Changes in the genome of tick-borne encephalitis virus during cultivation

封面

如何引用文章

全文:

详细

The tick-borne encephalitis virus (TBEV) of the Siberian genotype was previously isolated from the brain of a deceased person. TBEV variants obtained at passages 3 and 8 on SPEV cells were inoculated into the brains of white mice for subsequent passages. Full-genome sequences of all virus variants were analyzed by high-throughput sequencing. The analysis showed the presence of 41 point nucleotide substitutions, which were mainly localized in the genes of non-structural proteins NS3 and NS5 of TBEV. In the deduced virus protein sequences, 12 amino acid substitutions were identified. After three passages through mouse brains, reverse nucleotide and amino acid substitutions were detected. Most of them were mapped in the NS5 protein gene, where 5 new nucleotide substitutions also appeared. At the same time, there was an increase in the length of the 3′-untranslated region (3′-UTR) of the viral genome by 306 nucleotides. The Y3 and Y2 3’-UTR elements were found to contain imperfect L and R repeats, which probably associated with inhibition of the activity of cellular XRN1 RNase and thus involved in the formation of sfRNA1 and sfRNA2. For all TBEV variants, high levels of infectious virus were detected both in cell culture and in the brain of white mice. The revealed changes in the genome that occur during successive passages of TBEV are most likely due to the significant genetic variability of the virus, which ensures its efficient reproduction in different hosts and active circulation in nature.

全文:

Сокращения: 3′-НТО – 3′-нетранслируемая область; ВКЭ – вирус клещевого энцефалита; ОТР – открытая рамка считывания.

Вирус клещевого энцефалита (ВКЭ) ‒ возбудитель одноименного заболевания, которое часто приводит к тяжелым поражениям центральной нервной системы, включая летальные исходы [1, 2]. ВКЭ эндемичен во многих регионах Северной Евразии, а в последнее время наблюдается его появление в новых географических регионах, что связано, по всей вероятности, с изменением ареалов иксодовых клещей ‒ переносчиков ВКЭ [3‒5].

Вирус клещевого энцефалита (Orthoflavivirus encephalitidis) относится к семейству Flaviviridae, род Orthoflavivirus (https://ictv.global/taxonomy) [2]. Этот род включает относительно просто устроенные РНК-содержащие сферические оболочечные вирусы размером 40–60 нм. Геном ВКЭ представлен одноцепочечной (+)РНК длиной 9 200‒11 500 нуклеотидов. Геномная РНК кодирует один полипротеин, который подвергается процессингу вирусными и клеточными протеазами с образованием трех структурных и семи неструктурных вирусных белков. Геномная флавивирусная РНК фланкирована 5′- и 3′- нетранслируемыми областями (НТО), принципиально важными для инициации вирусной репликации и формирования репликативного комплекса с участием вирусной РНК-зависимой РНК-полимеразы [6, 7]. Принято считать, что 5′- и 3′-НТО определяют скорость репликации вируса, полярность РНК, инкапсидацию генома и устойчивость к РНКазам [8–11].

ВКЭ подразделяется на три основных генотипа: европейский, дальневосточный и сибирский [12]. Недавно высказано предложение о выделении гималайского и байкальских генотипов ВКЭ [4, 13–15]. Уровень гомологии для различных генотипов ВКЭ составляет 82–85% для полногеномных нуклеотидных последовательностей и 92‒96% для аминокислотных [16, 17]. Генетические различия изолятов ВКЭ существенны даже в рамках одного генотипа вируса. Так, высокопатогенный для человека штамм Глубинное/2004 дальневосточного генотипа отличается от прототипных штаммов 205 и Софьин 53–57 аминокислотными заменами [16].

Высокая генетическая изменчивость ВКЭ позволяет высказать гипотезу о том, что генетический потенциал ВКЭ позволяет ему существенно изменяться и адаптироваться к новым типам клеток и видам хозяев. Это обеспечивает ВКЭ возможность легко интродуцироваться в новые биотопы. Так, ВКЭ обнаружен более чем у 40 видов диких птиц в Томске и его пригородах [18–20].

Нами исследована генетическая вариабельность (изменчивость) высокопатогенного для человека штамма С11-13 сибирского генотипа ВКЭ в процессе его адаптации к культивированию в лабораторных условиях.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Вирусный препарат. Штамм С11-13 ВКЭ сибирского генотипа, выделенный в 2013 году из мозговой суспензии человека, умершего от клещевого энцефалита в Мошковском районе Новосибирской области, описан ранее [21]. Все эксперименты с вирусным материалом проводили с соблюдением правил биобезопасности, регламентированных в СанПиН 3.3686-21.

Клеточная линия. Культура клеток SPEV была получена из банка клеточных культур ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор» и поддерживалась на среде DMEM, содержащей 10% эмбриональной сыворотки крупного рогатого скота (FBS; “Gibco”, США) и 80 мкг/мл сульфата гентамицина.

Лабораторные животные. В работе использовали 2–3-дневных сосунков беспородных мышей обоего пола массой 2‒3 г, полученных из питомника ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор». Все процедуры с животными проводили в соответствии с действующими документами: «Правила проведения работ с использованием экспериментальных животных» (https://docs.cntd.ru/document/456016716) и «Руководство по содержанию и использованию лабораторных животных» [22].

Проведение серийных пассажей ВКЭ. Аутбредным мышам интрацеребрально вводили 10 мкл вирусной суспензии, полученной после 3 и 8 пассажей ВКЭ С11-13 на культуре клеток SPEV [21]. Для последующих пассажей использовали 10%-ную мозговую суспензию, полученную от мышей на 3–4 сутки после заражения, в 50 мM боратном буфере (рН 9.0), содержащем 150 мМ хлористого натрия. Исследованные в работе варианты ВКЭ представлены в табл. 1.

 

Таблица 1. Исследованные варианты ВКЭ С11-13

Название штамма ВКЭ

История

Источник

GenBank Acc. No.

C11-13_1p

1 пассаж на клетках SPEV

Эта работа

OQ565596

C11-13_3p

3 пассажа на клетках SPEV

Описано ранее [21]

KP644245

C11-13_8p

8 пассажей на клетках SPEV

Эта работа

MF043953

С11-13_3/3m

C11-13_3 → 3 пассажа на мышах

Эта работа

OP902894

С11-13_8/3m

C11-13_8 → 3 пассажа на мышах

Эта работа

OP902895

 

Выделение и титрование ВКЭ. Вируссодержащий образец наносили на монослой культуры клеток SPEV и оставляли на 1 ч при комнатной температуре, после чего вносили среду DМЕМ, содержащую 2% FBS и 80 мкг/мл сульфата гентамицина. Затем инкубировали при 37 °C в течение 7 сут. Образцы, содержащие ВКЭ, титровали на клеточной культуре SPEV, используя 96-луночные культуральные микропланшеты. Концентрацию вируса оценивали по тканевому цитопатическому действию (ТЦПД50/мл) на клетках SPEV и методом иммуноферментного анализа. Вирус хранили аликвотами при –40 °C. Биологический титр вируса рассчитывали по Керберу [23].

Иммуноферментный анализ. ВКЭ в культуральной среде определяли методом иммуноферментного анализа на 96-луночных планшетах (“Nunk”, Дания), сенсибилизированных мышиными моноклональными анти-ВКЭ-антителами 10H10 (“Вектор”, Россия), как описано ранее [24]. Связавшийся с планшетом вирус детектировали с использованием меченных биотином мышиных моноклональных анти-ВКЭ-антител EB1 (“Вектор“) и стрептавидин-пероксидазного конъюгата (“ICN”, США).

Выделение РНК и ПЦР с обратной транскрипцией. Суммарную нуклеиновую кислоту выделяли из вируссодержащего материала с использованием набора реагентов ExtractRNA (“Евроген”, Россия); для построения первой цепи ДНК использовали набор MMLV RT kit (“Евроген”) по инструкциям производителя. Для проведения ПЦР использовали набор БиоМастер LR HS-ПЦР (“BioLabMix”, Россия) и олигонуклеотидные праймеры, специфичные к РНК ВКЭ, описанные ранее [6, 16, 24]. ПЦР проводили на амплификаторе T100 (“Bio-Rad Laboratories”, США) в следующем режиме: 5 мин при 94 оС, 40 циклов [10 с при 94 оС, 20 с при 58 оС, 30 с при 72 оC], 7 мин при 72 оС.

Определение нуклеотидных последовательностей по Сэнгеру и с использованием технологии высокопроизводительного секвенирования (NGS). Секвенирование ДНК-фрагментов выполняли по методу Сэнгера на автоматическом секвенаторе ABI 3130×l (“Hitachi“, Япония). Полногеномную нуклеотидную последовательность определяли с использованием технологии NGS. Для синтеза первой цепи кДНК использовали модуль NEBNext® Ultra Directional, для синтеза второй цепи ‒ NEBNext Ultra Directional RNA Second Strand Synthesis Module (“NEB”, США). Подготовленные ДНК-библиотеки анализировали на приборе MiSeq (“Illumina”, Великобритания). Для удаления адаптеров и повторного чтения использовали SAMtools (версия 0.1.18; https://www.htslib.org/download). Протяженные последовательности были собраны de novo с помощью ассемблера MIRA (версия 4.9.6; https://linux-packages.com/ubuntu-impish-indri/package/mira-assembler). Обработку результатов проводили с использованием специализированных программных пакетов MEGA 7/10 (“PSU”, США) и Lasergen 7 (“Invitrogen”, США).

Для поиска несовершенных повторов в вирусных геномах использовали диагональ матрицы локального сходства нуклеотидной последовательности Unipro UGENE:v45.1 (https://ugene.net/ru/download-all.html).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Генетический анализ вариантов штамма С11-13 ВКЭ после пассажей in vitro ‒ in vivo

Ранее был получен набор вариантов ВКЭ после нескольких последовательных пассажей штамма С11-13 ВКЭ на культурах перевиваемых клеток SPEV, HEK293, Neuro-2а [21]. Первые аминокислотные замены были обнаружены в неструктурных вирусных белках после трех пассажей. После восьми пассажей количество аминокислотных замен уже не изменялось. Варианты ВКЭ при пассажах на клетках SPEV накопили 9 аминокислотных замен, на культуре клеток HEK293 – 14; наименьшее число было обнаружено на клетках Neuro-2а ‒ всего 4 замены.

В проведенном нами исследовании штамм С11-13 ВКЭ после 3 и 8 пассажей на клетках SPEV трижды пассировали через мозг аутбредных белых мышей с последующим полногеномным секвенированием полученных изолятов: С11-13_3/3m и C11-13_8/3m соответственно (табл. 2). В последовательности вирусного генома идентифицирована 41 нуклеотидная замена, ассоциированная с адаптацией ВКЭ к клеткам SPEV c последующими пассажами через мозг мыши. Большинство нуклеотидных замен было в генах, кодирующих неструктурные белки вируса. Только 9 были картированы в генах белков капсида (С) и оболочки (Е). Наибольшее число замен (14) обнаружено в гене неструктурного белка NS5 при значении 0.12 для соотношения несинонимичных/синонимичных нуклеотидных замен (dN/dS). В генах неструктурных белков обнаружено 32 нуклеотидные замены, из которых 9 приводили к изменению кодируемой аминокислоты. Максимальное число аминокислотных замен идентифицировано в белках NS3 и NS5: 4 и 2 соответственно. Высокое значение dN/dS, равное 2.0, обнаружено в белке NS1, а минимальное (0.12) ‒ в NS5. Cоотношение dN/dS имело тенденцию к снижению при пассажах ВКЭ через мозг белых мышей в сравнении с культурами клеток.

 

Таблица 2. Нуклеотидные и аминокислотные замены в геноме штамма С11-13, адаптированного к клеткам SPEV, выявленные после дополнительных пассажей через мозг аутбредных белых мышей

aТемно-серым фоном выделены несинонимичные нуклеотидные замены и соответствующие им варианты ВКЭ с аминокислотными заменами; светло-серым фоном выделены синонимичные нуклеотидные замены.

bОтношение несинонимичных/синонимичных нуклеотидных замен, в скобках ‒ частное от деления.

 

Интересно отметить, что после трех пассажей вируса через мозг мышей у вариантов С11-13_3/3m и С11-13_8/3m обнаружено 7 реверсивных аминокислотных замен. Эти замены характерны для изолята вируса С11-13, выделенного от человека, но были замещены при последующих пассажах вируса (8 пассажей) на клетках SPEV. При адаптации от клеток SPEV к новому хозяину – мышам произошли замещения в белках: Е (Q367R), NS1 (N1067D), NS2b (R1488Q), NS3 (D1511N и F1906S) и NS5 (M2561K и S2925F).

Следует заметить, что в гене белка NS5 обнаружены реверсивные нуклеотидные замены: два блока по три синонимичных и две несинонимичные, – а также 5 новых. Кроме того, обнаружены мутации в белках Е (D347N и H699Q) и NS3 (T1890S).

Репликативная активность всех полученных вариантов ВКЭ (C11-13_3p, C11-13_8p, С11-13_3/3m и С11-13_8/3m) по сравнению с исходным изолятом (C11-13_1p) существенно увеличивалась после серийных пассажей на культуре клеток и через мозг животных. Так, после третьего пассажа штамма C11-13 на клетках SPEV (C11-13_3p) с появлением первых аминокислотных замен в NS3 (H1745Q) и NS5 (S2925F), титр вируса увеличился на 2 порядка: с 106 до 108 ТЦПД50/мл [21]. После восьмого пассажа вируса на клетках SPEV (C11-13_8p) и для всех вариантов вируса в 10%-ном гомогенате мозга мышей после третьего пассажа на 7 сутки после заражения (С11-13_3/3m и С11-13_8/3m) титр вируса составил 108 ТЦПД50/мл.

Размер генома и 3′-НТО в исследованных вариантах ВКЭ

При адаптации ВКЭ С11-13 к культивированию в лабораторных условиях обнаружено увеличение длины 3′-НТО (табл. 3). Ранее показано [7], что длина вариабельного участка 3′-НТО генома штамма С11-13, выделенного из мозга человека (C11-13_1p), составляет 107 н. Нами показано, что после 8 пассажей на клетках SPEV (С11-13_8) этот район увеличился на 37 н., а при пассажах на мышах ‒ на 306 н. относительно клинического изолята. Важно заметить, что консервативный участок 3′-НТО имел протяженность 320 н. во всех полученных вариантах вируса.

 

Таблица 3. Размер геномной РНК и 3′-НТО в исследованных вариантах штамма С11-13 ВКЭ

Штамм ВКЭ

Размер генома, н.

Длина 3′-НТО, н.

вариабельный участок

консервативный участок

весь регион

C11-13_1p

10 801

107

320

427

C11-13_3pа

10 838

144

320

464

С11-13_8

10 838

144

320

464

С11-13_3/3m

11 107

413

320

733

С11-13_8/3m

11 107

413

320

733

аОписано ранее [21].

 

Вариабельность длины 3′-НТО ВКЭ описана для ряда лабораторных штаммов, относящихся к разным генотипам ВКЭ, и она достигала максимального размера в 767 нуклеотидов для европейского генотипа (штамм Neudoerfl) [25]. На рис. 1 приведено выравнивание 3′-НТО генома ВКЭ относительно штамма Neudoerfl. Увеличение размеров 3′-НТО произошло за счет встраивания идентичных фрагментов в последовательности LRS4 и LRS3 ‒ в область энхансера вариабельного участка. В геноме флавивирусов энхансер располагается между стоп-кодоном и промотором и охватывает как консервативный, так и вариабельный участки 3′-НТО. По всей вероятности, наблюдаемая инсерция приводит к восстановлению шпилек SL10‒SL14, что повышает структурированность этой области. Схожая организации этого региона 3′-НТО также обнаружена у ВКЭ штамма PT-122 сибирского генотипа ВКЭ, изолированного из печени садовой камышовки (Acrocephalus dumetorum) и секвенированного нами ранее (GenBank Acc. No. KM019545).

 

Рис. 1. Схема организации 3′-НТО ВКЭ. В качестве прототипов сравнения взяты: европейский генотип ВКЭ (1, 2), сибирский генотип (3–6) и дальневосточный генотип (7, 8, 15, 16). Под номерами 11 и 12 обозначены варианты штамма ВКЭ С11-13, полученные на нормальных клетках эмбриональных почек человека (HEK293) и нейронов мыши (Neuro-2а) соответственно (GenBank Acc. No. MF043954, MF043955 соответственно). Пунктиром обозначены делеции в 3′-НТО; L и R – несовершенные повторы геномной РНК ВКЭ (длина 60 н., идентичность 57 % относительно штамма Glubinnoe/2004 (DQ862460)); SL1‒SL15 – структуры stem-loop (“петля-на-стебле”) в НТО; LRS1‒LRS6 – длинные повторяющиеся последовательности (long repeat sequences); rLRS – район протяженных повторяющихся последовательностей (region of long repeat sequences); Y1‒Y3 – Y-образные структуры НТО; 3′LSH –3′-концевая длинная стабильная шпилька (long stable hairpin). Цветовая схема – общепринятая в программе MEGA 7/10 (“PSU”, США) для нуклеотидов аденин (A), тимин (T), цитозин (C) и гуанин (G): зеленый, красный, голубой и фиолетовый соответственно.

 

И хотя функция энхансера может быть некритичной для жизнеспособности вируса в экспериментальных условиях, она может играть важную роль в естественной среде и в процессе адаптации вируса к новым хозяевам.

Обнаружение и картирование несовершенных повторов в 3′-НТО

В 3′-НТО геномной РНК ВКЭ, в районе энхансера, идентифицированы две нуклеотидные последовательности длиной 60 н. с гомологией 57 % (рис. 2). Эти несовершенные повторы обнаружены с помощью программы диагонали матрицы локального сходства нуклеотидной последовательности (Unipro UGENE:v45.1) В результате были найдены несовершенные повторы длиной 60 нуклеотидов с гомологией 57 %. Аналогические повторы с гомологией 52–57 % были найдены и для других вирусов (рис. 3). По осям X и Y расположена нуклеотидная последовательность, для которой проводили поиск несовершенных повторов. В частности, на рис. 2 использована прототипная последовательность штамма Glubinnoe/2004.

 

Рис. 2. Картирование несовершенных повторов в вариабельном участке 3′-НТО геномной РНК ВКЭ (прототипный штамм Glubinnoe/2004 (GenBank Acc. No. DQ862460)). Выполнено с помощью программы Unipro UGENE:v45.1 при длине сравниваемых последовательностей 60 нуклеотидов.

 

Рис. 3. Несовершенные повторы, выявленные для флави- и альфавирусов на вариабельном участке 3′-НТО геномной РНК. X и Y – координаты нуклеотидной последовательности, приведенной на диагонали матрицы в программе Unipro UGENE:v45.1 Уровень гомологии по данным Unipro UGENE:v45.1 несовершенных повторов составлял 52–57 %.

 

Важно заметить, что наличие аналогичных несовершенных повторов в 3′-НТО геномной РНК обнаружено нами для флавивирусов Повассан, Западного Нила, Кунджин, Денге серотипов 1 и 2, желтой лихорадки и омской геморрагической лихорадки, а также для вируса леса Семлики, относящегося к альфавирусам. Выровненные последовательности указанной области геномов этих вирусов приведены на рис. 3.

Факт наличия таких повторов в районе энхансера 3′-НТО, по-видимому, не случаен. Именно на этом участке нами зарегистрировано изменение длины геномной РНК и 3′-НТО для различных вариантов штамма С11-13 ВКЭ после последовательных пассажей на культуре клеток и через мозг белых мышей.

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

Некоторые РНК-содержащие вирусы эффективно преодолевают видовой барьер, что обусловлено более высокой изменчивостью РНК-генома в сравнении с геномами ДНК-содержащих вирусов [26, 27]. Высокая частота возникновения мутаций у РНК-содержащих вирусов считается “отправной точкой”, которая облегчает репродукцию вируса в новом типе клеток или новом виде хозяина, то есть это структурная основа для их высокой трансмиссивности и широкого диапазона хозяев [28–30]. Многие флавивирусы, в том числе ВКЭ, распространены на обширных территориях и размножаются в различных видах беспозвоночных (комары и клещи) и позвоночных организмов [31]. Природные и климатические условия в природных очагах вирусных инфекций также могут существенно отличаться. Флавивирусы активно циркулируют в различных климатических зонах ‒ от приполярных до экваториальных. Это значит, что они реплицируются в широком температурном интервале [18, 19]. Генетическая гетерогенность между генотипами ВКЭ составляет не менее 18%. В пересчете на полный геном ВКЭ это 2 000–2 200 нуклеотидов. Принято считать, что именно высокая генетическая изменчивость ВКЭ обеспечивает его циркуляцию в различных природных биотопах Северной Евразии и адаптацию к новым видам беспозвоночных и теплокровных хозяев при сохранении патогенного потенциала для человека [1].

В проведенном исследовании мы оценили генетическую вариабельность сибирского генотипа ВКЭ на примере высокопатогенного изолята С11-13 в процессе пассажей изолята из мозга погибшего человека на культуре клеток и через мозг аутбредных белых мышей. Для определения первичной структуры вирусного генома использовали технологию высокопроизводительного полногеномного секвенирования, что позволило проследить появление адаптационных мутаций в динамике.

Нуклеотидные замены появились в генах структурных и неструктурных белков ВКЭ уже через 3–8 пассажей вируса в культуре клеток SPEV и через 3 пассажа в мозге белых мышей. Это значит, что полевой (клинический) изолят ВКЭ быстро и эффективно адаптируется к новому хозяину; при этом большинство замен произошло в генах неструктурных белков и в кодируемых ими белках. Из идентифицированной нами 41 адаптационной мутации в геноме ВКЭ к генам структурных белков относилось только девять. Максимальное число нуклеотидных замен обнаружено в генах ns3 и ns5. Аналогичная картина наблюдалась по мутациям в аминокислотных последовательностях: три замены в структурном белке Е и девять в неструктурных белках.

Ранее показано, что структурные белки флавивирусов ‒ важные факторы вирулентности [31–33]. Cчитали, что белок Е играет ключевую роль в вирулентности ВКЭ [34]. Так, в ряде работ сообщалось, что изменения в структуре этого белка влияют на нейровирулентность и нейроинвазивность переносимых клещами флавивирусов [31, 35–37]. Некоторые из этих исследований были выполнены с использованием фрагментарного секвенирования генома. Немного позднее, в экспериментах с использованием обратной генетики и полногеномных последовательностей А. Румянцев (A. Rumyantsev) и соавт. [38] обнаружили, что вирулентность штаммов Sofjin-HO и Oshima 5-10 ВКЭ не ассоциирована со структурными белками, а тесно связана с генами неструктурных белков и их 3′-НТО. Полученные нами результаты с использованием высокопроизводительного полногеномного секвенирования вполне согласуются с этими данными и гипотезой о важной роли неструктурных белков в адаптации ВКЭ к новому типу клеток и новым хозяевам.

Интересно, что после трех пассажей через мозг мышей в вариантах С11-13_3/3m и С11-13_8/3m выявлено 7 реверсивных аминокислотных замен, то есть “возвращающих” адаптированные к клеткам SPEV варианты (С11-13_3 и С11-13_8) к исходному изоляту из мозга человека. В прошедших пассажи через мозг мышей вариантах ВКЭ в гене ns5 обнаружено 6 синонимичных и 2 несинонимичных нуклеотидных замен реверсного характера и 5 новых мутаций.

Нами выявлено значительное удлинение вариабельного участка 3′-НТО ВКЭ при пассажах через мозг белых мышей варианта, предварительно адаптированного к клеткам SPEV. Увеличение длины составило 306 н. для вариантов С11-13_3/3m и С11-13_8/3m. Ранее, в процессе серийных пассажей ВКЭ на клетках SPEV, Neuro-2A, НЕК293, тоже были обнаружены короткие вставки в вариабельном районе 3′-НТО, хотя их длина была в интервале 22‒37 н. [7, 21]. Известно, что 3′-НТО флавивирусов высокоструктурирована и содержит такие структуры, как петля-на-стебле, шпильки, гантелеобразные и Y-образные элементы [25, 30]. Как известно, 5’- и 3′-НТО обеспечивают взаимодействие геномной вирусной РНК с РНК-зависимой РНК-полимеразой, тем самым инициируя синтез новой вирусной РНК. Консервативный район 3′-НТО может быть ответственен за определение хозяйской специфичности флавивирусов. Недавно показано, что 3′-НТО является источником по меньшей мере двух видов некодирующих РНК, которые влияют на репликацию и/или патогенез флавивирусов: субгеномная флавивирусная РНК (sfRNA) и микроРНК (KUN-miR-1), ‒ в формировании которых участвует экзорибонуклеаза-1 (XRN1) [39–46]. XRN1 узнает уникальную трехспиральную кольцеобразную структуру, которая складывается из Y-структур 5′-НТО и “псевдоузла” на 3′-НТО, и образует из нее sfRNA. sfRNA противодействует реакциям врожденного иммунитета (ингибируя индукцию интерферонов), снижает активность XRN1 и Dicer и взаимодействует непосредственно с вирусным репликативным комплексом, регулируя его активность [47–50]. Структурные элементы 3′-НТО также могут блокировать активность XRN1. Предполагается, что sfRNA останавливает деградацию вирусной геномной РНК на расстоянии примерно 525 нуклеотидов от конца 3′-НТО. Это предотвращает полную деградацию вирусной геномной РНК и приводит к накоплению sfRNAs в инфицированных клетках [43, 51]. Элементы Y3 и Y2 3′-НТО расположены соответственно в конце вариабельного и начале консервативного участка. Они, по всей вероятности, обеспечивают формирование sfRNA1 и sfRNA2 соответственно.

Обнаруженные нами в области энхансера геномной РНК ВКЭ несовершенные нуклеотидные повторы L и R, вероятно, участвуют в регулировании активности клеточной XRN1 через элементы Y2 и Y3 (рис. 4). Увеличение длины 3′-НТО может быть критически важно для репликации вирусного генома при адаптации ВКЭ к лабораторным условиям культивирования, что в конечном счете обеспечивает возможность эффективной репродукции ВКЭ в различных типах клеток и при пассажах через мозг мыши.

 

Рис. 4. Механизм расщепления вирусной РНК экзорибонуклеазой XRN1 с формированием sfRNA ВКЭ. На рисунке подчеркиванием отмечены несовершенные L- и R-повторы, которые имеют гомологию 52–57 % и образуют правую часть петель Y3 и Y2 соответственно. SP, NSP – структурные и неструктурные белки флавивирусов соответственно.

 

Таким образом, обнаруженные нами изменения в геноме ВКЭ, прошедшем пассажи в клеточной культуре и через мозг мышей, относятся к точечным заменам нуклеотидов, локализованным преимущественно в генах неструктурных белков и иногда приводящим к мутациям в аминокислотном составе кодируемых ими полипротеинов. При пассажах через мозг мыши наблюдалась реверсия основной части замен к исходному штамму ВКЭ, выделенному из мозга человека. Кроме того, выявлено значительное увеличение длины вариабельной части 3′-НТО и высказано предположение, что это связано с ингибированием активности клеточной XRN1, участвующей в формировании sfRNA1 и sfRNA2. По всей вероятности, обнаруженные адаптационные мутации обеспечивают высокий уровень репродукции инфекционного ВКЭ как на культуре клеток, так и в мозге белых мышей.

Подобные множественные геномные изменения ВКЭ могут играть важную роль в обеспечении выживания ВКЭ в постоянно меняющихся природных условиях и при адаптации вируса к новым видам хозяев.

Авторы выражают искреннюю благодарность к. ф.-м. н. Швалову Александру Николаевичу за обсуждение результатов и помощь в обработке данных при метагеномном секвенировании.

Исследование выполнено в рамках Государственного задания 9/21 и 7/21 Государственного научного центра вирусологии и биотехнологии “Вектор” Роспотребнадзора.

Все процедуры с животными проводили в соответствии с действующими документами: «Правила проведения работ с использованием экспериментальных животных» (https://docs.cntd.ru/document/456016716) и «Руководство по содержанию и использованию лабораторных животных» (Washington, 1996), а также в соответствии с протоколом, утвержденным комиссией по биоэтике № 1 при Государственном научном центре вирусологии и биотехнологии “Вектор” Роспотребнадзора (протокол № 1-04.2021 от 30 апреля 2021 г.).

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

×

作者简介

V. Ternovoi

Department of Molecular Virology for Flaviviruses and Viral Hepatitis, State Research Center for Virology and Biotechnology “Vector”

Email: ponomareva_ep@vector.nsc.ru
俄罗斯联邦, Koltsovo, Novosibirsk Region, 630559

E. Ponomareva

Department of Molecular Virology for Flaviviruses and Viral Hepatitis, State Research Center for Virology and Biotechnology “Vector”

编辑信件的主要联系方式.
Email: ponomareva_ep@vector.nsc.ru
俄罗斯联邦, Koltsovo, Novosibirsk Region, 630559

E. Protopopova

Department of Molecular Virology for Flaviviruses and Viral Hepatitis, State Research Center for Virology and Biotechnology “Vector”

Email: ponomareva_ep@vector.nsc.ru
俄罗斯联邦, Koltsovo, Novosibirsk Region, 630559

N. Tupota

Department of Molecular Virology for Flaviviruses and Viral Hepatitis, State Research Center for Virology and Biotechnology “Vector”

Email: ponomareva_ep@vector.nsc.ru
俄罗斯联邦, Koltsovo, Novosibirsk Region, 630559

T. Mikryukova

Department of Molecular Virology for Flaviviruses and Viral Hepatitis, State Research Center for Virology and Biotechnology “Vector”

Email: ponomareva_ep@vector.nsc.ru
俄罗斯联邦, Koltsovo, Novosibirsk Region, 630559

V. Loktev

Department of Molecular Virology for Flaviviruses and Viral Hepatitis, State Research Center for Virology and Biotechnology “Vector”

Email: ponomareva_ep@vector.nsc.ru
俄罗斯联邦, Koltsovo, Novosibirsk Region, 630559

参考

  1. Charrel R.N., Attoui H., Butenko A.M., Clegg J.C., Deubel V., Frolova T.V., Gould E.A., Gritsun T.S., Heinz F.X., Labuda M., Lashkevich V.A., Loktev V., Lundkvist A., Lvov D.V., Mandl C.W., Niedrig M., Papa A., Petrov V.S., Plyusnin A., Randolph S., Süss J., Zlobin V.I., de Lamballerie X. (2014) Tick-borne virus diseases of human interest in Europe. Clin. Microbiol. Infect. 10(12), 1040‒1055. https://doi.org/10.1111/j.1469-0691.2004.01022.x
  2. Ruzek D.Z., Avšič Županc T., Borde J., Chrdle A., Eyer L., Karganova G., Kholodilov I., Knap N., Kozlovskaya L., Matveev A., Miller A.D., Osolodkin D.I., Överby A.K., Tikunova N., Tkachev S., Zajkowska J. (2019) Tick-borne encephalitis in Europe and Russia: review of pathogenesis, clinical features, therapy, and vaccines. Antiviral Res. 164, 23–51. https://doi.org/10.1016/j.antiviral.2019.01.014
  3. Khasnatinov M.A., Ustanikova K., Frolova T.V., Pogodina V.V., Bochkova N.G., Levina L.S., Slovak M., Kazimirova M., Labuda M., Klempa B., Eleckova E., Gould E.A., Gritsun T.S. (2009) Non-hemagglutinating flaviviruses: molecular mechanisms for the emergence of new strains via adaptation to European ticks. PLoS One. 4, e7295. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0007295
  4. Deviatkin A.A., Kholodilov I.S., Vakulenko Y.A., Karganova G.G., Lukashev A.N. (2020) Tick-borne encephalitis virus: an emerging ancient zoonosis? Viruses. 12, 247. https://doi.org/10.3390/v12020247
  5. Wang S.S., Liu J.Y., Wang B.Y., Wang W.J., Cui X.M., Jiang J.F., Sun Y., Guo W.B., Pan Y.S., Zhou Y.H., Lin Z.T., Jiang B.G., Zhao L., Cao W.C. (2023) Geographical distribution of Ixodes persulcatus and associated pathogens: analysis of integrated data from a China field survey and global published data. One Health. 16, 100508. https://doi.org/10.1016/j.onehlt.2023.100508
  6. Сhausov Е.V., Ternovoi V.A., Protopopova E.V., Kononova J.V., Konovalova S.N., Pershikova N.L., Loktev V.B., Romanenko V.N., Ivanova N.V., Bolshakova N.P., Moskvitina N.S. (2010) Variability of the tick-borne encephalitis virus genome in the 5′ noncoding region derived from ticks Ixodes persulcatus and Ixodes pavlovskyi in Western Siberia. Vector Borne Zoonotic Dis. 10, 365‒375. https://doi.org/10.1089/vbz.2009.0064
  7. Ternovoi V.A., Gladysheva A.V., Ponomareva E.P., Mikryukova T.P., Protopopova E.V., Shvalov A.N., Konovalova S.N., Chausov E.V., Loktev V.B. (2019) Variability in the 3′ untranslated regions of the genomes of the different tick-borne encephalitis virus subtypes. Virus Genes. 55, 448‒457. https://doi.org/10.1007/s11262-019-01672-0
  8. Gritsun T.S., Gould E.A. (2006a) The 3’ unrtanslated region of tick-borne flaviviruses originated by the duplication of long repeat sequences within the open reading frame. Virology. 354, 217‒223. https://doi.org/10.1016/j.virol.2006.03.052
  9. Gritsun T.S., Gould E.A. (2006b) Direct repeats in the 3’ untranslated regions of mosquito-borne flaviviruses: possible implications for virus transmission. J. Gen. Virol. 87(Pt. 11), 3297‒3305. https://doi.org/10.1099/vir.0.82235-0
  10. Gritsun T.S., Gould E.A. (2007b) Origin and evolution of flavivirus 5’ UTRs and panhandles: trans-terminal duplications? Virology. 366, 8‒15. https://doi.org/10.1016/j.virol.2007.04.011
  11. Alvarez D.E., Filomatori C.V., Gamarnik A.V. (2008) Functional analysis of dengue virus cyclization sequences located at the 5′ and 3′ UTRs. Virology. 375, 223‒235.
  12. Ecker M., Allison S.L., Meixner T., Heinz F.X. (1999) Sequence analysis and genetic classification of tick-borne encephalitis viruses from Europe and Asia. J. Gen. Virol. 80(Pt. 1), 179–185. https://doi.org/10.1099/0022-1317-80-1-179
  13. Demina T.V., Dzhioev Y.P., Verkhozina M.M., Kozlova I.V., Tkachev S.E., Plyusnin A., Doroshchenko E.K., Lisak O.V., Zlobin V.I. (2010) Genotyping and characterization of the geographical distribution of tick-borne encephalitis virus variants with a set of molecular probes. J. Med. Virol. 82, 965–976. https://doi.org/10.1002/jmv
  14. Kozlova I.V., Demina T.V., Tkachev S.E., Doroshchenko E.K., Lisak O.V., Verkhozina M.M., Karan L.S., Dzhioev Y.P., Paramonov A.I., Suntsova O.V., Savinova Y.S., Chernoivanova O.O., Ruzek D., Tikunova N.V., Zlobin V.I. (2018) Characteristics of the Baikal subtype of tick-borne encephalitis virus circulating in Eastern Siberia. Acta Biomedica Scientifica. 3(4), 53–60. https://doi.org/10.29413/ABS.2018-3.4.9
  15. Dai X., Shang G., Lu S., Yang J., Xu J. (2018) A new subtype of eastern tick-borne encephalitis virus discovered in Qinghai-Tibet Plateau, China. Emerg. Microbes Infect. 7, 74. https://doi.org/10.1038/s41426-018-0081-6
  16. Ternovoi V.A., Protopopova E.V., Chausov E.V., Novikov D.V., Leonova G.N., Netesov S.V., Loktev V.B. (2007) Novel variant of tickborne encephalitis virus, Russia. Emer. Infect. Dis. 13, 1574‒1578. https://doi.org/10.3201/eid1310.070158
  17. Чаусов Е.В., Терновой В.А., Протопопова Е.В., Коновалова С.Н., Кононова Ю.В., Тупота Н.Л., Москвитина Н.С., Романенко В.Н., Иванова Н.В., Большакова Н.П., Леонова Г.Н., Локтев В.Б. (2011) Молекулярно-генетический анализ полного генома вируса клещевого энцефалита сибирского субтипа на примере современного изолята Коларово-2008. Проблемы особо опасных инфекций. 4(110), 44‒48. https://doi.org/10.21055/0370-1069-2011-4(110)-44-48
  18. Mikryukova T.P., Moskvitina N.S., Kononova Y.V., Korobitsyn I.G., Kartashov M.Y., Tyutenkov O.Y., Protopopova E.V., Romanenko V.N., Chausov E.V., Gashkov S.I., Konovalova S.N., Moskvitin S.S., Tupota N.L., Sementsova A.O., Ternovoi V.A., Loktev V.B. (2014) Surveillance of tick-borne encephalitis virus in wild birds and ticks in Tomsk city and its suburbs (Western Siberia). Ticks Tick Borne Dis. 5(2), 145‒151. https://doi.org/10.1016/j.ttbdis.2013.10.004
  19. Микрюкова Т.П., Чаусов Е.В., Коновалова С.Н., Кононова Ю.В., Протопопова Е.В., Карташов М.Ю., Терновой В.А., Глушкова Л.И., Корабельников И.В., Егорова Ю.И., Локтев В.Б. (2014) Генетическое разнообразие вируса клещевого энцефалита в клещах Ixodes persulcatus в северо-восточном регионе европейской части России. Паразитология. 48(2), 131‒149.
  20. Korobitsyn I.G., Moskvitina N.S., Tyutenkov O.Y., Gashkov S.I., Kononova Y.V., Moskvitin S.S., Romanenko V.N., Mikryukova T.P., Protopopova E.V., Kartashov M.Y., Chausov E.V., Konovalova S.N., Tupota N.L., Sementsova A.O., Ternovoi V.A., Loktev V.B. (2021) Detection of tick-borne pathogens in wild birds and their ticks in Western Siberia and high level of their mismatch. Folia Parasitol. (Praha). 68, 2021‒2024. https://doi.org/10.14411/fp.2021.024
  21. Ponomareva E.P., Ternovoi V.A., Mikryukova T.P., Protopopova E.V., Gladysheva A.V., Shvalov A.N., Konovalova S.N., Chausov E.V., Loktev V.B. (2017) Adaptation of tick-borne encephalitis virus from human brain to different cell cultures induces multiple genomic substitutions. Arch. Virol. 162, 3151‒3156. https://doi.org/10.1007/s00705-017-3442-x
  22. National Research Council. (1996) Guide for the Care and Use of Laboratory Animals. Washington, DC: National Academies Press. https://doi.org/10.17226/5140
  23. Сюрин В.Н. (1970) Практическая вирусология. Москва: Колос, 352 с.
  24. Kuno G., Gubler D.J., Santiago de Weil N.S. (1985) Antigen capture ELISA for the identification of dengue viruses. J. Virol. Methods. 12(1‒2), 93‒103. https://doi.org/10.1016/0166-0934(85)90011-4
  25. Ternovoi V.A., Kurzhukov G.P., Sokolov Y.V., Ivanov G.Y., Ivanisenko V.A., Loktev A.V., Ryder R.W., Netesov S.V., Loktev V.B. (2003) Tick-borne encephalitis with hemorrhagic syndrome, Novosibirsk region, Russia, 1999. Emer. Infect. Dis. 9, 743‒746. https://doi.org/10.3201/eid0906.030007
  26. Ternovoi V.A., Gladysheva A.V., Ponomareva E.P., Mikryukova T.P., Protopopova E.V., Shvalov A.N., Konovalova S.N., Chausov E.V., Loktev V.B. (2019) Variability in the 3′ untranslated regions of the genomes of the different tick-borne encephalitis virus subtypes. Virus Genes. 55, 448‒457. https://doi.org/10.1007/s11262-019-01672-0
  27. Davies T.J., Pedersen A.B. (2008) Phylogeny and geography predict pathogen community similarity in wild primates and humans. Proc. Biol. Sci. 275, 1695‒1701. https://doi.org/10.1098/rspb.2008.0284
  28. Woolhouse M.E.J., Haydon D.T., Antia R. (2005) Emerging pathogens: the epidemiology and evolution of species jumps. Trends Ecol. Evol. 20, 238‒244. https://doi.org/10.1016/j.tree.2005.02.009
  29. Loverdo C., Lloyd-Smith J.O. (2013) Evolutionary invasion and escape in the presence of deleterious mutations. PloS One. 8, e61879. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0068179
  30. Sanjuan R., Nebot M.R., Chirico N., Mansky L.M., Belshaw R. (2010) Viral mutation rates. J. Virol. 84, 9733‒9748. https://doi.org/10.1128/JVI.00694-10
  31. Lalic J., Cuevas J.M., Elena S.F. (2011) Effect of host species on the distribution of mutational fitness effects for an RNA virus. PLoS Genet. 7, e1002378. https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1002378
  32. Kozlovskaya L.I., Osolodkin D.I., Shevtsova A.S., Romanova L.Iu., Rogova Y.V., Dzhivanian T.I., Lyapustin V.N., Pivanova G.P., Gmyl A.P., Palyulin V.A., Karganova G.G. (2010) GAG-binding variants of tick-borne encephalitis virus. Virology. 398, 262–272. https://doi.org/10.1016/j.virol.2009.12.012
  33. Kopecky J., Grubhoffer L., Kovar V., Jindrak L., Vokurkova D. (1999) A putative host cell receptor for tick-borne encephalitis virus identified by anti-idiotypic antibodies and virus affinoblotting. Intervirology. 42, 9–16. https://doi.org/10.1159/000024954
  34. Navarro-Sanchez E., Altmeyer R., Amara A., Schwartz O., Fieschi F., Virelizier J.L., Arenzana-Seisdedos F., Despres P. (2003) Dendritic-cell-specific ICAM3-grabbing non-integrin is essential for the productive infection of human dendritic cells by mosquito-cell-derived dengue viruses. EMBO Rep. 4, 723–728. https://doi.org/10.1038/sj.embor.embor866
  35. Mandl C.W. (2005) Steps of the tick-borne encephalitis virus replication cycle that affect neuropathogenesis. Virus Res. 111, 161–174. https://doi.org/10.1016/j.virusres.2005.04.007
  36. Goto A., Hayasaka D., Yoshii K., Mizutani T., Kariwa H., Takashima I. (2003) A BHK-21 cell culture-adapted tick-borne encephalitis virus mutant is attenuated for neuroinvasiveness. Vaccine. 21, 4043–4051. https://doi.org/10.1016/s0264-410x(03)00269-x
  37. Mandl C.W., Kroschewski H., Allison S.L., Kofler R., Holzmann H., Meixner T., Heinz F.X. (2001) Adaptation of tick-borne encephalitis virus to BHK-21 cells results in the formation of multiple heparan sulfate binding sites in the envelope protein and attenuation in vivo. J. Virol. 75, 5627–5637. https://doi.org/10.1128/JVI.75.12.5627-5637.2001
  38. Rumyantsev A.A., Murphy B.R., Pletnev A.G. (2006) A tick-borne Langat virus mutant that is temperature sensitive and host range restricted in neuroblastoma cells and lacks neuroinvasiveness for immunodeficient mice. J. Virol. 80, 1427–1439. https://doi.org/10.1128/JVI.80.3.1427-1439.2006
  39. Sakai M., Yoshii K., Sunden Y., Yokozawa K., Hirano M., Kariwa Y. (2014) Variable region of the 3’UTR is a critical virulence factor in the Far-Eastern subtype of tick-borne encephalitis virus in a mouse model. J. Gen. Virol. 95, 823–835. https://doi.org/10.1099/vir.0.060046-0
  40. Roby J.A., Pijlman G.P., Wilusz J., Khromykh A.A. (2014) Noncoding subgenomic flavivirus RNA: multiple functions in West Nile virus pathogenesis and modulation of host responses. Viruses. 6, 404‒427. https://doi.org/10.3390/v6020404
  41. Bidet K., Garcia-Blanco M.A. (2014) Flaviviral RNAs: weapons and targets in the war between virus and host. Biochem. J. 462, 215–230. https://doi.org/10.1042/BJ20140456
  42. Hussain M., Asgari S. (2014) MicroRNA-like viral small RNA from Dengue virus 2 autoregulates its replication in mosquito cells. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 111, 2746–2751. https://doi.org/10.1073/pnas.1320123111
  43. Hussain M., Torres S., Schnettler E., Funk A., Grundhoff A., Pijlman G.P., Khromykh A.A., Asgari S. (2012) West Nile virus encodes a microRNA-like small RNA in the 3’untranslated region which up-regulates GATA4 mRNA and facilitates virus replication in mosquito cells. Nucleic Acids Res. 40, 2210–2223. https://doi.org/10.1093/nar/gkr848
  44. Pijlman G.P., Funk A., Kondratieva N., Leung J., Torres S., van der Aa L., Liu W.J., Palmenberg A.C., Shi P.-Y., Hall R.A., Khromykh A.A. (2008) A highly structured, nuclease-resistant, noncoding RNA produced by flaviviruses is required for pathogenicity. Cell Host Microbe. 4, 579–591. https://doi.org/10.1016/ j.chom.2008.10.007
  45. Chapman E.G., Costantino D.A., Rabe J.L., Moon S.L., Wilusz J., Nix J.C., Kieft J.S. (2014) The structural basis of pathogenic subgenomic flavivirus RNA (sfRNA) production. Science. 344, 307–310. https://doi.org/10.1126/science.1250897
  46. Chapman E.G., Moon S.L., Wilusz J., Kieft J.S. (2014) RNA structures that resist degradation by Xrn1 produce a pathogenic Dengue virus RNA. Elife. 3, e01892. https://doi.org/10.7554/eLife.01892
  47. Funk A., Truong K., Nagasaki T., Torres S., Floden N., Balmori Melian E., Edmonds J., Dong H., Shi P.Y., Khromykh A.A. (2010) RNA structures required for production of subgenomic flavivirus RNA. J. Virol. 84, 11407–11417. https://doi.org/10.1128/JVI.01159-10
  48. Chang R.Y., Hsu T.W., Chen Y.L., Liu S.F., Tsai Y.J., Lin Y.T., Chen Y.S., Fan Y.H. (2013) Japanese encephalitis virus non-coding RNA inhibits activation of interferon by blocking nuclear translocation of interferon regulatory factor 3. Vet. Microbiol. 166, 11–21. https://doi.org/10.1016/j.vetmic.2013.04.026
  49. Schuessler A., Funk A., Lazear H.M., Cooper D.A., Torres S., Daffis S., Jha B.K., Kumagai Y., Takeuchi O., Hertzog P., Silverman R., Akira S., Barton D.J., Diamond M.S., Khromykh A.A. (2012) West Nile virus noncoding subgenomic RNA contributes to viral evasion of the type I interferon-mediated antiviral response. J. Virol. 86, 5708–5718. https://doi.org/10.1128/JVI.00207-12
  50. Moon S.L., Anderson J.R., Kumagai Y., Wilusz C.J., Akira S., Khromykh A.A., Wilusz J. (2012) A noncoding RNA produced by arthropod-borne flaviviruses inhibits the cellular exoribonuclease XRN1 and alters host mRNA stability. RNA. 18, 2029–2040. https://doi.org/10.1261/rna.034330.112
  51. Fan Y.H., Nadar M., Chen C.C., Weng C.C., Lin Y.T., Chang R.Y. (2011) Small non-coding RNA modulates Japanese encephalitis virus replication and translation in trans. Virol. J. 8, 492. https://doi.org/10.1186/1743-422X-8-492
  52. Kieft J.S., Rabe J.L., Chapman E.G. (2015) New hypotheses derived from the structure of a flaviviral Xrn1-resistant RNA: conservation, folding, and host adaptation. RNA Biol. 12, 1169‒1177. https://doi.org/10.1080/15476286.2015.1094599

补充文件

附件文件
动作
1. JATS XML
下载
2. Table 2. Nucleotide and amino acid substitutions in the genome of strain C11-13 adapted to SPEV cells, identified after additional passages through the brain of outbred white mice

下载 (151KB)
索引源数据
3. Fig. 1. Scheme of the organization of 3′-UTR of TBEV. The following genotypes of TBEV (1, 2), Siberian genotypes (3–6), and Far Eastern genotypes (7, 8, 15, 16) were taken as prototypes for comparison. Numbers 11 and 12 indicate variants of the TBEV strain C11-13 obtained in normal human embryonic kidney cells (HEK293) and mouse neurons (Neuro-2a), respectively (GenBank Acc. No. MF043954, MF043955, respectively). The dotted line indicates deletions in the 3′-UTR; L and R are imperfect repeats of the TBEV genomic RNA (length 60 nt, identity 57% relative to the strain Glubinnoe/2004 (DQ862460)); SL1‒SL15 – stem-loop structures in UTR; LRS1‒LRS6 – long repeat sequences; rLRS – region of long repeat sequences; Y1‒Y3 – Y-shaped structures of UTR; 3′LSH – 3′-terminal long stable hairpin. The color scheme is generally accepted in the MEGA 7/10 program (PSU, USA) for the nucleotides adenine (A), thymine (T), cytosine (C) and guanine (G): green, red, blue and purple, respectively.

下载 (1MB)
索引源数据
4. Fig. 2. Mapping of imperfect repeats in the variable region of the 3′-UTR of TBEV genomic RNA (prototype strain Glubinnoe/2004 (GenBank Acc. No. DQ862460)). Performed using the Unipro UGENE:v45.1 program with a length of 60 nucleotides for the compared sequences.

下载 (127KB)
索引源数据
5. Fig. 3. Imperfect repeats identified for flavi- and alphaviruses in the variable region of the 3′-UTR of genomic RNA. X and Y are the coordinates of the nucleotide sequence shown on the diagonal of the matrix in the Unipro UGENE:v45.1 program. The level of homology according to Unipro UGENE:v45.1 data for imperfect repeats was 52–57%.

下载 (846KB)
索引源数据
6. Fig. 4. The mechanism of viral RNA cleavage by XRN1 exoribonuclease with the formation of TBEV sfRNA. In the figure, the imperfect L- and R-repeats are underlined, which have 52–57% homology and form the right part of the Y3 and Y2 loops, respectively. SP, NSP are structural and non-structural proteins of flaviviruses, respectively.

下载 (200KB)
索引源数据

版权所有 © Russian Academy of Sciences, 2024

Согласие на обработку персональных данных с помощью сервиса «Яндекс.Метрика»

1. Я (далее – «Пользователь» или «Субъект персональных данных»), осуществляя использование сайта https://journals.rcsi.science/ (далее – «Сайт»), подтверждая свою полную дееспособность даю согласие на обработку персональных данных с использованием средств автоматизации Оператору - федеральному государственному бюджетному учреждению «Российский центр научной информации» (РЦНИ), далее – «Оператор», расположенному по адресу: 119991, г. Москва, Ленинский просп., д.32А, со следующими условиями.

2. Категории обрабатываемых данных: файлы «cookies» (куки-файлы). Файлы «cookie» – это небольшой текстовый файл, который веб-сервер может хранить в браузере Пользователя. Данные файлы веб-сервер загружает на устройство Пользователя при посещении им Сайта. При каждом следующем посещении Пользователем Сайта «cookie» файлы отправляются на Сайт Оператора. Данные файлы позволяют Сайту распознавать устройство Пользователя. Содержимое такого файла может как относиться, так и не относиться к персональным данным, в зависимости от того, содержит ли такой файл персональные данные или содержит обезличенные технические данные.

3. Цель обработки персональных данных: анализ пользовательской активности с помощью сервиса «Яндекс.Метрика».

4. Категории субъектов персональных данных: все Пользователи Сайта, которые дали согласие на обработку файлов «cookie».

5. Способы обработки: сбор, запись, систематизация, накопление, хранение, уточнение (обновление, изменение), извлечение, использование, передача (доступ, предоставление), блокирование, удаление, уничтожение персональных данных.

6. Срок обработки и хранения: до получения от Субъекта персональных данных требования о прекращении обработки/отзыва согласия.

7. Способ отзыва: заявление об отзыве в письменном виде путём его направления на адрес электронной почты Оператора: info@rcsi.science или путем письменного обращения по юридическому адресу: 119991, г. Москва, Ленинский просп., д.32А

8. Субъект персональных данных вправе запретить своему оборудованию прием этих данных или ограничить прием этих данных. При отказе от получения таких данных или при ограничении приема данных некоторые функции Сайта могут работать некорректно. Субъект персональных данных обязуется сам настроить свое оборудование таким способом, чтобы оно обеспечивало адекватный его желаниям режим работы и уровень защиты данных файлов «cookie», Оператор не предоставляет технологических и правовых консультаций на темы подобного характера.

9. Порядок уничтожения персональных данных при достижении цели их обработки или при наступлении иных законных оснований определяется Оператором в соответствии с законодательством Российской Федерации.

10. Я согласен/согласна квалифицировать в качестве своей простой электронной подписи под настоящим Согласием и под Политикой обработки персональных данных выполнение мною следующего действия на сайте: https://journals.rcsi.science/ нажатие мною на интерфейсе с текстом: «Сайт использует сервис «Яндекс.Метрика» (который использует файлы «cookie») на элемент с текстом «Принять и продолжить».