Increasing the Level of Knock-In of the MT-C34-Encoding Construct into the CXCR4 Locus by Modifying Donor DNA with Cas9 Target Sites

Full Text

Сокращения:

 гРНК – РНК-гид; РНП – рибонуклеопротеин; DSB (double-strand breaks) – двухцепочечные разрывы; CTS (Cas9 targeting sequence) – последовательность-мишень Cas9; HDR (homology-directed repair) – репарация по пути гомологичной рекомбинации; NHEJ (non-homologous end joining) – негомологичное соединение концов; tCTS (truncated Cas9 targeting sequence) – укороченная последовательность-мишень Cas9.

 

Появление технологий редактирования генома с помощью программируемых нуклеаз открыло новые возможности для лечения различных заболеваний человека [1]. Наиболее широко используемая нуклеаза Cas9 с помощью короткой молекулы РНК-гида (гРНК) распознает ДНК-мишень и вносит двухцепочечный разрыв (DSB) в геном [2]. Репарация DSB в клетках происходит преимущественно по механизму негомологичного соединения концов (non-homologous end joining, NHEJ), который вызывает появление небольших делеций или инсерций (инделов), что можно использовать для нокаута гена. Репарация по механизму гомологичной рекомбинации (homology-directed repair, HDR) менее эффективна по сравнению с NHEJ и требует присутствия ДНК-матрицы (донорной ДНК). Доставка в клетки экзогенной донорной ДНК позволяет вносить в геном целевые нуклеотидные последовательности, что называется knock-in (нокин). Для генной терапии ряда заболеваний человека с помощью системы CRISPR/Cas9 можно использовать нокаут генов [3, 4]. Однако наиболее интересна возможность внесения направленных изменений в геном с помощью нокина, например, для исправления точечных мутаций при лечении моногенных заболеваний [5] или для создания CAR-T клеток [4]. К сожалению, эффективность CRISPR/Cas9-опосредованного нокина в большинстве случаев остается низкой, что ограничивает использование этой технологии в клинической практике. В связи с этим разработка новых подходов к повышению эффективности нокина, в первую очередь на клинически релевантных моделях в первичных клетках человека, не теряет своей актуальности.

Описаны различные способы модификации Cas9, гРНК и донорной ДНК, приводящие к повышению уровня нокина [6]. Кроме того, можно воздействовать на клеточный цикл или механизмы репарации ДНК с помощью низкомолекулярных соединений, чтобы сместить равновесие с механизма NHEJ в сторону HDR [7, 8]. Ряд подходов, направленных на модификацию донорной ДНК, включает использование различных типов ДНК-матриц (одноцепочечные олигонуклеотиды, оцДНК, дцДНК и т. д.), варьирование длины и симметрии плеч гомологии, химические модификации одноцепочечных олигонуклеотидов и др. [9]. Например, для конструкции длиной более 100 п. н. уровень нокина коррелирует с длиной плеч гомологии, однако достигает плато после некоторого значения (800‒1500 п. н.) и затем падает из-за возрастающей токсичности ДНК [10]. Показано, что модификации концов линейной молекулы ДНК триэтиленгликолем и/или 2ʹ-О-метил-рибонуклеотидами поддерживают стабильность донора и тем самым способствуют процессу HDR [11].

Для успешного нокина донорная ДНК должна находиться в ядре в момент образования DSB. При невирусном способе доставки донора какие-либо специфические механизмы его транспорта в ядро отсутствуют. В делящихся клетках трансфицированная ДНК оказывается в ядре в результате цикличного разрушения и формирования ядерной мембраны [12]. Для повышения эффективности доставки донора к месту DSB и его пространственного сближения с комплексом Cas9/гРНК предложены различные способы ковалентной сшивки донора с гРНК или Cas9 [13–16]. Однако все эти способы требуют дополнительных этапов подготовки in vitro и чаще всего снижают способность комплекса расщеплять мишень. В результате повышение уровня HDR, описываемое для таких модификаций, на самом деле представляет собой увеличение соотношения HDR/NHEJ, в то время как абсолютный уровень HDR падает [13–16].

Кроме таких технически сложных методов описано два способа модификации донорной ДНК путем введения на 5ʹ- и 3ʹ-концы последовательностей-мишеней для Cas9, которые представляют собой протоспейсер и следующий за ним сайт РАМ (protospacer adjacent motif) [10, 17]. Первый тип модификации донора, включающий полноразмерный протоспейсер длиной 20 нуклеотидов, был назван “double-cut” [10], потому что Cas9 расщепляет такую донорную ДНК в двух местах, фланкирующих плечи гомологии. Показано, что одновременное внесение разрыва в геномную мишень и в донорную ДНК приводит к повышению уровня нокина более чем в 10 раз [10]. Однако механизм такого эффекта детально не исследован.

Авторы второго способа предположили, что, если Cas9 будет связываться с донорной ДНК в цитоплазме, но не будет вносить в нее разрыв, то донор в комплексе с Cas9 может эффективно транспортироваться в ядро за счет белка Cas9, имеющего сигналы ядерной локализации (NLS) [17]. Для этого донорные молекулы модифицировали путем добавления укороченных последовательностей-мишеней Cas9 (truncated Cas9 targeting sequence, tCTS) с протоспейсером длиной 16 нуклеотидов, которые, как показано J. Zhang с соавт. [18], не расщепляются под действием Cas9. Влияние модификации донорной ДНК сайтами tCTS на уровень нокина было изучено в ряде работ [19–22], при этом сообщалось как о повышении нокина в 2‒4 [17, 19] или в 1.5 раза [20, 22], так и об отсутствии влияния [21]. Важно отметить, что в перечисленных работах не проверяли способность Cas9 расщеплять tCTS-сайты in vitro или в клетках. Кроме того, не было исследовано, действительно ли донорная ДНК с такими модификациями в большей степени накапливается в ядре по сравнению с немодифицированной.

В представленной работе на клинически значимой модели нокина конструкции, кодирующей пептидный ингибитор слияния ВИЧ-1 МТ-С34 (далее: нокин MTC34), в локус CXCR4 в Т-клеточной линии CEM/R5 [23] была оценена эффективность двух способов повышения уровня нокина: модификация донорной плазмиды по методу “double-cut” [10] и с помощью введения tCTS-сайтов, которые, предположительно, способствуют переносу донорной плазмиды в ядро за счет белка Cas9 [17].

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Клеточные линии. Клетки линии CEM/R5, полученные на основе Т-клеточной линии CCRF-СЕМ (АТСС) [23], культивировали в среде DMEM/F12 (“ПанЭко”, Россия) с добавлением 10% фетальной сыворотки крупного рогатого скота (“HyClone”, США), 4 мМ L-глутамина и 40 мг/л гентамицина (“ПанЭко”) при 37°C в увлажненной атмосфере 5% CO₂.

  

Таблица 1. Праймеры, использованные в работе

Клонирование полноразмерных сигналов CTS в плазмидный донор
на 5ʹ-конец
5ʹ-Not-X4ex2-Psp	GGCCGAATTCACTTCAGATAACTACACCGAGG
3ʹ-Not-X4ex2-Psp	TCGACCTCGGTGTAGTTATCTGAAGTGAATTC
на 3ʹ-конец
5ʹ-Xba-X4ex2-Nco	CTAGCCTCGGTGTAGTTATCTGAAGTGAATTC
3ʹ-Xba-X4ex2-Nco	CATGGAATTCACTTCAGATAACTACACCGAGG
Клонирование tCTS с 4 некомплементарными основаниями в плазмидный донор
на 5ʹ-конец
5ʹ-tCTS(4MM)-Not-X4ex2-Psp	GGCCGAattcTCAGATAACTACACCGAGG
3ʹ-tCTS(4MM)-Not-X4ex2-Psp	TCGACCTCGGTGTAGTTATCTGAGAATTC
на 3ʹ-конец
5ʹ-tCTS(4MM)-Xba-X4ex2-Nco	CTAGCCTCGGTGTAGTTATCTGAGAATTC
3ʹ-tCTS(4MM)-Xba-X4ex2-Nco	CATGGAattcTCAGATAACTACACCGAGG
Клонирование tCTS с 6 некомплементарными основаниями в плазмидный донор
на 5ʹ-конец
5ʹ-tCTS(6MM)-Not-X4ex2-Psp	GGCCGAattcagAGATAACTACACCGAGG
3ʹ-tCTS(6MM)-Not-X4ex2-Psp	TCGACCTCGGTGTAGTTATCTCTGAATTC
на 3ʹ-конец
5ʹ-tCTS(6MM)-Xba-X4ex2-Nco	CTAGCCTCGGTGTAGTTATCTCTGAATTC
3ʹ-tCTS(6MM)-Xba-X4ex2-Nco	CATGGAattcagAGATAACTACACCGAGG
Клонирование tCTS с 8 некомплементарными основаниями в плазмидный донор
на 5ʹ-конец
5ʹ-tCTS(8MM)-Not-X4ex2-Psp	GGCCGAattcagtcATAACTACACCGAGG
3ʹ-tCTS(8MM)-Not-X4ex2-Psp	TCGACCTCGGTGTAGTTATGACTGAATTC
на 3ʹ-конец
5ʹ-tCTS(8MM)-Xba-X4ex2-Nco	CTAGCCTCGGTGTAGTTATGACTGAATTC
3ʹ-tCTS(8MM)-Xba-X4ex2-Nco	CATGGAattcagtcATAACTACACCGAGG

Примечание. Для каждого праймера, содержащего таргетную последовательность, жирным шрифтом выделен сайт РАМ, протоспейсер подчеркнут, некомплементарные основания в его составе показаны строчными символами.

 

Конструирование плазмид. Донорные плазмиды получали на основе плазмиды pJet-donor_MT-C34, описанной ранее [23]. Для создания донорной плазмиды pJet-donor_MT-C34 с сайтом связывания Cas9 (Cas9 targeting sequence, CTS) на 5ʹ-конце донорной последовательности, несущим 0, 4, 6 или 8 некомплементарных оснований, соответствующие одноцепочечные олигонуклеотиды: 5ʹ-Not-X4ex2-Psp и 3ʹ-Not-X4ex2-Psp – гибридизовали и клонировали в плазмиду pJet-donor_MT-C34 по сайтам NotI-PspXI (все последовательности праймеров приведены в табл. 1, а список использованных и полученных в работе плазмид – в табл. 2).

 

Таблица 2. Плазмидные конструкции, использованные в работе

Название	Описание	Источник/ссылка
pKSgRNA-X4ex2	Вектор для экспрессии гРНК против экзона-2 локуса CXCR4	[23]
pJET1.2		“Thermo Fisher Scientific”
pBluescript KS (+)		“Stratagene”
pJet-donor_MT-C34	Немодифицированный плазмидный донор для нокина конструкции, кодирующей пептид МТ-С34, в экзон-2 локуса CXCR4	[23]
pKS-donor_MT-C34	Немодифицированный плазмидный донор для нокина конструкции, кодирующей пептид МТ-С34, в экзон-2 локуса CXCR4	Не опубликована
pKS-donor_MT-C34-CTS-5ʹ	Плазмидный донор для нокина конструкции, кодирующей пептид МТ-С34, в экзон-2 локуса CXCR4, модифицированный по 5ʹ-концу полноразмерным CTS	Эта работа
pKS-donor_MT-C34-CTS-3ʹ	Плазмидный донор для нокина конструкции, кодирующей пептид МТ-С34, в экзон-2 локуса CXCR4, модифицированный по 3ʹ-концу полноразмерным CTS	Эта работа
pKS-donor_MT-C34-CTS-5ʹ-3ʹ	Плазмидный донор для нокина конструкции, кодирующей пептид МТ-С34, в экзон-2 локуса CXCR4, модифицированный по 5ʹ- и 3ʹ-концам полноразмерным CTS	Эта работа
pKS-donor_MT-C34-tCTS(4MM)-5ʹ	Плазмидный донор для нокина конструкции, кодирующей пептид МТ-С34, в экзон-2 локуса CXCR4, модифицированный по 5ʹ-концу tCTS 4 некомплементарными основаниями	Эта работа
pKS-donor_MT-C34- tCTS(4MM)-3ʹ	Плазмидный донор для нокина конструкции, кодирующей пептид МТ-С34, в экзон-2 локуса CXCR4, модифицированный по 3ʹ-концу tCTS с 4 некомплементарными основаниями	Эта работа
pKS-donor_MT-C34-tCTS(4MM)-5ʹ-3ʹ	Плазмидный донор для нокина конструкции, кодирующей пептид МТ-С34, в экзон-2 локуса CXCR4, модифицированный по 5ʹ- и 3ʹ-концам tCTS с 4 некомплементарными основаниями	Эта работа
pKS-donor_MT-C34-tCTS(6MM)-5ʹ	Плазмидный донор для нокина конструкции, кодирующей пептид МТ-С34, в экзон-2 локуса CXCR4, модифицированный по 5ʹ-концу tCTS с 6 некомплементарными основаниями	Эта работа
pKS-donor_MT-C34-tCTS(6MM)-3ʹ	Плазмидный донор для нокина конструкции, кодирующей пептид МТ-С34, в экзон-2 локуса CXCR4, модифицированный по 3ʹ-концу tCTS с 6 некомплементарными основаниями	Эта работа
pKS-donor_MT-C34-tCTS(6MM)-5ʹ-3ʹ	Плазмидный донор для нокина конструкции, кодирующей пептид МТ-С34, в экзон-2 локуса CXCR4, модифицированный по 5ʹ- и 3ʹ-концам tCTS с 6 некомплементарными основаниями	Эта работа
pKS-donor_MT-C34-tCTS(8MM)-5ʹ	Плазмидный донор для нокина конструкции, кодирующей пептид МТ-С34, в экзон-2 локуса CXCR4, модифицированный по 5ʹ-концу tCTS с 8 некомплементарными основаниями	Эта работа
pKS-donor_MT-C34- tCTS(8MM)-3ʹ	Плазмидный донор для нокина конструкции, кодирующей пептид МТ-С34, в экзон-2 локуса CXCR4, модифицированный по 3ʹ-концу tCTS с 8 некомплементарными основаниями	Эта работа
pKS-donor_MT-C34- tCTS(8MM)-5ʹ-3ʹ	Плазмидный донор для нокина конструкции, кодирующей пептид МТ-С34, в экзон-2 локуса CXCR4, модифицированный по 5ʹ- и 3ʹ-концам tCTS с 8 некомплементарными основаниями	Эта работа

 

Для создания донорной плазмиды pJet-donor_MT-C34 с CTS-сайтом на 3ʹ-конце донорной последовательности, несущим 0, 4, 6 или 8 некомплементарных оснований, соответствующие олигонуклеотиды: 5ʹ-Xba-X4ex2-Nco и 3ʹ-Xba-X4ex2-Nco – гибридизовали и клонировали в плазмиду pJet-donor_MT-C34 по сайтам XbaI-NcoI. Для получения донора с двумя CTS плазмиду pJet-donor_MT-C34-5ʹCTS обрабатывали рестриктазами XmaI-Bsu36I, фрагмент размером 566 п. н. клонировали в плазмиду pJet-donor_MT-C34-3ʹCTS по соответствующим сайтам. Полученные последовательности донорной ДНК в векторе pJet переклонировали в вектор pBluescript KS(+) (“Stratagene”, США) по сайтам PstI/ClaI. Все эксперименты проводили с донорами в векторе pBluescript KS(+).

Нуклеотидные последовательности всех полученных плазмид верифицировали секвенированием по Сэнгеру в компании “Евроген” (Россия). Донорные плазмиды выделяли с помощью набора Plasmid Midi Kit (100) (#12145; “Qiagen”, Германия). Все остальные плазмиды выделяли с использованием набора Plasmid Midiprep 2.0 (#BC124; “Евроген”).

Электропорация. Для нокина MTC34 в локус CXCR4 электропорировали 1 × 10⁶ клеток CEM/R5, используя 3 мкг плазмиды pcDNA3.3-hCas9 (#41815; “Addgene”, США) и 1 мкг плазмиды pKS-gRNA-X4ex2, кодирующей гРНК против экзона-2 гена CXCR4 (спейсер: 5ʹ-CACTTCAGATAACTACACCG-3ʹ, РАМ: AGG), которая описана ранее [23], вместе с 1 пмоль (~2.9 мкг) соответствующего плазмидного донора. Кроме гРНК против CXCR4, использовали гРНК против последовательности, кодирующей белок р24 ВИЧ-1 (спейсер: 5ʹ-GTTAAAAGAGACCATCAATG-3ʹ, PAM: AGG), описанную ранее [23], а также контрольную гРНК с рандомизированной последовательностью, не имеющей комплементарных участков в геноме человека (спейсер: 5ʹ-GCACTACCAGAGCTAACTCA-3ʹ). Для электропорации использовали прибор Neon electroporation system со 100-микролитровыми наконечниками (“Invitrogen”, США) и следующими настройками: 1 230 В, 40 мс, один импульс. На 5 сутки после электропорации клетки окрашивали соответствующими антителами и анализировали методом проточной цитофлуориметрии.

Проточная цитофлуориметрия. Для иммунофлуоресцентного окрашивания клетки CEM/R5 инкубировали в течение 30 мин при 4°C в фосфатно-солевом буфере (PBS) с мышиными моноклональными антителами C24 против пептида MT-C34, описанными ранее [23], или с мышиными моноклональными антителами против CXCR4 (клон 12G5; “Santa Cruz Biotechnology”, США). Затем клетки дважды отмывали в PBS и инкубировали с козьими антителами против IgG мыши, конъюгированными с Alexa488 или Alexa546 (“Thermo Fisher Scientific”, США) в течение 30 мин при 4°C. Далее клетки два раза промывали в PBS и анализировали на проточном цитофлуориметре CytoFLEX S (“Beckman Coulter”, США). В качестве отрицательного контроля использовали клетки, окрашенные только вторичными антителами.

Расщепление плазмидной ДНК под действием рибонуклеопротеина (РНП) in vitro. Для сборки РНП-комплексов использовали белок Cas9, наработанный и очищенный в лаборатории по протоколу, описанному ранее [23]. Cas9 разводили в буфере Orange (BO5; “Thermo Fisher Scientific”) до концентрации 3 мкМ. гРНК получали с помощью набора для in vitro транскрипции HiScribe T7 High Yield RNA synthesis kit (#E2040S; “NEB”, США), как описано в статье А. Масленниковой (Maslennikova) с соавт. [23]. гРНК разводили в воде (“Ambion Thermo Scientific”, США) до концентрации 3 мкМ. На одну реакцию для сборки РНП брали 3 мкл 10× Orange, по 3 мкл (9 пмоль) Cas9 и гРНК и 18 мкл воды, инкубировали смесь 15 мин при комнатной температуре, после чего делали 27-микролитровые аликвоты и в каждую добавляли 3 мкл плазмидной ДНК с концентрацией 100 мкг/мл (0.037 мкМ). Реакционная смесь содержала 9 пмоль РНП и 0.111 пмоль плазмиды, то есть 81-кратный молярный избыток РНП. Реакцию проводили в течение 30 мин при 37°C, затем добавляли 1 мкл протеиназы K (20 мг/мл) и инкубировали 10 мин при 56°C. В образцы добавляли 6× буфер для нанесения образцов и 1/2 образца разделяли в 1%-ном ТАЕ-агарозном геле.

Для эксперимента по титрованию РНП собирали комплексы, как описано выше, получали общую смесь с концентрацией РНП 0.3 мкМ и готовили 5 последовательных двукратных разведений. Реакционная смесь содержала 3 мкл (0.9 пмоль) РНП и 5 мкл (0.185 пмоль) плазмидной ДНК, инкубацию проводили в описанных выше условиях.

Статистический анализ проводили с помощью программы GraphPad Prism 8.0 (США). Для сравнения средних использовали однофакторный ANOVA с последующим тестом Даннета для множественных сравнений с контрольной группой.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Влияние CTS в донорной плазмиде на уровень нокина

В качестве модели использовали нокин конструкции, кодирующей пептидный ингибитор слияния ВИЧ-1 MT-C34, в экзон-2 гена CXCR4 человека, как описано нами ранее [23]. Донорная конструкция несет плечи гомологии для локуса CXCR4, фланкирующие последовательность, кодирующую пептид МТ-С34 (рис. 1а). В результате корректного нокина в начало кодирующей последовательности гена CXCR4 клетки теряют корецептор CXCR4 (нокаут) и начинают экспрессировать пептид МТ-С34 на своей поверхности (нокин).

Для оценки влияния полноразмерных CTS на уровень нокина были получены плазмиды, несущие мишени для Cas9 на 5ʹ- или 3ʹ-конце донорной последовательности или с обеих сторон от нее (рис. 1б). Сайты CTS представляли собой протоспейсер длиной 20 п. н. и РАМ, соответствующие выбранной таргетной последовательности в локусе CXCR4. Для оценки влияния укороченных сайтов, tCTS, на уровень нокина были получены донорные плазмиды, модифицированные tCTS с 4, 6 или 8 некомплементарными основаниями в протоспейсере в дистальной области от РАМ (рис. 1в).

 

Рис. 1. Схема донорной конструкции для нокина MTC34 в экзон-2 локуса CXCR4 (а) и ее модификаций (б, в). Обозначения: 5ʹ-HA – 5ʹ-плечо гомологии; Р2А – сигнал пропуска рибосомы; LS – лидерная последовательность; GPI – последовательность для модификации пептида GPI-якорем; рА – сигнал полиаденилирования; 3ʹ-HA – 3ʹ-плечо гомологии. б – Схематичное изображение плазмид, несущих CTS на 5ʹ- или 3ʹ- конце донорной ДНК (перед 5ʹ-HA или после 3ʹ-НА соответственно); в – последовательности CTS и tCTS. 0MM – в протоспейсере нет некомплементарных оснований; 4MM, 6MM и 8MM – на 5ʹ-конце протоспейсера находятся соответственно 4, 6 или 8 некомплементарных оснований. Сайт РАМ показан жирным шрифтом, протоспейсер подчеркнут, некомплементарные основания в его составе подчеркнуты пунктирной линией. Здесь: CTS – таргетная последовательность Cas9, соответствующая протоспейсеру вместе с РАМ; tCTS – таргетная последовательность Cas9, соответствующая протоспейсеру с некомплементарными основаниями.

 

Полученные донорные плазмиды вместе с плазмидами, кодирующими Cas9 и гРНК, электропорировали в клетки CEM/R5 и на 5 сутки измеряли уровень нокина и нокаута с помощью проточной цитофлуориметрии. Обнаружено, что конструкции с полноразмерными сайтами CTS повышали уровень нокина в 1.5–2 раза по сравнению с немодифицированным донором (контроль) вне зависимости от количества или их положения относительно донорной последовательности, тогда как все сайты tCTS, содержащие некомплементарные основания, не влияли на уровень нокина (рис. 2а). Уровень нокаута для всех донорных конструкций не отличался от такового для немодифицированного донора (рис. 2б). В результате повышалось и соотношение уровней нокина к нокауту: примерно в 2 раза для доноров с сайтами CTS (рис. 2в).

 

Рис. 2. Влияние CTS-модификаций донорной ДНК на уровень нокина МТС34 (а), нокаута CXCR4 (б) и соотношения нокин/нокаут (в) в клетках CEM/R5. Клетки электропорировали плазмидами pcDNA3.3-hCas9, pKS-gRNA-X4ex2 и одним из вариантов донорной плазмиды pKS-don_MT-C34, на 5 сутки оценивали уровень нокаута (KO) CXCR4 и нокина (KI) MTC34 по экспрессии соответствующих белка CXCR4 и пептида MT-C34 на поверхности клеток с помощью проточной цитофлуориметрии. KI/KO – соотношение нокина к нокауту; контроль (‒) – донорная плазмида pKS-don_MT-C34 без модификаций; (0, 4, 6, 8) ММ – число некомплементарных оснований в протоспейсере CTS. Приведены средние значения ± стандартное отклонение (SD) и отдельные результаты трех независимых экспериментов. *p < 0.01, **p < 0.0001.

 

Расщепление CTS-сайтов под действием Cas9 in vitro

С целью оценить способность Cas9 в комплексе с гРНК расщеплять донорные плазмиды с CTS- или tCTS-сайтами in vitro мы использовали плазмиды, в которых эти сайты находились по обеим сторонам донорной последовательности. По нашим расчетам, в этом случае под действием Cas9 из плазмид будет вырезаться фрагмент размером около 1 400 п. н. В результате было обнаружено, что донорная плазмида с 4 некомплементарными основаниями (4ММ) расщеплялась Cas9 так же эффективно, как и плазмида с полноразмерными CTS (рис. 3а). Плазмида с 6MM в протоспейсере также расщеплялась под действием Cas9, однако менее эффективно (рис. 3а, дорожка 3), и лишь в случае 8MM расщепления не происходило (рис. 3а, дорожка 2). Важно отметить, что контрольная плазмида с немодифицированной донорной последовательностью (рис. 3а, дорожка 1) не расщеплялась Cas9, как и все плазмиды в комплексе с контрольной гРНК (scrambled guide RNA, гРНК-Scr), не имеющей мишеней в геноме человека (рис. 3б). При расщеплении ДНК с помощью Cas9 in vitro обычно используют молярный избыток РНП, так как Cas9 – фермент одного цикла [24]. В эксперименте, представленном на рис. 3, использовали 81-кратный молярный избыток РНП. Предположив, что расщепление некомплементарных сайтов связано с избытком РНП, мы провели эксперимент с титрованием количества РНП. Как видно из рис. 3в и 3г, плазмидный субстрат с 4 некомплементарными основаниями (4MM) расщеплялся так же эффективно, как и не имеющий некомплементарных оснований (0MM), даже при молярном соотношении РНП: субстрат, равном 2.43 (рис. 3г).

 

Рис. 3. Расщепление CTS-сайтов под действием Cas9 in vitro. Донорные плазмиды с CTS-сайтами, содержащими 0, 4, 6 или 8 некомплементарных оснований, а также донорную плазмиду без модификаций (‒CTS) инкубировали in vitro с комплексом Cas9 и гРНК против CXCR4 (гРНК-X4) (а) или контрольной (гРНК-Scr) (б) и оценивали уровень расщепления плазмиды с помощью электрофореза в 1%-ном ТАЕ-агарозном геле. Условные обозначения: r (relaxed) – релаксированная форма плазмиды, sc (super-coiled) – суперскрученная форма, d – фрагмент ~1 400 п. н. с донорной последовательностью, фланкированный CTS- или tCTS-сайтами. Донорные плазмиды с CTS-сайтами, содержащими 0 (в) или 4 (г) некомплементарных оснований, инкубировали in vitro с возрастающим количеством РНП и оценивали уровень расщепления плазмиды с помощью электрофореза в 1%-ном ТАЕ-агарозном геле. РНП/плазмида – молярное соотношение РНП к плазмидной ДНК. М – маркеры длины ДНК: 10 000, 8 000, 6 000, 5 000, 4 000, 3 500, 3 000, 2 500, 2 000, 1 500, 1 000, 750 п. н. (#SM1163; “Thermo Fisher Scientific”, США).

 

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

В этой работе мы оценили влияние модификаций плазмидной донорной ДНК путем добавления таргетных сайтов для Cas9 с протоспейсерами без некомплементарных оснований (CTS, 0MM, “double-cut donor”) или с протоспейсерами, имеющими 4, 6 или 8 некомплементарных оснований на 5ʹ-конце (tCTS), на уровень нокина конструкции, кодирующей пептидный ингибитор слияния ВИЧ-1 МТ-С34 (МТС34), в локус CXCR4. В результате обнаружено повышение уровня нокина при фланкировании донорной последовательности сайтами CTS, но не tCTS.

Выявленное нами повышение уровня нокина MTC34 при введении CTS согласуется с результатами J. Zhang и др. [10], впервые систематически сравнивших немодифицированные и “double-cut” доноры. Однако это не совпадает с результатами D. Nguyen и др. [17], которые регистрировали повышение уровня нокина в 2‒4 раза при введении в донорную ДНК tCTS-сайтов с 4 ММ. Авторы предположили, что повышение эффективности нокина за счет CTS-сайтов обусловлено одновременным расщеплением последовательности-мишени Cas9 в геноме и в донорной ДНК [10]. Однако механизм действия “double-cut” доноров на уровень нокина остается неизвестным. D. Nguyen с соавт. [16] объяснили эффект сайтов tCTS с 4ММ тем, что они не подвергаются расщеплению, но вызывают связывание донора с нуклеазой и облегчают его транспорт в ядро за счет NLS в Cas9. Авторы не исследовали расщепление донорной ДНК, несущей такие сайты, ни in vitro, ни in vivo. Мы установили, что доноры, модифицированные tCTS с 4 ММ, расщеплялись под влиянием Cas9 in vitro так же эффективно, как и доноры с полноразмерными CTS, но не вызывали повышения уровня нокина МТС34. Можно предположить, что эффект от введения мишеней Cas9 в донорную ДНК связан или с процессом линеаризации плазмидного донора, или с его взаимодействием с Cas9, или с обоими факторами.

Нами показано, что повышение уровня нокина происходило при введении даже одного CTS-сайта по 5ʹ- или 3ʹ-концу донорной последовательности, тогда как J. Zhang и др. [10] исследовали только парные сайты. Можно допустить, что для повышения уровня нокина достаточно расщепления донорной ДНК в одном месте, с любой стороны от донорной последовательности, а наличие второго сайта расщепления не влияет на конечный результат. Недавно R. Jing и др. [25] показали, что уровень нокина повышался в два раза при введении в плазмидный донор одного сайта CTS и в 10 раз при введении двух сайтов, в то время как третий сайт не приводил к дополнительному увеличению эффективности. Кроме того, при введении полноразмерных CTS повышение эффективности нокина регистрировали даже для линейных доноров. Все вышеперечисленное позволяет сделать вывод о том, что объяснить механизм действия CTS-сайтов исключительно линеаризацией донорной ДНК невозможно, так как необходимо учитывать фактор взаимодействия донорной ДНК с Cas9.

Известно, что нуклеаза Cas9 — фермент одного цикла [24] и после расщепления субстрата in vitro в течение нескольких часов остается связанным с концами ДНК [26], поэтому при проведении in vitro расщепления ДНК по завершении процесса реакционную смесь обрабатывают протеиназой K — для деградации Cas9 и высвобождения продуктов реакции из РНП-комплекса [27, 28]. Учитывая это, можно предположить, что in vivo Cas9 расщепляет таргетный сайт в донорной плазмиде, после чего остается связанной со свободным концом расщепленной ДНК. Если расщепление ДНК произошло в цитоплазме, то за счет NLS в белке Cas9 комплекс РНП и ДНК-матрицы может проникать в ядро. В ядре гРНК направляет Cas9 на целевой локус, что приводит к транспорту связанной ДНК-матрицы к месту репарации DSB. Кроме того, часть ДНК-матрицы может попасть в ядро и другим способом, где подвергнется расщеплению Cas9.

Нами показано, что доноры, модифицированные tCTS с 4 некомплементарными основаниями, in vitro расщеплялись Cas9 так же, как и доноры с полноразмерными сайтами, однако это не влияло на уровень нокина. Если предположить, что для повышения уровня нокина необходимо именно расщепление донора, то введенные по его концам сайты tCTS с некомплементарными основаниями, скорее всего, не расщепляются Cas9 in vivo в клетках. Это предположение требует экспериментальной проверки. К сожалению, надежные способы оценки расщепления донорных плазмид в клетках под действием Cas9 пока не разработаны. Нам не удалось показать расщепление донорной ДНК in vivo с помощью количественной ПЦР (данные не приведены). Мы предполагаем, что при электропорации и транзиторной экспрессии в клетках образуется очень небольшое количество расщепленной донорной плазмиды, в результате уровень исходной плазмиды снижается настолько незначительно, что чувствительности количественной ПЦР для детекции этих изменений не хватает.

Стоит еще раз отметить, что ни в одной из опубликованных ранее работ, в которых использовали CTS или tCTS для модификации донорной ДНК, ее расщепление in vivo не исследовали. Кроме того, наличие или отсутствие эффекта от tCTS можно объяснить различиями в аффинности Cas9 к таким сайтам, которая варьирует в зависимости от нуклеотидной последовательности. В результате нуклеаза Cas9 может образовывать короткоживущий комплекс с tCTS донора, что не позволит ей эффективно переносить донорную ДНК в ядро. Эта гипотеза также требует экспериментальной проверки.

Отсутствие эффекта от tCTS в использованной нами модели можно связать с особенностью выбранного локуса – CXCR4. Так, В. Shy и др. [19] продемонстрировали, что влияние модификации донорной ДНК tCTS-сайтами на уровень нокина сильно варьировало для разных локусов: от отсутствия эффекта до повышения в 10 раз. Среди локусов с минимальным влиянием tCTS-сайтов на нокин был и CXCR4, хотя последовательность протоспейсера для этого локуса в работе не указана. Можно предположить, что в каждом индивидуальном случае, в зависимости от последовательности протоспейсера и некомплементарных оснований, in vivo расщепление донорной ДНК под действием Cas9 происходит либо эффективно, и в этом случае регистрируют повышение уровня нокина, либо неэффективно – тогда повышения нокина не детектируют.

Необходимо отметить, что в большинстве опубликованных работ, в которых изучали расщепление мишеней под действием Cas9 при формировании укороченного гетеродуплекса, использовали укороченные гРНК [18, 29]. В работе D. Nguyen и др. [17] для формирования связи между донором и Cas9 использовали укороченные протоспейсеры. Однако данных о расщеплении ДНК-мишени при использовании укороченных протоспейсеров, а не укороченных гРНК, мы не нашли. В этом случае гетеродуплекс, формирующийся между ДНК-мишенью и гРНК, на самом деле нельзя считать укороченным в полной мере – укорочена лишь область комплементарности в протоспейсере, за которой следуют нуклеотиды, уникальные для каждого таргетного локуса генома и способные вносить различный вклад в стабильность гетеродуплекса. По этой причине мы предполагаем, что для понимания механизма действия tCTS-сайтов необходимо для каждой конкретной таргетной последовательности оценивать ее процессинг под действием Cas9 in vitro и in vivo.

Вероятно, при эффективном расщеплении in vivo таргетных последовательностей Cas9 сайты tCTS повышают уровень нокина, а в случае неэффективного расщепления in vivo эффект от tCTS отсутствует. В таком случае наблюдаемые J. Zhang и др. [10] и D. Nguyen и др. [17] эффекты от соответственно CTS- и tCTS-сайтов имеют одинаковую природу. Подтверждение этого предположения потребует анализа нокина в ряд дополнительных локусов с одновременной оценкой расщепления донорной плазмиды in vivo и in vitro, а также измерения кинетических параметров связывания Cas9 с таргетными последовательностями.

Таким образом, на клинически значимой модели нокина в Т-клетках нам удалось повысить уровень нокина MTC34 в локус CXCR4 путем модификации донорной плазмиды мишенями Cas9, фланкирующими донорные последовательности. Выяснение молекулярных механизмов этого эффекта позволит усовершенствовать технологию нокина за счет модификации донорной ДНК.

 

Работа выполнена при финансовой поддержке Российского научного фонда (грант № 22-25-00310).

Настоящая статья не содержит описания каких-либо исследований с участием людей или животных в качестве объектов.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

About the authors

M. V. Shepelev

Center for Precision Genome Editing and Genetic Technologies for Biomedicine, Institute of Gene Biology, Russian Academy of Sciences

Email: natalya.a.kruglova@yandex.ru
Russian Federation, Moscow, 119334

D. S. Komkov

Center for Precision Genome Editing and Genetic Technologies for Biomedicine, Institute of Gene Biology, Russian Academy of Sciences; Department of Physiology and Cell Biology, Faculty of Health Sciences, Ben-Gurion University of the Negev

Email: natalya.a.kruglova@yandex.ru
Russian Federation, Moscow, 119334; Beer-Sheva, 8410501 Israel

D. S. Golubev

Center for Precision Genome Editing and Genetic Technologies for Biomedicine, Institute of Gene Biology, Russian Academy of Sciences

Email: natalya.a.kruglova@yandex.ru
Russian Federation, Moscow, 119334

S. E. Borovikova

Institute of Gene Biology, Russian Academy of Sciences

Email: natalya.a.kruglova@yandex.ru
Russian Federation, Moscow, 119334

D. V. Mazurov

Center for Precision Genome Editing and Genetic Technologies for Biomedicine, Institute of Gene Biology, Russian Academy of Sciences; Division of Infectious Diseases and International Medicine, Department of Medicine, University of Minnesota

Email: natalya.a.kruglova@yandex.ru
Russian Federation, Moscow, 119334; Minneapolis, 55455 USA

N. A. Kruglova

Center for Precision Genome Editing and Genetic Technologies for Biomedicine, Institute of Gene Biology, Russian Academy of Sciences; Division of Infectious Diseases and International Medicine, Department of Medicine, University of Minnesota

Author for correspondence.
Email: natalya.a.kruglova@yandex.ru
Russian Federation, Moscow, 119334; Minneapolis, 55455 USA

References

Supplementary files