Особенности адаптации к холоду у психротолерантного микромицета Mucor flavus

Полный текст

Земля является холодной планетой, 85% территории которой постоянно или сезонно подвергается действию температур ниже 5°C. К низкотемпературным местообитаниям относят Арктический и Антарктический регионы, горные вершины, морские глубины, холодные почвы, озера, пещеры, холодные пустыни, криопэги (Кочкина и соавт., 2007; Hoshino, Matsumoto, 2012; Кочкина и соавт., 2014; Wang et al., 2015; Marchetta et al., 2023). Около 70% Земли занято океанами, вода которых на глубине имеет температуру от −1 до 4°C, снег покрывает ~ 35% суши, замерзшая земля составляет ~ 24%, морской лед ~ 13% и ледники ~ 10%. Колебания температур в таких местообитаниях создают условия для развития микроорганизмов, включая грибы. Так, в Антарктиде преобладают представители отдела Ascomycota (99.2% микобиоты), в основном дрожжи, тогда как грибы отделов Basidiomycota и Mucoromycota составляют лишь 0.7 и 0.1%, соответственно (Pudasaini et al., 2017). Напротив, в Арктике присутствуют базидиальные микоризные грибы, которые необходимы для выживания растений-хозяев (Smith, Read, 2008). Холодоустойчивые грибы играют важнейшую роль в круговороте веществ и биоценозе холодных местообитаний. Кроме того, они привлекают внимание астробиологов, так как способны развиваться в условиях, аналогичных марсианским, например, в присутствии перхлоратов (Cassaro et al., 2021). Возрастает также интерес к экстремофильным грибам, в том числе и холодоустойчивым, как к источникам биологически активных веществ и ферментов с необычными свойствами (Feller, Gerday, 2003; Ibrar et al., 2020).

До настоящего времени дискуссионным остается вопрос об определениях психрофильности/психротолерантности. Наиболее распространенное определение сформулировано для бактерий: психрофилы – микроорганизмы, способные расти при 0°С, имеющие оптимум роста при температуре ≤ 15°С и не растущие при 20°С (Morita, 1975). Однако некоторые исследователи считают, что для эукариотных организмов такое определение не подходит, поскольку отдельные стадии цикла развития могут протекать при различных оптимальных температурах (Feller, Gerday, 2003; Cavicchioli, 2006; Hoshino, Matsumoto, 2012). Поэтому предложены также новые термины: стенопсихрофил (аналог “психрофила”) ‒ для микроорганизмов с ограниченным диапазоном температур роста и эврипсихрофил (аналог “психротолеранта”) для микроорганизмов, которые предпочитают стабильно холодную среду, но могут также расти в широком диапазоне температур, вплоть до мезофильного. Существует также предложение считать организм психрофилом, если он способен расти при температуре ≤ 5°С, и криофилом, если рост возможен при ≤ 0°С, а весь цикл развития осуществляется в криозоне (Hoshino, Matsumoto, 2012; Coker, 2019).

Развитие психрофилов в холодных условиях стало возможным благодаря их способности противостоять низкой кинетической энергии среды и замерзанию воды, сформировавшейся в процессе молекулярной эволюции и адаптации (Casanueva et al., 2010). В процессе эволюции холодоустойчивых грибов происходила адаптация всех систем и процессов к холоду на молекулярном (особенности генома и экспрессии генов, строение белков, в том числе и ферментов) и физиологическом (образование антифризных белков, белков теплового и холодового шоков, поддержание жидко-кристаллического состояния мембран, накопление в цитозоле осмолитов, антиоксидантная защита) уровнях (Yusof et al., 2021). Известно, что при холодовом шоке наблюдается снижение активности мембранно-связанных ферментов и транспортеров, скорости трансляции и фолдинга, стабилизируются вторичные структуры РНК и ДНК, повышается упорядоченность мембранных липидов, приводящая к снижению текучести мембран (Sahara et al., 2002; Redón et al., 2012). Поэтому для психрофилов важным звеном адаптации является поддержание функций мембран, что важно для работы связанных с мембранами белков и процессов. Текучесть мембраны зависит от свободного движения ацильных групп мембранных фосфолипидов, латеральной диффузии и колебательного движения фосфолипидов, а также взаимодействия между различными доменами в мембране (Hayashi, Maeda, 2006). На текучесть мембран оказывают влияние степень ненасыщенности жирных кислот мембранных липидов (Inouye, Phadtare, 2014), соотношения стерины/фосфолипиды (Gostinčar, Gunde-Cimerman, 2018) и фосфатидилэтаноламины/фосфатидилхолины (Dawaliby et al., 2016), а также малые белки теплового шока (Tiwari et al., 2015).

Большое значение для криоустойчивости дрожжей имеют осмолиты трегалоза и глицерин, синтез которых регулируется HOG-путем (Inouye, Phadtare, 2014). Так, делеция гена HOG1 не влияет на рост дрожжей при 12°C, но снижает криоустойчивость при 4°С, поскольку не происходит индукции экспрессии генов ферментов синтеза трегалозы и глицерина. Трегалоза является многофункциональным соединением с протекторной, антиоксидантной, шаперонной, транспортной, запасной функциями (Elbein et al., 2003; Iturriaga et al., 2009; Tapia, Koshland, 2014; Argüelles et al., 2017; Kahraman et al., 2019; Kosar et al., 2019). Уникальность этого нередуцирующего дисахарида заключается в том, что он способен защищать как макромолекулы, так и мембраны клетки, оказывая стабилизирующее действие благодаря замещению молекул воды в гидратных оболочках головок фосфолипидов и макромолекул путем образования многочисленных водородных связей. Способность трегалозы защищать мембраны предполагает, что мембранная и осмолитная система клетки взаимосвязаны, и необходимо совместное исследование мембранных липидов и осмолитов. Однако все исследования степени ненасыщенности жирных кислот психрофилов до настоящего времени проводили на общих липидах, включающих как мембранные, так и запасные, что не позволяет отнести этот показатель к мембранам. Кроме того, большинство исследований посвящено психрофильным дрожжам, а не мицелиальным грибам. Но даже для дрожжей исследования состава мембранных липидов единичны.

Целью данного исследования является изучение роли мембранных липидов и осмолитов в адаптации холодоустойчивого микромицета Mucor flavus.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Объект исследования. В работе использовали мукоровый гриб Mucor flavus Bainier 1903 ВКМ F-4102D Mucoraceae, Mucorales, Insertae sedis, Mucoromycetes, Mucoromycota, Fungi. Микромицет изолирован из грунта пещеры “Ледяная” (Красноярский край, Березовский район), температура воздуха и грунта в которой составляла 4–6°С (Хижняк, 2009; Илиенц, 2011). При выделении получил наименование Mucor sp., в дальнейшем был идентифицирован в ВКМ как M. flavus на основании культурально-морфологических признаков и молекулярно-генетического анализа. Последовательность LSU rDNA этого штамма была депонирована в Генбанке под номером OR575477.

Гриб выращивали при оптимальной температуре (20°С) в течение 4–5 сут на скошенном сусло-агаре (7°Б), хранили при температуре 4–8°С.

Оптимальную температуру роста определяли, измеряя линейную скорость роста гриба в поверхностной культуре при различных температурах (−2…27°С). Споровую суспензию с концентрацией 10⁷ спор/мл в количестве 5 мкл вносили в центр чашки Петри с сусло-агаром (7°Б). Диаметр колоний измеряли каждые 1–3 сут до момента, когда мицелий достигал краев чашки.

Выращивание гриба в глубинной культуре проводили в колбах емкостью 250 мл с 50 мл среды Гудвина (Garton et al., 1951) на шейкерах New Brunswick Innova 44 и 44R (Eppendorf, США) со скоростью вращения 120 об./мин. В качестве инокулята использовали споровую суспензию, которую вносили до концентрации 10⁵–10⁶ спор/мл среды. Культивирование проводили при оптимальной температуре 20°С в течение 1–4 сут и при температуре 4°С в течение 4–15 сут.

Анализ липидов, углеводов и полиолов. Определение количества липидов, углеводов и полиолов проводили, как описано ранее (Януцевич и соавт., 2023). Вкратце, липиды экстрагировали по методу Николса с изопропанолом, дезактивирующим фосфолипазы, разделяли двумерной (полярные липиды) или одномерной (нейтральные липиды) тонкослойной хроматографией (ТСХ) и количественно определяли с использованием стандартных соединений методом денситометрии (программное обеспечение DENS). Для изучения состава жирных кислот полярные липиды выделяли методом одномерной ТСХ в системе для нейтральных липидов, элюировали смесью хлороформ‒метанол (1:1), затем экстракт упаривали и проводили метанолиз 2.5% H₂SO₄ в метаноле в течение 2 ч при 70°С. Полученные метиловые эфиры жирных кислот анализировали методом ГЖХ.

Растворимые в цитозоле углеводы и полиолы экстрагировали кипящей водой, удаляли белки и заряженные соединения, из лиофильно высушенного образца получали триметилсилильные производные (Brobst, 1972) и анализировали методом ГЖХ с внутренним стандартом.

Статистический анализ. Для каждого варианта эксперименты проводили трижды (n = 3). На графиках каждая точка данных представляет собой среднее значение ± стандартная ошибка среднего (n = 3).

РЕЗУЛЬТАТЫ

В поверхностной культуре гриб рос в широком диапазоне температур от –2 до 25°С. Максимальная скорость роста 15 мм/сут наблюдалась при оптимальной температуре 20°С (рис. 1). При самой низкой использованной температуре (‒2°С) скорость роста гриба снижалась до 2 мм/сут.

 

Рис. 1. Скорость роста M. flavus в зависимости от температуры.

 

В глубинной культуре гриб рос в виде пеллетов белого цвета. При оптимальной для роста температуре гриб накапливал биомассу около 7–8 г/л к 3 сут, а при 4°С такую же к 10 сут.

Исследование состава растворимых углеводов и полиолов (УиП) цитозоля мицелия гриба показало, что при обеих использованных температурах общее количество углеводов у Mucor flavus было невелико и составляло около 3% от сухой биомассы (рис. 2).

 

Рис. 2. Состав углеводов и полиолов цитозоля в динамике роста M. flavus при 20°С (а) и 4°С (б). (а): 1 ‒ 1 сут, 2 ‒ 2 сут, 3 ‒ 3 сут, 4 ‒ 4 сут; (б): 1 ‒ 4 сут, 2 ‒ 7 сут, 3 ‒ 10 сут, 4 ‒ 15 сут; СБ – сухая биомасса.

 

Качественный состав углеводов не различался, основными являлись трегалоза и глюкоза, в следовом количестве присутствовали полиолы: глицерин и маннит. При 20°С в молодой культуре гриба (1 сут) доминирующими углеводами были глюкоза (57% от суммы) и трегалоза (38%) (рис. 2а). Затем в течение суток доля трегалозы повышалась до 70% на фоне снижения доли глюкозы до 27%. Данное соотношение углеводов поддерживалось далее в процессе роста. При 4°С в молодой культуре гриба (4 сут) доминирующими углеводами были глюкоза (53%), трегалоза (24%) и глицерин (21%) (рис. 2б). В динамике роста культуры резко изменялось соотношение УиП: относительное содержание глюкозы снижалось до 27%, глицерина до 3%, в то время как доля трегалозы возрастала до 70%.

Для исследования роли липидов в адаптации гриба к понижению температуры был изучен состав мембранных и запасных липидов, а также состав жирных кислот фракции мембранных липидов в ходе роста глубинной культуры гриба при температурах 20 и 4°С. Количество мембранных липидов гриба варьировало в пределах 10–15% и слабо изменялось как в динамике роста, так и при различных температурах (рис. 3).

 

Рис. 3. Количество мембранных и запасных липидов гриба при 20°С (а) и 4°С (б): 1 ‒ мембранные липиды, 2 ‒ запасные липиды.

 

При оптимальной температуре в составе мембранных липидов доминировали фосфатидные кислоты (ФК) и фосфатидилэтаноламины (ФЭ) (рис. 4).

 

Рис. 4. Состав мембранных липидов в динамике роста M. flavus при 20°С. ФЭ ‒ фосфатидилэтаноламины, ФХ ‒ фосфатидилхолины, КЛ ‒ кардиолипины, ФК ‒ фосфатидные кислоты, ФС ‒ фосфатидилсерины, ФИ ‒ фосфатидилинозиты, ЛФЭ ‒ лизофосфатидилэтаноламины, ЛФХ ‒ лизофосфатидилхолины, СЛ ‒ сфинголипиды. 1 ‒ 1 сут, 2 ‒ 2 сут, 3 ‒ 3 сут, 4 ‒ 4 сут.

 

Фосфатидилхолины (ФХ) и стерины (Ст) присутствовали в минорном количестве, остальные липиды (кардиолипины, фосфатидилсерины, фосфатидилинозиты и лизофосфатидилэтаноламины, лизофосфатидилхолины и сфинголипиды) в виде следов. В динамике роста доля ФК снижалась, а доли ФЭ, ФХ и Ст возрастали. При росте в условиях 4°С состав мембранных липидов такой же, можно отметить только, что доля стеринов была втрое ниже (рис. 5). При пониженной температуре состав мембранных липидов в динамике роста более стабилен, чем при оптимальной.

 

Рис. 5. Состав мембранных липидов в динамике роста M. flavus при 4°C. ФЭ ‒ фосфатидилэтаноламины, ФХ ‒ фосфатидилхолины, КЛ ‒ кардиолипины, ФК ‒ фосфатидные кислоты, ФС ‒ фосфатидилсерины, ФИ ‒ фосфатидилинозиты, ЛФЭ ‒ лизофосфатидилэтаноламины, ЛФХ ‒ лизофосфатидилхолины, СЛ ‒ сфинголипиды. 1 ‒ 4 сут, 2 ‒ 7 сут, 3 ‒ 10 сут, 4 ‒ 15 сут.

 

Исследование жирнокислотного состава фракции полярных липидов показало, что при обеих температурах доминирующими жирными кислотами являлись линолевая (С18:2n6c), пальмитиновая (С16:0), олеиновая (С18:1n9c), и α- и γ-линоленовая кислоты (С18:3n3 и С18:3n6 соответственно) (рис. 6а и 7а).

 

Рис. 6. Жирнокислотный состав мембранных липидов (а) и их степень ненасыщенности (б) в динамике роста M. flavus при 20°С. 1 ‒ 1 сут, 2 ‒ 2 сут, 3 ‒ 3 сут, 4 ‒ 4 сут.

 

Рис. 7. Жирнокислотный состав мембранных липидов (а) и их степень ненасыщенности (б) в динамике роста M. flavus при 4°C. 1 ‒ 4 сут, 2 ‒ 7 сут, 3 ‒ 10 сут, 4 ‒ 15 сут.

 

Тем не менее, была выявлена разница в соотношении жирных кислот. Так, при 20°С доля линолевой кислоты достигала 35%, а олеиновой 20% (рис. 6а), тогда как при 4°С доля линолевой кислоты не превышает 25%, а относительное содержание олеиновой кислоты достигает 33% (рис. 7а). Кроме того, в оптимальных условиях линоленовая кислота представлена 20% от суммы γ-формы и следами α-формы, а при 4°С доля γ-линоленовой кислоты снижалась вдвое, в то время как относительное содержание α-линоленовой кислоты достигало 10%. Однако, несмотря на эти различия в составе жирных кислот, степень ненасыщенности (СН) фракции фосфолипидов, независимо от стадии роста и температуры, слабо изменялась в пределах 1.5–1.6 (рис. 6б и 7б).

Количество запасных липидов с возрастом увеличивалось от 5 до 15%, независимо от температуры выращивания (рис. 3). Основными запасными липидами были триацилглицериды (ТАГ) и диацилглицериды (ДАГ) (рис. 8).

 

Рис. 8. Состав запасных липидов в динамике роста M. flavus при 20°С (а) и при 4°C (б). МАГ ‒ моноацилглицериды, ДАГ ‒ диацилглицериды, ТАГ ‒ триацилглицериды, СЖК ‒ свободные жирные кислоты, Y ‒ неидентифицированные липид. (а): 1 ‒ 1 сут, 2 ‒ 2 сут, 3 ‒ 3 сут, 4 ‒ 4 сут; (б): 1 ‒ 4 сут, 2 ‒ 7 сут, 3 ‒ 10 сут, 4 ‒ 15 сут.

 

При оптимальной температуре доля ТАГ достигала 75%, а ДАГ не превышала 20%, и в динамике роста изменения были незначительны (рис. 8а). При 4°С в молодой культуре в равных долях (около 30%) присутствовали ТАГ, ДАГ и свободные жирные кислоты (СЖК), в процессе роста доля СЖК снижалась до 5%, доля ДАГ не изменилась, а относительное содержание ТАГ возрастало до 55% (рис. 8б).

ОБСУЖДЕНИЕ

По основным определениям (Morita, 1975; Cavicchioli, 2006) исследуемый микромицет M. flavus относится к психротолерантным грибам, так как растет в широком диапазоне температур (−2…25°С), но имеет температурный оптимум роста при 20°С. Особенностью этого гриба является высокая линейная скорость роста, достигающая 15 мм/сут в оптимальных условиях, 4 мм/сут при 0°С, 6 мм/сут при 25°С. Эти показатели интересны с позиций адаптации к холоду, поэтому мы исследовали состав УиП цитозоля, мембранных и запасных липидов, а также состав жирных кислот фракции мембранных липидов в динамике глубинного роста гриба в оптимальных условиях (20°С) и при 4°С, когда скорость роста снижалась вдвое.

Изучение динамики роста биомассы в глубинной культуре показало, что кривые роста сходны и максимальная биомасса 7–8 г/л накапливается к 3 сут в оптимальных условиях и к 10 сут при 4°С. Количество УиП при обеих температурах невелико и варьирует в процессе роста в пределах 1–3% от сухой массы, основные компоненты представлены трегалозой, глюкозой и глицерином, что характерно для мукоровых грибов из-за слабо развитого пентозофосфатного цикла (Jennings, 1985). В молодом мицелии при обеих температурах доминирует глюкоза (около 60% от суммы). В оптимальных условиях количество глицерина незначительно, а при 4°С выше и сравнимо по уровню с трегалозой (0.25 % от сухой массы). В процессе роста количество трегалозы существенно повышается, и она становится доминирующим компонентом (около 1.5% от сухой массы, 70% от суммы УиП). Неожиданным является тот факт, что количество трегалозы в процессе роста при 20 и 4°С было сходным, достоверных различий не обнаружено. По данным литературы, у дрожжей в холодных условиях накапливалось большое количество глицерина, а трегалоза появлялась только в криозоне (0–4°С) (Inouye, Phadtare, 2014). У облигатных психрофильных дрожжей Mrakia psychrophila при 4°C увеличивалась экспрессия генов десатуразы и глицерин-3-фосфат дегидрогеназы (Su et al., 2016). У исследуемого гриба при обеих температурах количество глицерина не превышало 0.25% от сухой массы, и он не становился доминирующим с возрастом. Низкое количество глицерина обнаружено также в глубинном мицелии трех холодоустойчивых антарктических микромицетов Humicola marvinii, Geomyces pannorum и Mortierella elongata (Weinstein et al., 2000). В совокупности, эти данные указывают на особое значение трегалозы у мицелиальных грибов, в отличие от дрожжей.

Фосфолипиды являются основным классом мембранных липидов у исследуемого гриба, тогда как доля стеринов не превышает 15%, а сфинголипиды присутствуют в следовом количестве. Нужно отметить, что количество мембранных липидов было велико при обеих температурах, составляло около 10% от сухой массы и мало изменялось с возрастом. При обеих температурах доминирующим компонентом мембранных липидов были ФК (40–60% от суммы), доля ФЭ составляла около 20–30%, а ФХ не превышала 10%. В процессе роста в оптимальных условиях доля ФК снижалась на фоне повышения долей ФЭ и стеринов, тогда как при пониженной температуре эти изменения выражены намного слабее. Основное различие между вариантами выращивания касается доли стеринов, которая при 20°С втрое выше, чем при 4°С, т.е. соотношение стерины/фосфолипиды при пониженной температуре было значительно ниже. Это согласуется с данными о низкой доле стеринов, полученными для дрожжей (Inouye, Phadtare, 2014), и отсутствии эргостерина у психротолерантного мукорового гриба Mortierella elongata (Weinstein et al., 2000). Самым необычным в составе мембранных липидов исследуемого гриба было преобладание небислойных липидов, ФК (40‒60% от суммы) и ФЭ (20‒30%), при низком относительном содержании характерного для грибов бислойного фосфолипида ФХ (менее 10%). Такие же особенности состава мембранных липидов выявлены нами ранее для других экстремофильных грибов термофилов (Ianutsevich et al., 2016), алкалофилов (Bondarenko et al., 2017; Ianutsevich et al., 2021), ксерофилов (Danilova et al., 2022; Ianutsevich et al., 2023a), ацидофилов (Януцевич et al., 2023; Ianutsevich et al., 2023b). Роль фосфатидных кислот в структуре и функционировании мембран остается неясной. Этот необычный фосфолипид может быть как бислойным (при нейтральном значении рН и в отсутствии дивалентных ионов), так и небислойным (в слабокислых условиях и в присутствии ионов) (Kooijman et al., 2003; McMahon, Gallop, 2005). Кроме того, авторы полагают, что способность ФК к агрегации может приводить к образованию микродоменов, участвующих в формировании изгибов мембран – первому этапу формирования везикул, регулируя, таким образом, везикулярный транспорт из аппарата Гольджи, эндо- и экзоцитоз. Установлено, что изменение соотношения бислойных и небислойных липидов меняет профиль латерального давления в мембране, влияя на структуру и стабильность мембранных белков, их конформацию и/или функции (Renne, Kroon de, 2018). Было выдвинуто предположение о роли небислойных липидов в связывании периферических мембранных белков и влиянии на стабильность трансмембранных белковых комплексов путем изменения профиля латерального давления (Brink-Van Der Laan Van Den et al., 2004). Считают, что увеличение доли небислойных липидов приводит к формированию участков мембран в гексагональной фазе (Lε), при этом некоторые ацильные цепи фосфолипидов становятся направленными “внутрь” клетки, что облегчает связывание с ними G-белков, фосфолипаз и др. (Vigh et al., 2005). В совокупности эти данные позволяют говорить о важной структурной и регуляторной функции ФК, как при адаптации к стрессорным факторам, так и в адаптации экстремофилов. Для таких небислойных липидов, играющих важную роль в динамической организации мембран при стрессе, предложен термин “липидный морфоген” (Frolov et al., 2011).

На примере 8 психрофильных дрожжей было показано, что основным фосфолипидом являлся небислойный ФЭ, отношение которого к ФХ при понижении температуры выращивания возрастало (Řezanka et al., 2016). Кроме того, был показан значительный рост содержания полиненасыщенных жирных кислот при понижении температуры, что приводило к увеличению степени ненасыщенности фосфолипидов.

Степень “бислойности” липидной молекулы и ее форма зависят от состава ацильных цепей. Так, показано, что в отсутствие бислойного ФХ в клетках дрожжей происходило замещение в ФЭ диненасыщенных ЖК на мононенасыщенные, что придавало молекуле ФЭ более “бислойную” структуру (Boumann et al., 2006). Исследование состава жирных кислот фракции фосфолипидов у M. flavus показало, что основными были ненасыщенные олеиновая, линолевая, линоленовая и насыщенная пальмитиновая кислоты. В оптимальных условиях преобладает линолевая кислота (35% от суммы), остальные по 20%, и их состав слабо изменялся в процессе роста. При 4°С доли олеиновой, линолевой и линоленовой кислот сравнимы (по 25%), в процессе роста наблюдается снижение доли пальмитиновой и повышение доли олеиновой кислоты. Интересным фактом является то, что при 20°С линоленовая кислота представлена, в основном γ-формой, а при 4°С равными долями γ- и α-форм, что указывает на важность α-линоленовой кислоты в адаптации к понижению температуры. Следует отметить, что обнаруженные различия в составе жирных кислот при различных температурах в процессе роста не привели к изменению степени ненасыщенности, которая варьирует в узких пределах 1.5–1.6. Ранее постоянство состава жирных кислот и, следовательно, их степени ненасыщенности (около 1.4), было обнаружено у психрофильных дрожжей Glaciozyma antarctica при всех изученных температурах (15, 0 и 12°С), несмотря на то, что во всех вариантах наблюдалась экспрессия генов Δ₉- и Δ₁₂-десатураз жирных кислот (Bharudin et al., 2018). У психротолерантного мукорового гриба Mortierella elongata СН достигала 1.8 и не изменялась при глубинном выращивании в условиях 5 и 15°С (Weinstein et al., 2000). В совокупности, эти данные позволяют предположить, что у холодоустойчивых грибов существуют механизмы поддержания СН фосфолипидов на постоянном высоком уровне. У бактерий при снижении температуры наблюдается повышение степени ненасыщенности жирных кислот, снижение средней длины цепи, образование метиловых производных и увеличение отношения антеизо-/изо-производных жирных кислот (Casanueva et al., 2010). У изучаемого гриба мы не наблюдали образования каких-либо производных жирных кислот и снижения средней длины цепи жирных кислот мембранных липидов. Более того, в процессе роста и при двух использованных температурах мы не обнаружили существенного изменения степени ненасыщенности жирных кислот, что свидетельствует о высокой стабильности липидного бислоя.

Прямая корреляция между степенью ненасыщенности жирных кислот и текучестью мембраны подтверждена в опытах с Rhodosporidium kratochvilovae (Wang et al., 2017). Так, нокаут гена RKD12, кодирующего Δ₁₂/Δ₁₅-десатуразу, приводил к снижению долей линолевой и линоленовой кислот, снижению текучести и скорости роста при пониженной температуре. Делеция генов FAD12 и FAD15 отдельно у психрофильных дрожжей Metschnikowia australis W7-5 позволила выяснить, что снижение доли линолевой кислоты существенно замедляло рост в холодных условиях, чего не наблюдалось при отсутствии линоленовой кислоты (Wei et al., 2023). У исследуемого гриба, напротив, можно отметить значительное повышение доли α-линоленовой кислоты (с 2 до 10%) при 4°С, что указывает на ее значение в адаптации.

СН жирных кислот мембранных липидов у холодоустойчивых грибов может достигать высоких значений. Так, у психрофильных дрожжей Leucosporidium frigidum и L. nivalis, растущих при температуре 1°С, 80% жирных кислот представлены линоленовой (35–50%) и линолевой (25–30%) кислотами, что приводило к очень высокой СН (>2) (Watson et al., 1976). Однако нужно учесть, что состав жирных кислот определяли в общих липидах, включающих как запасные ацилглицериды, так и фосфолипиды, что создает трудности для сравнения. У исследуемого гриба СН оставалась относительно постоянной (1.5–1.6) как в процессе роста, так и при изменении температуры. Этот неожиданный факт позволяет предположить, что выявленная очень высокая скорость роста гриба в широком диапазоне температур может быть связана с доминированием трегалозы и относительно стабильными составом фосфолипидов и степени их ненасыщенности. Основное изменение в составе мембранных липидов при пониженной температуре по сравнению с оптимальной – снижение доли стеринов на фоне повышения доли фосфолипидов. Не исключено, что именно эта стабильность осмолитной и мембранной систем обеспечивает возможность высокой скорости роста в очень широком диапазоне температур.

БЛАГОДАРНОСТИ

Для низкотемпературного глубинного выращивания было использовано оборудование ЦКП “Коллекция UNIQEM” ФИЦ Биотехнологии РАН.

СОБЛЮДЕНИЕ ЭТИЧЕСКИХ СТАНДАРТОВ

Настоящая статья не содержит результатов исследований, в которых в качестве объектов использовались животные или люди.

КОНФЛИКТ ИНТЕРЕСОВ

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Об авторах

О. А. Данилова

Федеральный исследовательский центр “Фундаментальные основы биотехнологии” РАН

Автор, ответственный за переписку.
Email: noitcelfer@mail.ru

Институт микробиологии им. С.Н. Виноградского

Россия, Москва

Е. А. Януцевич

Федеральный исследовательский центр “Фундаментальные основы биотехнологии” РАН

Email: noitcelfer@mail.ru

Институт микробиологии им. С.Н. Виноградского

Россия, Москва

Г. А. Кочкина

Федеральный исследовательский центр “Пущинский научный центр биологических исследований РАН”

Email: noitcelfer@mail.ru

Институт биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина

Россия, Пущино

Н. В. Гроза

МИРЭА Российский технологический университет

Email: noitcelfer@mail.ru
Россия, Москва

В. М. Терешина

Федеральный исследовательский центр “Фундаментальные основы биотехнологии” РАН

Email: noitcelfer@mail.ru

Институт микробиологии им. С.Н. Виноградского

Россия, Москва

Список литературы

Дополнительные файлы