Структура комплекса карбоксипептидазы Т из Thermoactinomyces vulgaris с L - фениллактатом

Полный текст

ВВЕДЕНИЕ

Получение промышленно важных ферментов методом рационального конструирования не обрело широкого развития из-за сложности белков и вызванного этим недостаточного понимания связи структуры и функции ферментов, в первую очередь влияния мутаций на динамику и укладку белков, что проявляется в недостаточном учете роли малых конформационных изменений структуры ферментов при связывании и катализе субстрата [1]. Одной из удобных моделей для изучения роли конформационных сдвигов в катализе и распознавании субстрата являются металлокарбоксипептидазы. Карбоксипептидаза Т из Thermoactinomycs vulgaris (КПТ, КФ 3.4.17.18) является ортологом панкреатической карбоксипептидазы А, относится к монодоменным металлокарбоксипептидазам термофильных микроорганизмов и содержит ион цинка в составе каталитического центра. КПТ имеет ~30% гомологии первичной структуры с такими классическими объектами энзимологии, как панкреатические карбоксипептидазы А и В [2]. Она обладает широкой субстратной специфичностью и отщепляет с С-конца пептидов преимущественно гидрофобные (подобно карбоксипептдазе А (КПА)) аминокислотные остатки (а. о.), но способна с меньшей активностью отщеплять и положительно (подобно карбоксепептидазе В (КПВ)), и отрицательно заряженные а. о. [3]. В распознавании С-концевого а. о. металлокарбоксипептидазами участвует так называемый карман первичной специфичности, или S1ʹ-сайт по номенклатуре Шехтера и Бергера [4]. Согласно этой номенклатуре сайты связывания а.о. Р1ʹ, P2ʹ, P3ʹ, расположенные в порядке удаления от расщепляемой связи в направлении С-конца, обозначаются как S1ʹ, S2ʹ и т. д., а сайты, расположенные от превращаемой связи в направлении N-конца пептидного субстрата, обозначаются S1, S2, S3 и т. д. Основную роль в распознавании пептидного субстрата карбоксипептидазами играют сайты S1 и S1ʹ, расположенные вблизи каталитического центра. Сайт S1ʹ распознает отщепляемый а. о. субстрата, при этом в структуре сайта важнейшую роль играет а. о., расположенный на его дне, который, как правило, комплиментарен отщепляемому. В КПА это I255, в КПВ – D255, в КПО – R255 [5], благодаря чему эти ферменты отщепляют только гидрофобные, положительно и отрицательно заряженные а. о. соответственно. Сайт S1 распознает предшествующий расщепляемой связи Р1-остаток пептидного субстрата. Например, в КПВ в положении Р1 для лучшего катализа должен находиться гидрофобный а. о. При его отсутствии, в частности, в N-ацетил-аргинине отщепление аргинина с С-конца замедляется в тысячи раз по сравнению с фенилаланил-аргинином [6]. Такого рода регуляция активности каталитического центра со стороны S1ʹ- и S1-сайтов сродни аллостерической регуляции и может сопровождаться конформациоными изменениями и в активном центре, и по всей структуре фермента. Некоторые из таких изменений были выявлены ранее для КПТ. Например, разные боковые группы в Р1ʹ-положении ингибиторов – стабильных аналогов переходного состояния – вызывают разные конформационные изменения каталитических E277 и Y255 [7]. А.о. в основном состоянии в комплексах КПТ с бензилянтарной кислотой (PDB ID: 4DUK) [8] и BOC-лейцином (трет-бутил-оксикарбонил-L-лейцин) (PDB ID: 4F8Z) [9], занимающими соответственно P1ʹ- и P1-положения, также вызывают конформационные изменения в КПТ. В связи с этим интерес представляет сравнение конформационных переходов в КПТ, вызванных занятием S1- и S1ʹ-сайтов активного центра КПТ порознь и одновременно. Такую возможность предоставляет комплекс КПТ с L-фениллактатом, в котором с белком связаны одновременно две молекулы ингибитора, имитирующего основное состояние двух молекул продукта, которые занимают одновременно S1- и S1ʹ-сайты.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Экспрессия, выделение и очистка белка. Ген, кодирующий про-КПТ (последовательность гена pro-cpT Thermoactinomyces vulgaris депонирована в банке генов EBI/EMBL), клонировали в вектор pET23a [10]. После трансформации клетки Escherichia coli штамма BL21(DE3) pLysS (Novagen, EMB Bioscience Inc., San Diego, CA, USA) были пересеены в пробирки с 5 мл среды LB с 120 мг/л ампициллина и 34 мг/л хлорамфинекола (антибиотики из ОАО “Синтез”, Россия) и инкубированы в течение 18 ч при 301 К. Затем клетки перенесли в колбы, содержащие эту же среду с добавлением 1 мМ изопропил-β-D-1-тиогалактопиранозида (ИПТГ), и далее инкубировали 6 ч при 310 К. Клетки разрушали ультразвуком. Тельца включения отделяли от лизата клеток центрифугированием (20000 об./мин, 20 мин), промывали 0.05% CHAPS (в/о) (Sigma-Aldrich, США), 2 M NaCl (Химмед, Россия), водой, растворяли в 8 M мочевине (Диаэм, Россия), содержащей 1 мМ дитиотрейтола (Sigma-Aldrich, США) до конечной концентрации белка по Бредфорду 5 г/л. После этого 100 мл полученного белкового раствора добавляли по каплям при интенсивном перемешивании к 1 л 50 мM буфера Трис/HCl (Диаэм, Россия) (pH 8.0), содержащего 30% глицерина (Химмед, Россия) (о/о), 0.5 M NaCl, 10 мМ CaCl₂ (Sigma-Aldrich, США), 1 мМ ZnSO₄ (Sigma-Aldrich, США) 3 мМ цистеина и 10 мМ цистина (Sigma-Aldrich, США). Раствор инкубировали 16 ч при 310 K. После инкубации раствор разбавляли вдвое буфером, содержащим 50 мМ буфера Трис/HCl (pH 8.0), 0.5 M NaCl, 1 мМ ZnSO₄ и 10 мМ CaCl₂, и концентрировали до объема 20 мл ультрафильтрацией на установке Vivaflow 10 (Сарториус, США). Про-КПТ активировали инкубацией с субтилизином 72 (молярное соотношение КПТ/субтилизин 1:200) в течение 4 ч. Реакцию останавливали диизопропилфторфосфатом (Merck, Германия). Раствор белка концентрировали до 0.5 мл на патронах Microcon XM-10 (Millipore, США) и pH доводили до 6.0 с помощью 100 мМ буфера MES/NaOH (Sigma, США) (pH 5.8). Раствор белка очищали на 20 мл колонке CABS Сефарозы [10], уравновешенной 10 мМ буфером MES/NaOH, pH 6.5, содержащим 0.5 M NaCl, 10 мМ CaCl₂ и 0.1 мМ ZnSO₄. КПТ элюировали этим же буфером при рН 8.0 и КПT-содержащие фракции объединяли. Буферный раствор заменяли раствором для кристаллизации (0.01 M буфером MES/NaOH, pH 6.5, содержащим 1 мМ CaCl₂, 0.1 мM ZnSO₄ и 0.25 M NaCl). Окончательно белок был сконцентрирован до 10 г/л ультрафильтрацией на Amicon-Ultra 0.5 3K (Millipore, США) и стерильно профильтрован через 0.2 мкм Ultrafree-CLLG центрифужный фильтр (Merck). L-Фениллактат был получен от фирмы Sigma-Aldrich, США.

Кристаллизацию проводили в 24-луночных планшетах методом диффузии в парах в висячей капле в течение 5 дней при комнатной температуре и составе резервуарного раствора 1.2 М сульфата аммония, 5% 2-метил-2,4-пентадиола (MPD, Terac, Берлин), 0.1 мM ацетата цинка и 1 мМ хлорида кальция в 0.05 М MES/NaOH-буфере при рН 6.5. Осадитель содержал 100 мМ L-фениллактата в резервуарном растворе, концентрация белка составляла 10 мг/мл, соотношение растворов белка и осадителя 1 мкл/1 мкл. Криораствор представлял собой 25%-ный глицерин в осадителе.

Сбор и обработка дифракционных данных. Дифракционные данные от кристалла были собраны методом вращения при расстоянии между кристаллом и детектором 300 мм; углы качания и вращения – 0.1° и 120° соответственно. Сбор данных проводили на синхротроне ESRF (Франция) на линии ID23-1. В качестве детектора использовали Eiger 2 16M CdTe (Dectris). Обработку набора экспериментальных интенсивностей проводили с помощью программы iMosflm [11].

Разрешение и уточнение структуры. Структура комплекса КПТ–фениллактат была определена с разрешением 1.73 Å с помощью метода молекулярного замещения и программы Phaser [12] с атомными координатами КПT (PDB ID: 3QNV) в качестве стартовой модели. Для уточнения структуры использовали программу REFMAC [13]. Ручную коррекцию модели проводили с помощью программы Coot [14]. Карты электронной плотности вычислены с коэффициентами 2|Fo| – |Fc| и |Fo| – |Fc|. Молекулы воды и ионы кальция были определены по карте электронной плотности, а разностный синтез Фурье выявил электронную плотность в активном сайте, который был идентифицирован как лиганд (L-фениллактат). Лиганд уточнен с заселенностью 100%. Координаты структуры депонированы в Банк данных белков (PDB) (PDB ID: 7Q87). Статистические характеристики набора и уточнения приведены в табл. 1.

 

Таблица 1. Статистические характеристики набора и уточнения структуры

Обработка набора
Пр. гр.	P6322
a = b, c, Å α = β, γ, град	157.3, 104.1 90, 120
Разрешение, Å	30.0–1.73 (1.82–1.73)*
Количество независимых рефлексов	11382
Полнота, %	99.98
I/σ(I)	12.2 (2.9)
Rmrgd-F	0.133 (0.43)
Уточнение
PDB ID	7Q87
Разрешение, Å	30.0–1.73
Количество рефлексов	75180
Rwork	0.13
Rfree	0.14
Среднеквадратичные отклонения
По длинам связей, Å	0.019
По углам, град	2.045
Карта Рамачандрана
Наиболее благоприятные области, %	94.1
Допустимые области, %	5.5
Запрещенные области, %	0.4

 

РУЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Сравнение структур комплексов КПТ–L-фениллактат (PDB ID: 7Q87) с комплексами КПТ–BOC–L-лейцин (PDB ID: 4F8Z) [9], КПТ без лиганда (PDB ID: 1OBR) [15], КПТ–сульфамоил-L-фенилаланин (PDB ID: 4IAV) [16], КПТ–бензилянтарная кислота (PDB ID: 4DUK) [9] проводили совмещением структур по атомам следующих а. о., окружающих связанные лиганды: 166, 167, 206, 255, 287 (нумерация по КПТ). Среднеквадратичные отклонения Сα-атомов совмещенных а. о. в парах КПТ–L-фениллактат:КПТ–бензилянтарная кислота, КПТ–L-фениллактат:КПТ–BOC–L-Leu равны соответственно 0.428 и 0.348 Å.

В комплексообразование с одной молекулой КПТ вступают две молекулы L-фениллактата (рис. 1). Одна из них связывается в S1ʹ-сайте, причем бензольное кольцо располагается подобно таковому в молекуле бензилянтарной кислоты в комплексе c КПТ (PDB ID: 4DUK) [17] (рис. 2), а карбоксильная и гидроксильная группы молочной кислоты располагаются подобно этим же группам молочной кислоты в комплексе L-фениллактата с КПА [18], не образуя связи с ионом цинка. При этом бензольное кольцо в КПА располагается в плоскости, перпендикулярной плоскости бензольного кольца в комплексах бензилянтарной кислоты и L-фениллактата с КПТ. Как отмечалось в [8], причина этого в укороченном расстоянии между парами остатков 260–255 и 211–257, которые ограничивают фенильную группу L-фениллактата в КПТ. Размер S1ʹ-сайта в КПТ уменьшен по сравнению с таковым КПА благодаря заменам G253 → D260, A250 → T257 и I252 → T262 (нумерация КПА–КПТ).

 

Рис. 1. Молекулы L-фениллактата (показаны темными стержнями) в активном центре КПТ. Аминокислотные остатки в 5 Å окружении L-фениллактата показаны светлыми проволочными моделями. Атом цинка изображен большой серой сферой, фиксированная вода – малыми сферами.

 

Рис. 2. Окружение молекулы фениллактата (светлые стержни) в S1ʹ-субсайте КПТ, наложенной на молекулу бензилянтарной кислоты (темные стержни). Остатки, окружающие (4 Å) L-фениллактат, обозначены светлыми проволочными моделями, остатки вокруг (4 Å) бензилянтарной кислоты – темными. Вода показана малыми темными сферами.

 

В S1ʹ-субсайте КПТ фенильное кольцо L-фениллактата образует гидрофобные контакты с L211, G215, A251, L254, Y255, полярные контакты с N146, S252 и E277, амфифильные контакты с T257, D260, T262 и T275. Фенильное кольцо бензилянтарной кислоты образует эти же контакты с КПТ, за исключением Е277, L254 и T275 (рис. 2).

Вторая молекула L-фениллактата занимает сайт S1, причем карбоксильная группа L-фениллактата образует ионную связь с ионом цинка (рис. 3). Одна молекула воды располагается рядом с фенильным кольцом L-фениллактата. Заметим, что в случае лигандов-аналогов переходного состояния сульфамоил-L-лейцина и сульфамоил-L-аргинина с ионом цинка образует связь лиганд, занимающий S1ʹ-субсайт [19].

 

Рис. 3. 4 Å окружение молекулы L-фениллактата, наложенной на BOC-лейцин, в S1-субсайте КПТ. BOC-лейцин выделен темным, L-фениллактат – светлым цветом. Окружение фенильного кольца L-фениллактата – Y255, L254, Y206, а 4 Å окружение боковой группы BOC-лейцина – S207, Y206. Молекулы воды показаны малой сферой, ион цинка – большой.

 

Этот же S1-сайт занимает молекула BOC-лейцина в комплексе с КПТ (PDB ID: 4F8Z) [9], причем боковая группа лейцина располагается на месте бензольного кольца L-фениллактата. Окружение бензольного кольца этой молекулы, равное 5 Å, составляют Y206, S207, L254, Y255. В окружение боковой группы BOC-лейцина не входят L254 и Y255 (рис. 3).

При связывании двух молекул L-фениллактата по сравнению с молекулой бензилянтарной кислоты (лиганд S1ʹ-сайта) в активном центре происходят сдвиги боковых групп Y255 OH на 0.68 Å, CD2 L254 на 0.43 Å, OE2 Е277 на 0.48 Å (Cα на 0.11 Å). Кроме того, вне активного центра происходит сдвиг OE2 E59 на 0.64 Å, а также G192, входящего в состав γ-поворота, и S127, входящего в состав поверхностной петли.

Связывание двух молекул L-фениллактата по сравнению с BOC-лейцином (лиганд S1-сайта) вызывает сдвиг (указаны максимальные значения) ОЕ2 карбоксила боковой группы Е277 на 0.28 Å, CD2 L254 на 0.49 Å. Вне активного центра на 0.77 Å смещается OE2 E59 и на меньшее расстояние (0.593 Å) – а. о. Y218, входящий в состав поверхностной петли.

Отметим, что E59 находится в составе сайта связывания иона кальция, удаление которого влияет на селективность КПТ через взаимодействие с A251 [20].

Смещение среднеквадратичного отклонения Сα-атомов по всей длине первичной структуры КПТ в комплексе с L-фениллактатом по сравнению с комплексами КПТ с BOC-лейцином и бензилянтарной кислотой показано на рис. 4. Оно касается остатков G57, Y214, T247 в первом случае и остатков G55, I120, A181, M240 и T275 во втором. Таким образом, занятие одновременно S1- и S1ʹ-сайтов вызывает изменения конформации КПТ, которые не наблюдаются при их поочередном занятии. Участвующие в этих смещениях остатки металлокарбоксипептидазы T часто не совпадают с остатками активного центра и образуют сеть конформационных перестроек, возможно, имеющих значение для активности и селективности КПТ.

 

Рис. 4. Расположение конформационных сдвигов Сα-атомов по первичной структуре КПТ в результате комплексообразования с L-фениллактатом по сравнению с комплексами КПТ с BOC-лейцином (1) и бензилянтарной кислотой (2).

 

Подвижность G192, S127 и Y218 связана, вероятно, с тем, что они находятся на поверхности белка. Изменение в положении E277, L254 при связывании лиганда с КПТ хорошо известно [7]. Изменение в положении E59 может означать, что он является новой структурной детерминантой селективности КПТ [3] (рис. 5).

 

Рис. 5. Расположение конформационных перестроек в КПТ при связывании лигандов S1- и S1ʹ-сайтов. Пронумерованы а. о. с максимальным (>0.2 Å) смещением боковых групп при связывании L-фениллактата по сравнению с бензилянтарной кислотой и BOC-лейцином. Остальные а. о. окрашены по типу вторичной структуры.

 

Работа выполнена в рамках государственного задания НИЦ “Курчатовский институт”.

Об авторах

В. Х. Акпаров

Институт кристаллографии им. А.В. Шубникова Курчатовского комплекса кристаллографии и фотоники НИЦ “Курчатовский институт”

Автор, ответственный за переписку.
Email: valery.akparov@yandex.ru
Россия, Москва

Г. Е. Константинова

Институт кристаллографии им. А.В. Шубникова Курчатовского комплекса кристаллографии и фотоники НИЦ “Курчатовский институт”

Email: valery.akparov@yandex.ru
Россия, Москва

В. И. Тимофеев

Институт кристаллографии им. А.В. Шубникова Курчатовского комплекса кристаллографии и фотоники НИЦ “Курчатовский институт”

Email: valery.akparov@yandex.ru
Россия, Москва

М. Б. Швецов

Московский физико-технический институт

Email: valery.akparov@yandex.ru
Россия, Долгопрудный

И. П. Куранова

Институт кристаллографии им. А.В. Шубникова Курчатовского комплекса кристаллографии и фотоники НИЦ “Курчатовский институт”; Московский физико-технический институт

Email: valery.akparov@yandex.ru
Россия, Москва; Долгопрудный

Список литературы

Дополнительные файлы