (p > 0.05) определяются при Т ≥ 1.96. При непараметрическом распределении значимость различий между группами определяли при помощи критерия Манна–Уитни (U/Z-критерий) с вычислением медианы, 25 и 75 перцентиля, максимума и минимума. При данном методе отличия медиан определяются при Z ≥ 1.96 на уровне значимости p < 0.05 (с вероятностью более 95%).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Оценка активации апоптоза в опухолевых клетках линий Т-клеточного лимфобластного лейкоза Jurkat, аденокарциномы молочной железы MCF-7 и SK-BR-3, карциномы легкого А549, карциномы простаты РС-3, карциномы толстой кишки HCT-116, карциномы почки A498 под действием экстракта бессмертника. Под действием экстракта через сутки обнаруживали клетки в стадиях раннего апоптоза (от 36.1% на линии карциномы легкого A549 до 49.2% на линии карциномы толстой кишки HCT-116) и позднего апоптоза (от 11.7% на линии карциномы толстой кишки HCT-116 до 37.7% на линии аденокарциномы молочной железы MCF-7), что свидетельствует о наличии противоопухолевой активности у экстракта бессмертника и его способности активировать апоптоз при использовании экстракта в исследованной концентрации. Кроме того, клетки разных культур реагировали на экстракт по-разному: в одних культурах преобладала гибель клеток на стадии раннего апоптоза, в других – на этапе позднего апоптоза или даже путем полного разрушения клеток. При действии экстракта в концентрации 0.9 мг/мл наблюдали более 11% клеток, погибших апоптозом, в культурах клеток: A549, PC-3, HCT-116 и MCF-7 (табл. 1).

Исследование каспазо-зависимого пути апоптоза в опухолевых клетках Т-клеточного лимфобластного лейкоза Jurkat. На клеточной линии Jurkat был исследован каспазо-зависимый апоптоз (каспаза-3) на фоне экспозиции экстрактом бессмертника.

В эксперименте с anti-caspase-3-FITC (BD) получен достаточно выраженный сигнал – 10.1% положительных клеток. Установлено, что под действием экстракта бессмертника в опухолевой линии Jurkat апоптоз каспазо-зависимый и его индукция осуществляются через каспазу-3.

Исследование противоопухолевой активности на клетках рака почки человека А498 через 24 ч и 48 ч. Полулетальная концентрация экстракта бессмертника в отношении опухолевых клеток А498 7.22 мг/мл.

Состояние клеточной культуры рака почки человека А498 через 24 ч в контроле. Клетки рака почки человека А498 в контроле через 24 ч. имели полигональную форму и были хорошо прикреплены к подложке. Мертвые клетки в контроле единичны.

Состояние клеточной культуры рака почки человека А498 через 24 ч под действием экстракта. Большая часть клеток при концентрации 0.9 мг/мл имела округлую форму, что свидетельствует о потере их контакта с подложкой и заметном воздействии экстракта.

Исследование цитотоксической активности экстракта на клетки рака почки человека А498. Количество и отношение мертвых опухолевых клеток к общему количеству клеток А498 под воздействием экстракта через 24 ч увеличивались по сравнению с контролем при всех концентрациях. Количество мертвых клеток увеличилось по сравнению с контролем при 0.9–3.6 мг/мл более, чем в 2 раза, а при 7.2 мг/мл более, чем в 17 раз (табл. 2), что свидетельствует о наличии у экстракта выраженной цитотоксической активности в отношении клеток рака почки человека А498.

 

Таблица 2. Воздействие экстракта Helichrysum arenarium в разных концентрациях на клетки рака почки человека А498 через 24 ч

Table 2. Effect of Helichrysum arenarium extract in different concentrations on human renal cell carcinoma A498 cells after 24 h of treatment

Группа Group Показатели (в поле зрения) Indicators (in the field of view)	Контроль Control Median (Q1–Q3) [min–max]	Концентрации экстракта, мг/мл Extract concentrations, mg/mL
		0.9 Median (Q1–Q3) [min–max]	1.8 Median (Q1–Q3) [min–max]	3.6 Median (Q1–Q3) [min–max]	7.2 Median (Q1–Q3) [min–max]
форма клеток cell shape	вытянутая elongated	круглая round	круглая round	круглая round	круглая round
общее кол-во клеток total number of cells	138.0 (125–162.75) [106–192]	128.0 (119.5–133) [114–155] p = 0.193	120.0 (112–150) [109–173] p = 0.269	115.0 (110.5–137.5) [96–182] p = 0.155	152.0 (135.75–185.25) [108–196] p = 0.285
кол-во мертвых клеток number of dead cells	4.0 (2.25–8) [0–21]	9.0 (7–11.5) [5–34] p = 0.029	10.0 (7–13) [3–17] p = 0.028	9.0 (6.5–10.5) [5–13] p = 0.048	71.5 (68.5–92.75) [50–98] p < 0.01
отношение кол-ва мертвых клеток к общему кол-ву клеток ratio of the dead cells to the total number of cells	0.025 (0.02–0.07) [0–0.125]	0.060 (0.056–0.096) [0.037–0.25] p = 0.015	0.090 (0.06–0.1) [0.02–0.136] p = 0.012	0.080 (0.045–0.09) [0.038–0.114] p = 0.012	0.498 (0.475–0.504) [0.439–0.519] p < 0.01
кол-во живых клеток number of living cells	134.5 (119.5–150.5) [103–177]	110.0 (106.5–124) [100–146] p = 0.042	113.0 (101–144) [99–163] p = 0.105	105.0 (103.5–128) [85–175] p = 0.09	79.0 (67.25–93.5) [58–98] p < 0.01
отношение кол-ва живых клеток к общему кол-ву клеток ratio of the living cells to the total number of cells	0.970 (0.93–0.98) [0.87–1]	0.940 (0.9–0.94) [0.75–0.96] p = 0.015	0.900 (0.89–0.94) [0.86–0.97] p = 0.012	0.920 (0.91–0.96) [0.89–0.96] p = 0.012	0.502 (0.495–0.525) [0.481–0.561] p < 0.01
кол-во делящихся клеток number of dividing cells	2.0 (1.25–2.75) [0–4]	1.0 (0.5–2.5) [0–3] p = 0.234	2.0 (1–2) [0–3] p = 0.323	1.0 (1–2) [0–2] p = 0.089	0.0 (0–0) [0–1] p < 0.01
отношение кол-ва делящихся клеток к кол-ву живых клеток ratio of the dividing cells to the number of living cells	0.014 (0.009–0.018) [0–0.04]	0.010 (0.003–0.02) [0–0.28] p = 0.413	0.010 (0.009–0.02) [0–0.022] p = 0.738	0.010 (0.0095–0.013) [0–0.024] p = 0.318	0.000 (0–0) [0–0.01] p < 0.01
кол-во клеток с серпами number of sickle cells	1.0 (1–2) [0–4]	0.0 (0–1.5) [0–2] p = 0.082	0.0 (0–1) [0–2] p = 0.017	1.0 (0–1) [0–1] p = 0.026	0.0 (0–0.25) [0–3] p < 0.01
кол-во клеток с пикнозом number of pycnotic cells	4.5 (3.25–5.75) [2–7]	5.0 (4.5–6.5) [3–8] p = 0.196	4.0 (2–4) [2–8] p = 0.281	4.0 (4–5) [2–7] p = 0.975	4.0 (3.75–5) [2–5] p = 0.67
отношение кол-ва клеток с пикнозом к кол-ву живых ratio of pycnotic cells to the number of living cells	0.032 (0.02–0.04) [0.01–0.06]	0.040 (0.035–0.058) [0.027–0.08] p = 0.096	0.030 (0.02–0.035) [0.013–0.05] p = 0.681	0.038 (0.035–0.048) [0.011–0.067] p = 0.318	0.057 (0.045–0.063) [0.02–0.07] p = 0.08
кол-во клеток с апоптотическими тельцами number of cells with apoptotic bodies	0.0 (0–0) [0–1]	1.0 (0.5–1) [0–2] p = 0.003	0.0 (0–1) [0–2] p = 0.04	1.0 (0.5–1) [0–2] p = 0.03	0.0 (0–0.25) [0–1] p = 0.374
кол-во клеток с аутофагосомами number of cells with autophagosomes	8.0 (5–10.75) [3–14]	18.0 (7–20) [6–23] p = 0.06	9.0 (6–12) [4–30] p = 0.454	8.0 (7.5–9) [4–12] p = 0.927	3.0 (1.75–4.25) [0–5] p = 0.001
отношение кол-ва клеток с аутофагосомами к кол-ву живых клеток ratio of the cells with autophagosomes to the number of living cells	0.060 (0.04–0.07) [0.02–0.1]	0.140 (0.06–0.18) [0.05–0.21] p = 0.046	0.070 (0.04–0.12) [0.034–0.2] p = 0.237	0.078 (0.054–0.09) [0.032–0.16] p = 0.204	0.036 (0.021–0.047) [0–0.073] p = 0.03
кол-во полиплоидных клеток number of polyploid cells	4.0 (3–7.5) [1–13]	5.0 (4.5–6.5) [4–8] p = 0.314	14.0 (10–15) [5–20] p < 0.01	8.0 (7.5–9) [4–12] p = 0.087	0.5 (0–2) [0–2] p = 0.001
отношение кол-ва полиплоидных клеток к кол-ву живых клеток ratio of the polyploid cells to the number of living cells	0.030 (0.02–0.05) [0.007–0.09]	0.040 (0.039–0.056) [0.036–0.06] p = 0.09	0.110 (0.085–0.139) [0.037–0.18] p < 0.01	0.078 (0.054–0.09) [0.032–0.115] p = 0.015	0.005 (0–0.023) [0–0.029] p = 0.009

Примечание: полужирным шрифтом выделены значения, имеющие статистически значимые отличия от контроля. Значимость различий между группами определяли при помощи критерия Манна–Уитни (U/Z-критерий) с вычислением медианы, 25 и 75 перцентиля, максимума и минимума. При данном методе отличия медиан определяются при Z ≥ 1.96 на уровне значимости p < 0.05 (с вероятностью более 95%).

Note: Values with statistically significant differences from the control are highlited in bold. The significance of differences between groups was determined using the Mann–Whitney test (U/Z test) with calculation of the median, 25th and 75th percentiles, maximum and minimum. With this method, differences in medians are determined at Z ≥ 1.96 at a significance level of p < 0.05 (with a probability of more than 95%).

 

Исследование цитостатической активности на клетки А498. Общее количество опухолевых клеток в поле зрения достоверно не отличалось при воздействии экстракта в разных концентрациях через 24 ч по сравнению с контролем, однако показало тенденцию к снижению, причем нелинейного характера. Количество живых клеток через 24 ч также показало тенденцию к снижению при всех концентрациях экстракта, при этом достоверное снижение наблюдали только при 0.9 и 7.2 мг/мл. Отношение количества живых клеток к общему количеству клеток при всех концентрациях показало наличие у экстракта выраженного цитостатического действия. При оценке количества делящихся клеток на стадиях мета-, ана- и телофазы, не выявлено отличий между клетками под действием экстракта и контролем (табл. 2).

Исследование апоптотической активности в отношении клеток А498 через 24 ч. В результате оценки количества клеток с ядрами в виде серпов, клеток с пикнозом ядра, а также отношения количества таких клеток к количеству живых клеток не выявили отличий между клетками под действием экстракта и контролем. Однако количество клеток, распавшихся на апоптотические тельца, под действием экстракта от 0.9 до 3.6 мг/мг через 24 ч было не на много выше, чем в контроле, что свидетельствует о слабой апоптотической активности экстракта в отношении клеток А498 (табл. 2).

Исследование аутофагосомной активности в отношении клеток А498 через 24 ч. Для данной культуры клеток характерно наличие фагоцитарной активности даже без видимого воздействия. Так, в проведенном ранее in silico исследовании транскрипционного профиля линии А498 была установлена повышенная активность генов аутофагии [22]. По-видимому, возникновение аутофагосом способствует опухолевым клеткам поддерживать свою жизнеспособность, что позволяет говорить о цитопротекторной аутофагии. Количество клеток с аутофагосомами под действием экстракта через 24 ч снижалось при концентрации экстракта 7.2 мг/мл (табл. 2), что свидетельствует о способности экстракта при повышении концентрации препятствовать восстановлению клетки за счет цитопротекторной аутофагии.

Исследование активности, приводящей к митотической катастрофе, в отношении клеток А498 через 24 ч. Количество полиплоидных клеток и их отношение к общему количеству живых клеток при концентрации 7.2 мг/мл через 24 ч уменьшалось по сравнению с контролем (табл. 2), что свидетельствует об отсутствии способности экстракта вызывать гибель клеток митотической катастрофой.

Состояние клеточной культуры рака почки человека А498 через 48 ч в контроле. Клетки имели полигональную форму. Мертвые клетки в контроле были единичны. Общее количество клеток в поле зрения, количество мертвых и живых клеток заметно снижались к 48 ч (табл. 3). Появлялись единичные клетки, распавшиеся на апоптотические тельца. Увеличивалось количество полиплоидных клеток.

 

Таблица 3. Воздействие экстракта Helichrysum arenarium в разных концентрациях на клетки рака почки человека А498 через 48 ч

Table 3. Effect of Helichrysum arenarium extract in different concentrations on human renal cell carcinoma A498 cells after 48 h of treatment

Группа Group Показатели (в поле зрения) Indicators (in the field of view)	Контроль control Median (Q1–Q3) [min–max]	Концентрации экстракта, мг/мл Extract concentrations, mg/mL
		0.9 Median (Q1–Q3) [min–max]	1.8 Median (Q1–Q3) [min–max]
форма клеток cell shape	вытянутая elongated	круглая round	круглая round
общее кол-во клеток total number of cells	82.0 (63–102.5) [54–140]	40.0 (33.25–44.75) [28–67] p < 0.01	36.0 (32.25–40.75) [29–45] p < 0.01
кол-во мертвых клеток number of dead cells	1.0 (0–3) [0–10]	1.0 (0.25–1.75) [0–3] p = 0.786	1.0 (1–2.75) [0–6] p = 0.648
отношение кол-ва мертвых клеток к общему кол-ву клеток ratio of the dead cells to the total number of cells	0.010 (0–0.03) [0–10]	0.026 (0.0047–0.0425) [0–0.0625] p = 0.394	0.027 (0.0223–0.0765) [0–0.1875] p = 0.125
кол-во живых клеток number of living cells	79.0 (62–98.5) [54–132]	39.5 (33.25–43.5) [27–64] p < 0.01	33.5 (32.25–38.75) [26–44] p < 0.01
отношение кол-ва живых клеток к общему кол-ву клеток ratio of the living cells to the total number of cells	0.990 (0.97–1) [0.91–1]	0.974 (0.9575–0.9953) [0.9375–1] p = 0.394	0.973 (0.9235–0.9777) [0.8125–1] p = 0.125
кол-во делящихся клеток number of dividing cells	2.0 (2–2.5) [1–3]	1.0 (1–1.75) [0–2] p = 0.002	1.0 (1–2) [0–2] p = 0.018
отношение кол-ва делящихся клеток к кол-ву живых клеток ratio of the dividing cells to the number of living cells	0.024 (0.0185–0.0352) [0.0152–0.0423]	0.030 (0.0204–0.0434) [0–0.0714] p = 0.407	0.038 (0.0305–0.0462) [0–0.0606] p = 0.03
кол-во клеток с серпами number of sickle cells	2.0 (1.5–3) [0–6]	1.0 (0–1.75) [0–5] p = 0.02	0.0 (0–0) [0–1] p < 0.01
кол-во клеток с пикнозом number of pycnotic cells	4.0 (3–5) [3–12]	4.5 (4–5.75) [3–6] p = 0.575	4.0 (2.25–5) [2–8] p = 0.495
отношение кол-ва клеток с пикнозом к кол-ву живых ratio of pycnotic cells to the number of living cells	0.047 (0.404–0.0644) [0.0303–0.2]	0.119 (0.083–0.1438) [0.0667–0.2143] p < 0.01	0.104 (0.0696–0.1731) [0.05–0.3077] p = 0.007
кол-во клеток с апоптотическими тельцами number of cells with apoptotic bodies	1.0 (0–9) [0–21]	3.5 (1–6.75) [0–12] p = 0.551	1.5 (1–3.5) [0–5] p = 0.713
кол-во клеток с аутофагосомами number of cells with autophagosomes	7.0 (6–8.5) [6–16]	4.0 (3–6) [2–8] p < 0.01	5.0 (4–8.5) [3–12] p = 0.065
отношение кол-ва клеток с аутофагосомами к кол-ву живых клеток ratio of the cells with autophagosomes to the number of living cells	0.083 (0.0703–0.1417) [0.0577–0.2679]	0.117 (0.0719–0.1541) [0.0469–0.2424] p = 0.631	0.140 (0.1175–0.2466) [0.1111–0.3125] p = 0.015
кол-во полиплоидных клеток number of polyploid cells	10.0 (5.5–11) [3–19]	2.0 (0–2.75) [0–9] p < 0.01	1.5 (0–.2.75) [0–6] p < 0.01

Примечание: полужирным шрифтом выделены значения, имеющие статистически значимые отличия от контроля при р < 0.05.

Note: values that have statistically significant differences from the control at p < 0.05 are highlighted in bold.

 

Исследование цитотоксической активности в отношении клеток А498 через 48 ч. Количество мертвых клеток при всех концентрациях экстракта не отличалось от контроля (табл. 3). При концентрациях 0.9 и 1.8 мг/мл наблюдали тенденцию к снижению количества мертвых клеток по сравнению с уровнем через 24 ч (табл. 4), что свидетельствует о снижении цитотоксической активности экстракта на вторые сутки.

 

Таблица 4. Сравнение действия экстракта Helichrysum arenarium в концентрациях 0.9 и 1.8 мг/мл на клетки рака почки человека А498 через 24 ч и 48 ч

Table 4. Comparison of the effect of Helichrysum arenarium extract in concentrations of 0.9 and 1.8 mg/ml on human renal cell carcinoma A498 cells after 24 h and 48 h of treatment

Группа Group Показатели (в поле зрения) Indicators (in the field of view)	Контроль через 24 ч Control after 24 h Median (Q1–Q3) [min–max]	Контроль через 48 ч Control after 48 h Median (Q1–Q3) [min–max]	Экстракт 0.9 мг/мл через 24 ч Extract 0.9 after 24 h Median (Q1–Q3) [min–max]	Экстракт 0.9 мг/мл через 48 ч Extract 0.9 after 48 h Median (Q1–Q3) [min–max]	Экстракт 1.8 мг/мл через 24 ч Extract 1.8 after 24 h Median (Q1–Q3) [min–max]	Экстракт 1.8 мг/мл через 48 ч Extract 1.8 after 48 h Median (Q1–Q3) [min–max]
общее кол-во клеток total number of	138.0 (125–162.75) [106–192]	82.0 (63–102.5) [54–140] p < 0.01	128.0 (119.5–133) [114–155]	40.0 (33.25–44.75) [28–67] p < 0.01	120.0 (112–150) [109–173]	36.0 (32.25–40.75) [29–45] p < 0.01
кол-во мертвых клеток number of dead cells	4.0 (2.25–8) [0–21]	1.0 (0–3) [0–10] p = 0.022	9.0 (7–11.5) [5–34]	1.0 (0.25–1.75) [0–3] p < 0.01	10.0 (7–13) [3–17]	1.0 (1–2.75) [0–6] p < 0.01
кол-во живых клеток number of living cells	134.5 (119.5–150.5) [103–177]	79.0 (62–98.5) [54–132] p < 0.01	110.0 (106.5–124) [100–146]	39.5 (33.25–43.5) [27–64] p < 0.01	113.0 (101–144) [99–163]	33.5 (32.25–38.75) [26–44] p < 0.01
отношение кол-ва живых клеток к общему кол-ву клеток ratio of the living cells to the total number of cells	0.970 (0.93–0.98) [0.87–1]	0.990 (0.97–1) [0.91–1] p = 0.148	0.940 (0.9–0.94) [0.75–0.96]	0.974 (0.9575–0.9953) [0.9375–1] p < 0.01	0.900 (0.89–0.94) [0.86–0.97]	0.973 (0.9235–0.9777) [0.8125–1] p = 0.22
кол-во делящихся клеток number of dividing cells	2.0 (1.25–2.75) [0–4]	2.0 (2–2.5) [1–3] p = 0.938	1.0 (0.5–2.5) [0–3]	1.0 (1–1.75) [0–2] p = 0.581	2.0 (1–2) [0–3]	1.0 (1–2) [0–2] p = 0.403
кол-во клеток с серпами number of sickle cells	1.0 (1–2) [0–4]	2.0 (1.5–3) [0–6] p = 0.092	0.0 (0–1.5) [0–2]	1.0 (0–1.75) [0–5] p = 0.576	0.0 (0–1) [0–2]	0.0 (0–0) [0–1] p = 0.229
кол-во клеток с пикнозом number of pycnotic cells	4.5 (3.25–5.75) [2–7]	4.0 (3–5) [3–12] p = 0.912	5.0 (4.5–6.5) [3–8]	4.5 (4–5.75) [3–6] p = 0.301	4.0 (2–4) [2–8]	4.0 (2.25–5) [2–8] p = 0.615
кол-во клеток с апоптотическими тельцами number of cells with apoptotic bodies	0.0 (0–0) [0–1]	1.0 (0–9) [0–21] p = 0.001	1.0 (0.5–1) [0–2]	3.5 (1–6.75) [0–12] p = 0.019	0.0 (0–1) [0–2]	1.5 (1–3.5) [0–5] p = 0.074
кол-во клеток с аутофагосомами number of cells with autophagosomes	8.0 (5–10.75) [3–14]	7.0 (6–8.5) [6–16] p = 0.662	18.0 (7–20) [6–23]	4.0 (3–6) [2–8] p = 0.002	9.0 (6–12) [4–30]	5.0 (4–8.5) [3–12] p = 0.092
кол-во полиплоидных клеток number of polyploid cells	4.0 (3–7.5) [1–13]	10.0 (5.5–11) [3–19] p = 0.006	5.0 (4.5–6.5) [4–8]	2.0 (0–2.75) [0–9] p = 0.005	14.0 (10–15) [5–20]	1.5 (0–2.75) [0–6] p < 0.01

Примечание: полужирным шрифтом выделены значения, имеющие статистически значимые отличия от контроля при р < 0.05.

Note: values that have statistically significant differences from the control at p < 0.05 are highlighted in bold.

 

Исследование цитостатической активности в отношении клеток А498 через 48 ч. Общее количество опухолевых клеток в поле зрения при всех концентрациях экстракта по сравнению с контролем было заметно снижено (табл. 3), что на фоне отсутствия увеличения количества мертвых клеток свидетельствует о выраженной цитостатической активности экстракта на вторые сутки. Количество живых клеток было снижено на фоне экстракта в концентрациях 0.9 и 1.8 мг/мл. Через 48 ч наблюдали сходную тенденцию снижения общего количества клеток в поле зрения и количества живых клеток по сравнению с их уровнем через 24 ч (табл. 4), что также свидетельствует о выраженной цитостатической активности экстракта на вторые сутки.

Анализ апоптотической активности в отношении клеток А498 через 48 ч. Выявлено отсутствие апоптотической активности экстракта в отношении клеток А498 (табл. 3).

Анализ аутофагосомной активности в отношении клеток А498 через 48 ч. Количество клеток с аутофагосомами снижалось при концентрациях экстракта 0.9 и 1.8 мг/мл (табл. 3, 4), что свидетельствует о способности экстракта H. arenarium подавлять образование аутофагосом через 48 ч.

В результате ко вторым суткам у экстракта оставалась только выраженная способность к цитостатической активности в отношении клеток А498.

Таким образом, противоопухолевая активность экстракта H. arenarium реализуется через цитотоксическую, цитостатическую активности и снижение к способности опухолевых клеток образовывать аутофагосомы. В первые 24 ч воздействия на клетки рака почки человека А498 противоопухолевая активность экстракта H. arenarium реализуется через цитотоксическую, цитостатическую активность и снижение к способности образовывать аутофагосомы. В то время, как через 48 ч у экстракта остается только цитостатическая активность.

Полученные нами данные могут свидетельствовать о перспективности углубленного изучения молекулярных механизмов противоопухолевого, в том числе и апоптотического действия экстракта цветков H. arenarium, а также перспективности исследований и фитопрепарата из цветков бессмертника песчаного «Фламин» в отношении опухолевых клеток, так как сумма флавоноидов в нем в пересчете на изосалипурпозид и сухое вещество достигает 60% [23].

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В цветках бессмертника песчаного Helichrysum arenarium (L.) Moench обнаружены следующие флавоноиды: нарингин и его растворимый агрегат, прунин, кверцетин, апигенин и нарингенин, а также 5-О-глюкозид апигенина и изосалипурпозид. Нами в экспериментах in vitro выявлена противоопухолевая активность флавоноидсодержащего экстракта H. arenarium в отношении клеток семи линий Т-клеточного лимфобластного лейкоза Jurkat, аденокарцином молочной железы MCF-7 и SK-BR-3, карциномы легкого А549, карциномы простаты РС-3, карциномы толстой кишки HCT-116, карциномы почки A498. Так, более 11% клеток, погибших апоптозом, наблюдали при действии экстракта H. arenarium в концентрации 0.9 мг/мл на четырех культурах опухолевых клеток человека: карциномы легкого A549, карциномы простаты PC-3, карциномы толстой кишки HCT-116, аденокарциномы молочной железы MCF-7. В эксперименте с anti-caspase-3-FITC (BD) получен выраженный сигнал – 10.1% положительных клеток, установлено, что под действием экстракта H. arenarium в опухолевой линии Jurkat апоптоз каспазо-зависимый и его индукция осуществляется через каспазу-3.

В первые 24 ч воздействия на клетки рака почки человека А498 противоопухолевая активность экстракта H. arenarium реализуется через цитотоксическую, цитостатическую активность, и снижение к способности образовывать аутофагосомы; а через 48 ч у экстракта H. arenarium остается только цитостатическая активность. Наиболее активен экстракт в концентрации 7.2 мг/мл.

Перспективно дальнейшее углубленное изучение молекулярных механизмов противоопухолевого воздействия экстракта H. arenarium.

БЛАГОДАРНОСТИ

Работа частично финансирована грантом SSMU-2021-003 «Оценка эффективности противоопухолевого воздействия и индукции апоптоза в опухолевых клетках растительными экстрактами и БАДами в низких концентрациях».

Авторы заявляют, что конфликт интересов отсутствует.

В экспериментах животные и люди не участвовали.

作者简介

N. Polukonova

Saratov State Medical University named after V. I. Razumovsky

Email: kurchatova.marya@yandex.ru
俄罗斯联邦, Saratov

M. Kurchatova

Saratov State Medical University named after V. I. Razumovsky

编辑信件的主要联系方式.
Email: kurchatova.marya@yandex.ru
俄罗斯联邦, Saratov

N. Navolokin

Saratov State Medical University named after V. I. Razumovsky

Email: kurchatova.marya@yandex.ru
俄罗斯联邦, Saratov

M. Baryshnikova

National Medical Research Center of Oncology named after N. N. Blokhin

Email: kurchatova.marya@yandex.ru
俄罗斯联邦, Moscow

A. Mylnikov

Saratov State Medical University named after V. I. Razumovsky

Email: kurchatova.marya@yandex.ru
俄罗斯联邦, Saratov

A. Polukonova

Saratov State Medical University named after V. I. Razumovsky

Email: kurchatova.marya@yandex.ru
俄罗斯联邦, Saratov

N. Durnova

Saratov State Medical University named after V. I. Razumovsky; I. M. Sechenov First Moscow State Medical University

Email: kurchatova.marya@yandex.ru
俄罗斯联邦, Saratov; Moscow

参考

补充文件