Белок с неизвестной функцией из бактерии variovorax paradoxus способен образовывать основание шиффа с молекулой plp при аминокислотной замене N174K

Полный текст

ВВЕДЕНИЕ

Большинство известных ферментов с уникальной активностью произошло из ранее существовавших ферментов с другой функцией, относящихся к тому же типу пространственной укладки [1]. В качестве примера можно привести пиридоксаль-5´-фосфат (PLP)-зависимые ферменты, представители которых, относящиеся к одному из семи (I–VII) типов пространственной укладки, могут катализировать различные типы реакций, несмотря на структурную гомологию [2, 3].

К суперсемейству PLP-зависимых ферментов IV типа укладки относятся 4-амино-4-дезоксихоризматлиазы (EC 4.1.3.38) и трансаминазы трех канонических семейств, а именно трансаминазы D-аминокислот (EC 2.6.1.21), трансаминазы разветвленных L-аминокислот (EC 2.6.1.42), (R)-амин:пируваттрансаминазы (EC 2.6.1.X) [3–6]. К данному суперсемейству был ранее отнесен белок VAPA, ген которого обнаружен в геноме β-протеобактерии Variovorax paradoxus штамма B4 при биоинформатическом поиске PLP-зависимых трансаминаз [1]. Отличительной особенностью данного белка являлась замена в его аминокислотной последовательности консервативного у PLP-зависимых ферментов каталитического остатка лизина на аспарагин (N174 по нумерации VAPA). Остаток лизина необходим для образования основания Шиффа с PLP и проведения каталитического цикла у большинства известных PLP-зависимых ферментов [1, 7], исключения крайне редки [8]. Проведенный ранее структурный анализ показал, что помимо высокого уровня сходства по первичной последовательности с PLP-зависимыми трансаминазами IV типа VAPA имеет с ними значительное сходство по трехмерной структуре [1]. Более того, согласно структурным данным, VAPA сохранил в кристалле способность связывать PLP без образования основания Шиффа [1]. Тем не менее оставался открытым вопрос о способности белка связывать кофактор при наличии лизина в его консервативном положении в предполагаемом активном центре.

Для решения поставленной задачи в настоящей работе получили структуру мутантного варианта белка (VAPA^N174K), имеющую остаток лизина в позиции, соответствующей каталитическому лизину функциональных PLP-зависимых трансаминаз. Проведенный сравнительный структурный анализ показал, что остаток лизина в варианте VAPA^N174K способен образовывать основание Шиффа с PLP по типу трансаминаз, а также выявил уникальные по отношению к классическим трансаминазам остатки, координирующие кофактор в активном центре белка.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Очистка и выделение белка. Получение кристаллов холофермента.

Очистку и выделение белка VAPA^N174K проводили по протоколу, описанному ранее [1]. Для хранения и кристаллизации в очищенный раствор VAPA^N174K добавляли 1 мМ PLP.

Для поиска начальных условий кристаллизации был проведен скрининг условий с использованием роботизированной системы кристаллизации Rigaku (USA) и коммерческого набора PegIon HT (HamptonResearch, USA). Концентрация белка составила 20 мг/мл, кристаллизационный скрининг проводили методом газовой диффузии (вариант “сидячая капля”). Для улучшения качества и размера полученных кристаллов была проведена оптимизация условий с использованием метода газовой диффузии (вариант “висячая капля”). Кристаллы, пригодные для рентгеноструктурного эксперимента, росли в течение двух недель в следующих условиях: 12% v/v Tacsimate, pH 7.0, 16% Polyethylene glycol 3.350 при температуре 288 К.

Рентгеноструктурное исследование VAPA^N174K проводили при температуре 100 К, кристаллы были предварительно криопротектированы 20%-ным раствором глицерина путем обмакивания в него на 10 с. Сбор дифракционных данных проводили на лабораторном дифрактометре Rigaku D XtaLAB Synergy-S (ИОХ РАН, Москва) с использованием детектора HyPix-6000HE (табл. 1), обработку полученных данных – с использованием программного комплекса CrysAlisPro (v.171.42.102a) и программы Aimless [9].

 

Таблица 1. Кристаллографические данные и параметры съемки кристалла варианта VAPA^N174K

Пр. гр.	I121
a, b, c, Å	94.25, 87.34, 104.65
α, β, γ, град	90.00, 99.45, 90.00
λ, Å	1.54
T, K	100
Диапазон разрешений, Å	21.81–2.20 (2.27–2.20)
Число уникальных рефлексов	42508 (3658)
Полнота набора, %	99.8 (99.6)
Повторяемость	13.3 (13.8)
I/σ (I)	11.7 (1.90)
Rmeas, %	23 (143)
CC1/2, %	100 (85)

Примечание. В скобках приведены значения для данных высокого разрешения.

 

Решение, уточнение и анализ пространственной структуры VAPA^N174K. Решение полученной структуры мутантного варианта VAPA^N174K было проведено методом молекулярного замещения при помощи программы MOLREP [10] из пакета CCP4 [11]. В качестве стартовой модели использовали полученную заранее структуру белка VAPA дикого типа из Variovorax paradoxus (VAPA^wt, PDB ID: 7Z79).

Кристаллографическое уточнение структуры было проведено с использованием программ Refmac5 [12] и Coot [13] из пакета CCP4 (табл. 2).

 

Таблица 2. Данные уточнения структуры варианта VAPA^N174K

Rfact, %	21.2
Rfree, %	27.1
Общий B-фактор, Å2	38.79
Средний B-фактор по белку, Å2	41.85
Средний B-фактор по растворителю, Å2	29.59
Число неводородных атомов
Белок	6773
Лиганды	1
Растворитель	203
Всего	6977
Среднеквадратичные отклонения
RMSD связей	0.014
RMSD углов	2.245
График Рамачандрана
Наиболее благоприятные, %	97.9
Допустимые, %	2.0
Код PDB	9J32

 

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Выделение, кристаллизационный скрининг и оптимизация мутантного варианта VAPA^N174K. Вариант VAPA^N174K из растворимой фракции клеточного лизата был очищен до гомогенности (данные не приведены). Молекулярная масса очищенного фермента, определенная методом гель-фильтрации, составила 197 кДа, что соответствует гомогексамерному состоянию фермента, как это было и для VAPA^wt [1].

Для поиска начальных условий кристаллизации варианта VAPA^N174K провели широкий скрининг условий кристаллизации, по результатам которого были найдены следующие первоначальные условия кристаллизации: 4% v/v Tacsimate, pH 7.0, 12% Polyethylene glycol 3.350.

С целью улучшения качества и размера полученных кристаллов варианта VAPA^N174K провели оптимизацию найденных в ходе скрининга условий, заключающуюся в варьировании параметров кристаллизационной системы (концентрация осадителя и молярность раствора) в области найденных ранее условий. По результатам проведенной оптимизации для варианта VAPA^N174K найдены следующие условия кристаллизации: 12% v/v Tacsimate, pH 7.0, 16% Polyethylene glycol 3.350, кристаллы из которых были использованы в рентгеноструктурном эксперименте (рис. 1).

 

Рис. 1. Структура димера варианта VAPAN174K. N-концевой домен показан зеленым цветом, C-концевой домен – красным, междоменная петля – светло-зеленым, а соседняя субъединица – серым. Молекула PLP, ковалентно связанная с остатком K174, показана желтым цветом для одной из субъединиц. На врезке справа сверху приведена фотография кристалла варианта VAPAN174K, использованного в рентгеноструктурном эксперименте.

 

Анализ пространственной структуры варианта VAPA^N174K. Структура VAPA^N174K получена с разрешением 2.2 Å. В независимой части элементарной ячейки кристалла находились три молекулы белка, две из которых образовывали димер, подобный функциональным димерам трансаминаз. Все три субъединицы были весьма схожи друг с другом (RMSD между ними не превышало 0.1 Å по С_α-атомам). Анализ кристаллических контактов показал, что мутантная форма белка в кристалле является гексамером, представляющим собой тример димеров, также как и VAPA^wt [1]. Субъединица варианта VAPA^N174K включает в себя малый N-концевой (остатки 1–140 и 310–314) и большой С-концевой (остатки 152–309) домены (рис. 1). Междоменная петля (остатки 141–151) в структуре VAPA^N174K частично находится в форме α-спирали (остатки 147–151), как и в случае с VAPA^wt. При этом остатки междоменной петли имеют относительно слабую электронную плотность и высокие тепловые факторы во всех субъединицах, что отражает подвижность этих участков.

Остаток K174 имеет четкую электронную плотность, ε-аминогруппа остатка лизина образует основание Шиффа с молекулой PLP (рис. 2). Положение ключевых мотивов предполагаемого активного центра варианта VAPA^N174K в целом осталось неизменным относительно структуры VAPA^wt (рис. 2), за исключением участков 146–151 междоменной петли, представляющих собой α-спираль (RMSD = 1.55 Å), и остатков петли O-кармана 122–125, которые участвуют в формировании его полости (RMSD = 0.99 Å) (рис. 2). Данные изменения, вероятно, являются следствием образования внутреннего альдимина PLP в структуре VAPA^N174K.

 

Рис. 2. Структурные различия варианта VAPAN174K (цветовая схема аналогична рис. 1) и VAPAwt (полупрозрачный серый, PDB ID: 7Z79) в предполагаемом активном центре. Электронная плотность (карта 2Fo–Fc) для внутреннего альдимина показана сетчатой поверхностью (уровень срезки 1σ), пунктиром обозначены участки, отличающиеся по конформации от таковых у VAPAwt. Дополнительные цветовые коды: синий – петля O-кармана, образованная остатками соседней субъединицы; оранжевый – βX- и βY-тяжи N-концевого домена; черный – β-поворот C-концевого домена; желтый – последовательность CNST, представляющая собой петлю с мотивом GAGE у других трансаминаз [1].

 

Как и в структуре VAPA^wt, фосфатная группа PLP у VAPA^N174K координируется характерными для трансаминаз IV типа укладки взаимодействиями с боковыми группами остатков R73, T234 и T270, а также с атомами азота основной цепи остатков I233 и T220 (рис. 3). В структуре VAPA^wt боковая цепь остатка F230 имеет двойную конформацию, что, предположительно, затрудняет (но не полностью препятствует) связывание PLP [1]. В структуре варианта VAPA^N174K этот остаток стабилизирован в одной конформации, что открывает карман для связывания PLP, пиридиновое кольцо которого расположено на расстоянии 3.7 Å от F230 и стабилизируется боковой группой последнего посредством стекинг-взаимодействий (рис. 3). Отметим, что некоторые взаимодействия кофактора и белка необычны для трансаминаз IV типа. Так, атом N1 пиридинового кольца кофактора у этих ферментов обычно координируется отрицательно заряженным остатком аспартата или глутамата с длинной боковой группой [6], тогда как гидроксильная группа PLP образует водородную связь с остатком тирозина [3, 5]. Позицию аминокислотного остатка, стабилизирующего N1 пиридинового кольца, у VAPA занимает остаток серина, боковая группа которого в данном случае слишком коротка для того, чтобы напрямую стабилизировать кофактор водородной связью, но остаток S207 взаимодействует опосредованно, через молекулу воды (рис. 3). Атом кислорода О3´ PLP в варианте VAPA^N174K образует водородную связь с боковой группой остатка R178. Аналогичный остаток аргинина, координирующий гидроксильную группу PLP, встречается у некоторых 4-амино-4-дезоксихоризматлиаз [14].

 

Рис. 3. Аминокислотные остатки, принимающие участие в связывании PLP в структуре варианта VAPAN174K: а – пространственное расположение остатков, цветовая схема аналогична рис. 2. Молекулы растворителя показаны красными сферами. Для сравнения серым полупрозрачным цветом показано положение молекулы PLP в структуре VAPAwt; б – схема связывания молекулы PLP, сделанная с помощью LigPlot [15]. Водородные связи показаны зеленой пунктирной линией с указанием соответствующих расстояний в ангстремах.

 

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Получен мутантный вариант белка с неизвестной функцией из бактерии Variovorax paradoxus (VAPA^N174K) и установлена его пространственная структура в комплексе с кофактором – молекулой PLP. Показано, что замена N174K приводит к образованию основания Шиффа между остатком K174 и PLP подобно тому, как это наблюдается в трансаминазах.

Работа выполнена при частичной финансовой поддержке Министерства науки и высшего образования Российской Федерации в рамках Соглашения № 075-15-2021-1354 от 07.10.2021 г.

Об авторах

И. О. Илясов

Федеральный исследовательский центр “Фундаментальные основы биотехнологии” РАН

Автор, ответственный за переписку.
Email: kmb@inbi.ras.ru
Россия, Москва

М. Е. Миняев

Институт органической химии РАН

Email: kmb@inbi.ras.ru
Россия, Москва

Т. В. Ракитина

Национальный исследовательский центр “Курчатовский институт”

Email: kmb@inbi.ras.ru
Россия, Москва

А. К. Бакунова

Федеральный исследовательский центр “Фундаментальные основы биотехнологии” РАН

Email: kmb@inbi.ras.ru
Россия, Москва

В. О. Попов

Федеральный исследовательский центр “Фундаментальные основы биотехнологии” РАН

Email: kmb@inbi.ras.ru
Россия, Москва

Е. Ю. Безсуднова

Федеральный исследовательский центр “Фундаментальные основы биотехнологии” РАН

Email: kmb@inbi.ras.ru
Россия, Москва

К. М. Бойко

Федеральный исследовательский центр “Фундаментальные основы биотехнологии” РАН

Email: kmb@inbi.ras.ru
Россия, Москва

Список литературы

Дополнительные файлы