Conservation of the vulnerable species Oxytropis chankaensis (Fabaceae) using in vitro culture

Cover Page

Cite item

Full Text

Abstract

The protocol of microclonal reproduction of Oxytropis chankaensis Jurtz. (a rare endemic species of the Primorye Territory) was developed for the first time. Seeds of the second year of storage were used as primary explants. Seed germination was 36%, and viability – 75%. Cultivation was carried out on Murashige and Skoog (MS) medium. The effect of four growth regulators (6-benzylaminopurine, thidiazuron, 1-naphthylacetic acid and indolе-3-butyric acid) in concentrations from 0.5 to 2 mg/l, and of their combinations on the reproduction index and rooting of microclones in vitro was evaluated. In the studied species, the positive effect of 0.5 mg/l thidiazuron and 2 mg/l indole-3-butyric acid on the multiplication of shoots was observed. On the growth media supplemented with the above growth regulators, the reproduction index was 6 and 7, respectively. Simultaneous application of two growth regulators into the nutrient medium leads to the formation of callus tissue, subsequently vitrified. Root formation is observed on MS medium supplemented with 1 mg/l indole-3-butyric acid or 0.5 mg/l 1-naphthylacetic acid.

Full Text

Виды со специализированной средой обитания и узким ареалом имеют больший риск исчезновения по сравнению с широко распространенными [11]. Таким видом является остролодочник ханкайский – Oxytropis chankaensis Jurtz. (Fabaceae), редкий эндемик Дальнего Востока, произрастающий на песчаных отложениях по юго-западному побережью озера Ханка.

В настоящий момент в международной базе The Plant List O. chankaensis указывается как O. hailarensis subsp. chankaensis (Jurtzev) Kitag., однако, имеется ряд исследований, в которых мнения о статусе Oxytropis chankaensis различаются. Так, в работе Л. И. Малышева [4] О. chankaensis приводится в качестве синонима O. hailarensis. Во Флоре Китая O. chankaensis и O. hailarensis относят в синонимы к O. oxyphylla, тогда как по данным Е. В. Артюковой и М. М. Козыренко [1] O. hailarensis и O. oxyphylla являются независимыми видами. Мы принимаем точку зрения Н. С. Павловой [5] и считаем O. chankaensis самостоятельным видом.

О. chankaensis – многолетние травянистые растения до 20–25 см высотой с непарно-перистосложными листьями, покрытыми белыми волосками. Имеют головчатое, шаровидное или продолговатое соцветие красно-фиолетового цвета [5]. Отмечается высокая декоративность вида как в период цветения, так и в период вегетации. Кроме того, остролодочник ханкайский обладает лекарственными свойствами [7, 9]. Вид имеет узко ограниченный ареал, к тому же территория его произрастания испытывает высокую антропогенную нагрузку, что может привести к его полному исчезновению. О. chankaensis охраняется в Ханкайском заповеднике [6]. Эксперимент по введению в культуру путем переноса растений на вегетативной стадии онтогенеза из естественного места обитания на территорию Ботанического сада-института ДВО РАН оказался не удачным, так как растения погибали (личное сообщение с.н.с. лаборатории флоры БСИ ДВО РАН В. А. Калинкиной). В настоящее время успешным способом сохранения О. chankaensis является криоконсервация семян [2, 3].

Сохранить О. chankaensis представляется возможным с помощью методов микроклонального размножения, что и явилось целью настоящего исследования.

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ

Объекты

В качестве первичных эксплантов использовали зрелые семена Oxytropis chankaensis, для скарификации и стерилизации которых использовали наиболее эффективный способ из проведенного ранее исследования [10], и микрорастения, полученные in vitro.

Реагенты

Для приготовления среды Мурасиге–Скуга (MS) использовали макро- и микроэлементы, а также витамины [16], агар-агар и регуляторы роста: 6-бензиламинопурин (6-БАП), 1-нафтилуксусная кислота (НУК) (SigmaAldrich, США), индолил-3-масляная кислота (ИМК) и тидиазурон (ТДЗ) (Natursim, Китай).

Питательные среды и условия

Во всех экспериментах использовали питательную 0.7%-ную агаризованную среду Мурасиге–Скуга (MS) с добавлением 3%-ной сахарозы. Перед автоклавированием pH среды доводили до значения 5.6–5.8. Автоклавировали c помощью парового стерилизатора Sanyo MLS-3781L (Япония) при 121 °C в течение 20 минут. Регуляторы роста добавляли в среду после автоклавирования. Стерилизацию эксплантов и пассажи проводили в условиях асептического ламинарного бокса БАВнп-01-«Ламинар-С»-1.5 (Россия). Экспланты, полученные из сеянцев in vitro, помещали на поверхность питательной среды МС с добавлением выше указанных регуляторов роста. В культуральной комнате поддерживали условия освещенности 2–3 тыс. лк. с белым флуоресцентным светом (Philips, Польша) и фотопериодом 16 часов, температура помещения составляла 23 ± 2 °C. После 21 дня культивирования оценивали морфогенный ответ. При необходимости наблюдения продолжали на той же среде.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Всхожесть семян второго года хранения составила 36%, жизнеспособность – 75%.

При исследовании влияния сочетания 6-БАП и НУК (табл. 1, рис. 1) на развитие O. сhankaensis был отмечен процесс каллусогенеза, что не согласуется с ранее описанным протоколом для вида из этого же рода [15], кроме того каллусообразование мы наблюдали при совместном добавлении в среду 1 мг/л 6-БАП и 0.5 мг/л ТДЗ, каллусные клетки были от светло-желтого до светло-зеленого цвета, мягкие, витрифицированные.

 

Таблица 1. Влияние регуляторов роста на морфогенез Oxytropis chankaensis

Table 1. The effect of growth regulators on the morphogenesis of Oxytropis chankaensis

Номер опыта

Experiment number

Концентрация регуляторов роста, мг/л

Concentration of growth regulators, mg/l

Морфогенный ответ

Morphogenic response

6-БАП

6-BAP

ТДЗ

TDZ

ИМК

IBA

НУК

NAA

1

0.5

–

–

–

Побеги

Shoots

2

2

–

–

–

Побеги у единичных экземпляров

Shoots in single specimens

3

–

0.5

–

–

Побеги

Shoots

4

–

1

–

–

Побеги

Shoots

5

–

–

1

–

Побеги и корни

Shoots. Roots

6

–

–

2

–

Побеги. Корни у единичных экземпляров

Shoots. Roots in single specimens

7

–

–

–

0.5

Побеги и корни.

Shoots. Roots

8

1

0.5

–

–

Каллус

Callus

9

2

–

–

0.5

Каллус

Callus

 

Рис. 1. Размножение Oxytropis chankaensis в культуре in vitro: a – на среде МС без регуляторов роста, b – МС + 0.5 мг/л 6-БАП; c – МС + 0.5 мг/л ТДЗ; d – МС + 0.5 мг/л НУК.

Fig. 1. Reproduction of Oxytropis chankaensis in vitro: a – on MS growth medium without growth regulators, b – MS + 0.5 mg/l 6-BAP; c – MS + 0.5 mg/l TDZ; d – MS + 0.5 mg/l NAA.

 

В исследовании О. В. Юрьевой с соавторами [8] показан положительный эффект 6-БАП без использования других экзогенных регуляторов для Oxytropis triphylla, что также было отмечено и в нашем исследовании. Культивирование эксплантов O. chankaensis на среде МС дополненной 0.5 мг/л 6-БАП приводило к образованию дополнительных побегов у всех растений, коэффициент размножения был равен 4 (табл. 2), однако, при увеличении содержания данного регулятора роста до 2 мг/л дополнительные растения давали лишь единичные экземпляры.

 

Таблица 2. Влияние регуляторов роста на размножение Oxytropis chankaensis

Table 2. The effect of growth regulators on reproduction of Oxytropis chankaensis

Номер опыта

Experiment number

Регулятор роста

Growth regulator

Коэффициент размножения

Reproduction index

1

0.5 мг/л 6-БАП

0.5 mg/l 6-BAP

4

3

0.5 мг/л ТДЗ

0.5 mg/l TDZ

6

4

1 мг/л ТДЗ

1 mg/l TDZ

4

5

1 мг/л ИМК

1 mg/l IBA

2

6

2 мг/л ИМК

2 mg/l IBA

7

7

0.5 мг/л НУК

0.5 mg/l NAA

2

 

Поскольку в биотехнологии растений все чаще стал использоваться регулятор роста тидиазурон (ТДЗ), который выполняет как функцию цитокинина, так и ауксина [13, 14], мы использовали данный регулятор в качестве дополнительного стимулятора размножения микрорастений. Отмечено, что при использовании данного регулятора роста в концентрации 0.5 мг/л среды коэффициент размножения составляет 6, при увеличении концентрации до 1 мг/л коэффициент снижается.

Перенос полученных жизнеспособных растений-регенерантов на среды MS, дополненные 1 и 2 мг/л ИМК, приводил к пролиферации новых побегов от 2 до 7, хотя данный регулятор роста обычно используется для индукции ризогенеза [12]. Процесс ризогенеза также отмечали на этих средах: при добавлении 1 мг/л ИМК образование корней происходило у всех микроклонов, при увеличении данного регулятора роста до 2 мг/л ризогенез отмечали у единичных экземпляров.

При культивировании полученных растений на среде MS с добавлением 0.5 мг/л НУК регистрировали образование корней у всех микроклонов. Также на данной среде мы регистрировали коэффициент размножения, равный 2.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Впервые разработан протокол микроклонального размножения Оxytropis chankaensis Jurtz. Показано, что использованные регуляторы роста способны инициировать образование новых побегов, но с разным коэффициентом размножения. Максимальный коэффициент отмечали на средах МС с добавлением 0.5 мг/л ТДЗ (6) и 2 мг/л ИМК (7). Образование корней наблюдали на средах, дополненных 1 мг/л ИМК и 0.5 мг/л НУК, у всех микроклонов. Использование комбинаций регуляторов роста 1 мг/л 6-БАП + 0.5 мг/л ТДЗ и 1 мг/л 6-БАП + 0.5 мг/л НУК приводило к образованию каллусной ткани, которая была витрифицирована. Добавление в питательную среду нескольких регуляторов роста одновременно вызывает высокую степень гидратации микрорастений и каллусов с последующей их гибелью.

БЛАГОДАРНОСТИ

Работа выполнена в рамках государственного задания Министерства науки и высшего образования РФ 122040800086-1 по теме «Введение в культуру, изучение и сохранение генетических ресурсов хозяйственно ценных растений Восточной Азии» на базе уникальной научной установки «Коллекция живых растений in vitro Ботанического сада-института ДВО РАН» (347296 – реестровый регистрационный номер на сайте http://ckp-rf.ru).

×

About the authors

A. S. Pianova

Botanical Garden-Institute FEB RAS

Email: k.berdasova@mail.ru
Russian Federation, Vladivostok

K. S. Berdasova

Botanical Garden-Institute FEB RAS

Author for correspondence.
Email: k.berdasova@mail.ru
Russian Federation, Vladivostok

R. V. Doudkin

Botanical Garden-Institute FEB RAS

Email: k.berdasova@mail.ru
Russian Federation, Vladivostok

Yu. E. Sabutski

Botanical Garden-Institute FEB RAS

Email: k.berdasova@mail.ru
Russian Federation, Vladivostok

References

  1. Artyukova E. V., Kozyrenko M. M. 2012. Phylogenetic relationships of Oxytropis chankaensis Jurtz. and Oxytropis oxyphylla (Pall.) DC. (Fabaceae) inferred from the data of sequencing of the ITS region of the nuclear ribosomal DNA operon and intergenic spacers of the chloroplast genome. — Russ. J. Genet. 48(2): 163–169. https://doi.org/10.1134/S1022795411110032
  2. Voronkova N. M., Kholina A. B. 2010. Conservation of endemic species from the Russian Far East using seed cryopreservation. — Biol. Bull. 37(5): 496–501. https://doi.org/10.1134/S1062359010050092
  3. Voronkova N. M., Kholina A. B. 2017. Germination biology and seed storage of endemic species of crazyweed genus (Oxytropis DC., Fabaceae family) from Siberia and Russian Far East. — Vestnik of Far Eastern Branch of Russian Academy of Sciences 2: 23–30. https://elibrary.ru/zizpkb (In Russian)
  4. Malyshev L. I. 2008. Diversity of the genus Oxytropis in Asian Russia. — Turczaninowia. 11(3): 5–141. https://elibrary.ru/jvhfqv (In Russian)
  5. Pavlova N. S. 1989. [Oxytropis DC.]. — In: [The vascular plants of the Soviet Far East]. Leningrad. Vol. 4. P. 236–280. (In Russian)
  6. Pavlova N. S. 2008. Oxytropis chankaensis (Jurtz.). — In: [The Red Data Book of Primorye Terootory: Plants. Rare and endangered species of plants and fungi]. Vladivostok. P. 136–137. https://redbookpk.ru/index_plants.html (In Russian)
  7. Pavlova N. S., Ulanova K. P. 1971. [To the chemical study of the Far Eastern species of the genus Oxytropis DC.]. — In: [Proc. conf.: Biologically active substances of flora and fauna of the Far East and the Pacific Ocean]. Vladivostok. P. 19. (In Russian)
  8. Yurjeva O. V., Gamburg K. Z., Kazanovskiy S. G. 2008. Clonal micropropagation of Oxytropis triphylla (Fabaceae). — Rastitelnye Resursy 44(3): 36–40. https://elibrary.ru/julbcv (In Russian)
  9. Shreter A. I. 1975. [Oxytropis hailarensis Kitag. f. chankaensis (Jurtz.) Kitag. [О. oxyphylla (Pall.) DC., S.L.]]. — In: [Medicinal flora of the Soviet Far East]. Moscow. P. 163. (In Russian)
  10. Berdasova K. S., Pianova A. S., Kameneva L. A. 2023. The effect of abiotic factors on in vitro seed germination in Oxytropis chankaensis Jurtz., a rare endemic species of the Russian Far East. — Botanica Pacifica. 12(2): 168–171. https://doi.org/10.17581/bp.2023.12206
  11. Burlakova L. E., Karatayev A. Y., Karatayev V. A., May M. E., Bennett D. L., Cook M. J. 2011. Endemic species: Contribution to community uniqueness, effect of habitat alteration, and conservation priorities. — Biological Conservation. 144(1): 155–165. https://doi.org/10.1016/j.biocon.2010.08.010
  12. Deepa A. V., Thomas T. D. 2020. In vitro strategies for the conservation of Indian medicinal climbers. — In Vitro Cell. Dev. Biol. — Plant. 56(6): 784–802. https://doi.org/10.1007/s11627-020-10084-x
  13. Guo B., Abbasi B. H., Zeb A., Xu L. L., Wei Y. H. 2011. Thidiazuron: a multi-dimensional plant growth regulator. — Afr. J. Biotechnol. 10: 8984–9000. https://doi.org/10.5897/AJB11.636
  14. Guo B., Stiles A. R., Liu C. Z. 2012. Thidiazuron enhances shoot organogenesis from leaf explants of Saussurea involucrate Kar. et Kir. — In Vitro Cell. Dev. Biol. — Plant. 48(6): 609–612. https://doi.org/10.1007/s11627-012-9468-6
  15. He W., Guo B., Fan P., Guo L., Wei Ya. 2015. In vitro propagation of a poisonous plant Oxytropis glabra (Lam.) DC. — Plant Cell. Tiss. Organ. Cult. 120(1): 49–55. https://doi.org/10.1007/s11240-014-0577-2
  16. Murashige T., Skoog F. 1962. A revised medium for rapid growth and bio assays with tobacco tissue cultures. — Physiol. Plant. 15(3): 473–497. https://doi.org/10.1111/j.1399-3054.1962.tb08052.x

Supplementary files

Supplementary Files
Action
1. JATS XML
Download
2. Fig. 1. Reproduction of Oxytropis chankaensis in vitro: a – on MS growth medium without growth regulators, b – MS + 0.5 mg/l 6-BAP; c – MS + 0.5 mg/l TDZ; d – MS + 0.5 mg/l NAA.

Download (148KB)
Indexing metadata

Copyright (c) 2025 Russian Academy of Sciences

Согласие на обработку персональных данных

 

Используя сайт https://journals.rcsi.science, я (далее – «Пользователь» или «Субъект персональных данных») даю согласие на обработку персональных данных на этом сайте (текст Согласия) и на обработку персональных данных с помощью сервиса «Яндекс.Метрика» (текст Согласия).