Анализ эффективности CRISPR/CAS9-редактирования рибонуклеопротеидными комплексами гена GEX2 в протопластах кукурузы

Обложка

Цитировать

Полный текст

Открытый доступ Открытый доступ
Доступ закрыт Доступ предоставлен
Доступ закрыт Только для подписчиков

Аннотация

Белок GEX2 экспрессируется в мембранах гамет кукурузы и необходим при оплодотворении на этапе контакта (адгезии) мембран гамет. Нокаутирование этого гена, предположительно, может привести к нарушению оплодотворения и, как следствие, образованию матроклинных гаплоидных зародышей кукурузы. Целью исследования является анализ эффективности редактирования гена GEX2 после ПЭГ-опосредованной трансфекции протопластов кукурузы рибонуклеопротеидными (РНП) комплексами с разными гидРНК. Впервые созданы конструкции для CRISPR/Cas9-редактирования гена GEX2 кукурузы, эффективность которых доказана на протопластах и достигает 10,7%, в зависимости от подобранной гидРНК, соотношения и количества компонентов в РНП-комплексах.

Полный текст

Доступ закрыт

Об авторах

Е. М. Моисеева

Институт биохимии и физиологии растений и микроорганизмов, Федеральный исследовательский центр “Саратовский научный центр Российской академии наук"

Email: chumakov_m@ibppm.ru
Россия, Саратов, 410049

В. В. Фадеев

Институт биохимии и физиологии растений и микроорганизмов, Федеральный исследовательский центр “Саратовский научный центр Российской академии наук"; Саратовский национальный исследовательский государственный университет им. Н.Г. Чернышевского

Email: chumakov_m@ibppm.ru
Россия, Саратов, 410049; Саратов, 410012

Ю. В. Фадеева

Институт биохимии и физиологии растений и микроорганизмов, Федеральный исследовательский центр “Саратовский научный центр Российской академии наук"; Саратовский национальный исследовательский государственный университет им. Н.Г. Чернышевского

Email: chumakov_m@ibppm.ru
Россия, Саратов, 410049; Саратов, 410012

Ю. С. Гусев

Институт биохимии и физиологии растений и микроорганизмов, Федеральный исследовательский центр “Саратовский научный центр Российской академии наук"; Саратовский национальный исследовательский государственный университет им. Н.Г. Чернышевского

Email: chumakov_m@ibppm.ru
Россия, Саратов, 410049; Саратов, 410012

М. И. Чумаков

Институт биохимии и физиологии растений и микроорганизмов, Федеральный исследовательский центр “Саратовский научный центр Российской академии наук"

Автор, ответственный за переписку.
Email: chumakov_m@ibppm.ru
Россия, Саратов, 410049

Список литературы

  1. Чумаков М.И., Гусев Ю.С., Богатырева Н.В., Соколов А.Ю. Оценка рисков распространения генетически модифицированной кукурузы с пыльцой при выращивании с нетрансформированными сортами (обзор) // С-хоз. биология. 2019. Т. 54. № 3. С. 426−445. https://doi.org/10.15389/agrobiology.2019.3.426rus
  2. Chase S.S. Monoploid frequencies in a commercial double cross hybrid maize, and its component single cross hybrids and inbred lines // Genetics. 1949. V. 34. № 4. P. 384–392. https://doi.org/10.1134/S1022795422040044
  3. Coe E.H. A line of maize with high haploid frequency // Am. Naturalist. 1959. V. 93. № 873. P. 381–382. https://doi.org/10.1086/282098
  4. Чумаков М.И., Мазилов С.И. Генетический контроль гиногенеза у кукурузы (обзор) // Генетика. 2022. Т. 58. № 4. С. 388–397. https://doi.org/10.1134/S1022795422040044 .
  5. Kelliher T., Starr D., Wang W. et al. Maternal haploids are preferentially induced by CENH3-tailswap transgenic complementation in maize // Front. Plant Sci. 2016. V. 7. P. 414. https://doi.org/10.3389/fpls.2016.00414
  6. Kelliher T., Starr D., Richbourg L. et al. MATRILINEAL, a sperm-specific phospholipase, triggers maize haploid induction // Nature. 2017. V. 542. P. 105−109. https://doi.org/10.1038/nature20827
  7. Gilles L.M., Khaled A., Laffaire J.B. et al. Loss of pollen-specific phospholipase NOT LIKE DAD triggers gynogenesis in maize // EMBO J. 2017. https://doi.org/10.15252/embj.201796603
  8. Liu C., Li X., Meng D. et al. A 4-bp insertion at ZmPLA1 encoding a putative phospholipase a gene rates haploid induction in maize // Mol. Plant. 2017. V. 10. P. 520−522. https://doi.org/10.1016/j.molp.2017.01.011
  9. Чумаков М.И. Матроклинная гаплоидия и взаимодействие гамет у кукурузы (обзор) // Генетика. 2018. Т. 54 № 10. C. 1120–1124. https://doi.org/10.1134/S1022795418100058
  10. Mori H. Kuroiwa T., Kranz E., Scholten S. GENERATIVE CELL SPECIFIC 1 is essential for angiosperm fertilization // Nat. Cell Biol. 2006. V. 8. P. 64−71. https://doi.org/10.1038/ncb1345
  11. Besser V.K., Frank A.C., Johnson M.A., Preuss D. Arabidopsis HAP2(GCS1) is a sperm-specific gene required for pollen tube guidance and fertilization // Development. 2006. V. 133. P. 4761−4769. https://doi.org/10.1242/dev.02683
  12. Mori T., Igawa T., Tamiya G. et al. Gamete attachment requires GEX2 for successful fertilization in Arabidopsis // Curr. Biol. 2014. V. 24. P. 170−175. https://doi.org/10.1016/j.cub.2013.11.030
  13. Takahashi T., Mori T., Ueda K. et al. The male gamete membrane protein DMP9/DAU2 is required for double fertilization in flowering plants // Development. 2018. V. 45. dev170076. doi: 10.1242/dev.170076
  14. Zhong Y., Liu C., Qi X. et al. Mutation of ZmDMP enhances haploid induction in maize // Nat. Plants. 2019. V. 5. P. 575–580. https://doi.org/10.1038/s41477-019-0443-7
  15. Paszkowski J., Baur M., Bogucki A., Potrykus I. Gene targeting in plants // The EMBO J. 1988. V. 7. № 13. P. 4021−4026. https://doi.org/10.1002/j.1460-2075.1988.tb03295.x
  16. Banakar R., Eggenberger A.L., Lee K. et al. High-frequency random DNA insertions upon co-delivery of CRISPR-Cas9 ribonucleoprotein and selectable marker plasmid in rice // Sci. Rep. 2019. V. 9. № 1. P. 19902. https://doi.org/10.1038/s41598-019-55681-y
  17. Sandhya D., Jogam P., Allini V.R. et al. The present and potential future methods for delivering CRISPR/Cas9 components in plant // J. Genet. Eng. Biotechnol. 2020. V. 18. P. 25. https://doi.org/10.1186/s43141-020-00036-8
  18. Богатырева Н.В., Соколов А.Ю., Моисеева Е.М. и др. Правовое положение растений, полученных с использованием технологии редактирования генома: перспективы для России // Экологическая генетика. 2021. Т. 19. № 1. С. 89−101. https://doi.org/10.17816/ecogen42532
  19. Cho S.W., Lee J., Carroll D. et al. Heritable gene knockout in Caenorhabditis elegans by direct injection of Cas9–sgRNA ribonucleoproteins // Genetics. 2013. V. 195. P. 1177−1180. https://doi.org/10.1534/genetics.113.155853
  20. Woo J.W., Kim J., Kwon S. et al. DNA-free genome editing in plants with preassembled CRISPR-Cas9 ribonucleoproteins // Nat. Biotechnology. 2015. V. 33. № 11. P. 1162−1164. https://doi.org/10.1038/nbt.3389
  21. Liang Z., Chen K., Li T. et al. Efficient DNA‐free genome editing of bread wheat using CRISPR/Cas9 ribonucleoprotein complexes // Nat Com. 2017. V. 8. P. 14261. https://doi.org/10.1038/ncomms14261
  22. De Witt M.A., Corn J.E., Carroll D. Genome editing via delivery of Cas9 ribonucleoprotein // Methods. 2017. V. 121−122. P. 9−15. https://doi.org/10.1016/j.ymeth.2017.04.003
  23. Svitashev S., Schwartz C., Lenderts B. et al. Genome editing in maize directed by CRISPR–Cas9 ribonucleoprotein complexes // Nat. Com. 2016. V. 7. P. 13274. https://doi.org/10.1038/ncomms14261
  24. Кулуев Б.Р., Гумерова Г.Р., Михайлова Е.В. и др. Доставка CRISPR/CAS-компонентов в клетки высших растений для редактирования их геномов // Физиол. растений. 2019. Т. 66. № 5. С. 339−353. https://doi.org/10.1134/S0015330319050117
  25. Kanchiswamy C.N. DNA-free genome editing methods for targeted crop improvement // Plant Cell Rep. 2016. V. 35. P. 1469−1474. https://doi.org/10.1007/s00299-016-1982-2
  26. Chase S.S. Monoploids and monoploid-derivatives of maize (Zea mays L.) // The Bot. Review. 1969. V. 35. № 2. P. 117−168. https://doi.org/10.1007/BF02858912
  27. Wolter F., Edelmann S., Kadri A., Scholten S. Characterization of paired Cas9 nickases induced mutations in maize mesophyll protoplasts // Maydica. 2018. V. 62. № 2. P. 1−11.
  28. Красова Ю.В., Фадеев В.В., Моисеева Е.М. и др. Оптимизация методики получения протопластов кукурузы и их нативность после электропорации// Изв. Саратовского у-та. Серия: Химия. Биология. Экология. 2022. Т. 22. Вып. 4. С. 445−454. https://doi.org/10.18500/1816-9775-2022-22-4-445-454
  29. Mekler V., Minakhin L., Semenova E. et al. Kinetics of the CRISPR-Cas9 effector complex assembly and the role of 3’-terminal segment of guide RNA // Nucl. Ac. Res. 2016. V. 44. № 6. P. 2837−2845. https://doi.org/10.1093/nar/gkw138
  30. Sant’Ana R.R.A., Caprestano C.A., Nodari R.O., Agapito-Tenfen S.Z. PEG-delivered CRISPR-Cas9 ribonucleoproteins system for gene-editing screening of maize protoplasts // Genes. 2020. V. 11. P. 1029−1043. https://doi.org/10.3390/genes11091029
  31. Yoo S.D., Cho Y.H., Sheen J. Arabidopsis mesophyll protoplasts: А versatile cell system for transient gene expression analysis // Nature Protocols. 2007. V. 2. № 7. P. 1565−1572. https://doi.org/10.1038/nprot.2007.199
  32. Дрейпер Дж., Скотт Р., Армитидж Ф. и др. Генная инженерия растений. Лабораторное руководство. М.: Мир, 1991. 408 c.
  33. Shan Q., Wang Y., Li J. et al. Targeted genome modification of crop plants using a CRISPR-Cas system // Nat. Biotechnol. 2013. V. 31. № 8. P. 686–688. https://doi.org/10.1038/nbt.2650
  34. Schneider C.A., Rasband W.S., Eliceiri K.W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis // Nat. Methods. 2012. V. 9. P. 671–675. https://doi.org/10.1038/nmeth.2089
  35. Sentmanat M.F., Peters S.T., Florian C.P. et al. A survey of validation strategies for CRISPR-Cas9 editing // Sci. Reports. 2018. V. 8. P. 888−895. https://doi.org/10.1038/s41598-018-19441-8

Дополнительные файлы

Доп. файлы
Действие
1. JATS XML
Скачать
2. Рис. 1. Оценка эффективности работы РНП-комплексов in vitro и в протопластах кукурузы. а – нуклеотидные последовательности участков гена GEX2, содержащие протоспейсеры для гидРНК 1, 2; целевые сайты для гидРНК выделены серым цветом, РАМ-последовательности – черным. б – электрофорез ПЦР-продуктов с фрагмента гена GEX2 после обработки РНП-комплексами in vitro; дорожки: 1 – ПЦР-продукт с целевым локусом для гидРНК 1 после инкубации с РНП-комплексом; 2 – ПЦР-продукт с целевым локусом для гидРНК 1 (без обработки); 3 – маркер молекулярного веса ДНК; 4 – ПЦР-продукт с целевым локусом для гидРНК 2 после инкубации с РНП-комплексом; 5 – ПЦР-продукт с целевым локусом для гидРНК 2 (без обработки). в – электрофорез ПЦР-продуктов с целевым локусом для гидРНК 2. Дорожки: 1 – ПЦР-продукт с фрагмента гена GEX2, полученный с ДНК протопластов кукурузы после трансформации с РНП-комплексами (45 мг нуклеазы/15 мг гидРНК) и обработанный рестриктазой BstMAI (ожидаемые размеры полос после гидролиза ‒ 324 и 183 пн); 2 – ПЦР-продукт с фрагмента гена GEX2, полученный с ДНК листа кукурузы и обработанный BstMAI; 3 – ПЦР-продукт с фрагмента гена GEX2 без обработки BstMAI (507 пн, контроль); 4 – маркер молекулярного веса ДНК, шаг 100 пн.

Скачать (238KB)
Метаданные

© Российская академия наук, 2024

Согласие на обработку персональных данных с помощью сервиса «Яндекс.Метрика»

1. Я (далее – «Пользователь» или «Субъект персональных данных»), осуществляя использование сайта https://journals.rcsi.science/ (далее – «Сайт»), подтверждая свою полную дееспособность даю согласие на обработку персональных данных с использованием средств автоматизации Оператору - федеральному государственному бюджетному учреждению «Российский центр научной информации» (РЦНИ), далее – «Оператор», расположенному по адресу: 119991, г. Москва, Ленинский просп., д.32А, со следующими условиями.

2. Категории обрабатываемых данных: файлы «cookies» (куки-файлы). Файлы «cookie» – это небольшой текстовый файл, который веб-сервер может хранить в браузере Пользователя. Данные файлы веб-сервер загружает на устройство Пользователя при посещении им Сайта. При каждом следующем посещении Пользователем Сайта «cookie» файлы отправляются на Сайт Оператора. Данные файлы позволяют Сайту распознавать устройство Пользователя. Содержимое такого файла может как относиться, так и не относиться к персональным данным, в зависимости от того, содержит ли такой файл персональные данные или содержит обезличенные технические данные.

3. Цель обработки персональных данных: анализ пользовательской активности с помощью сервиса «Яндекс.Метрика».

4. Категории субъектов персональных данных: все Пользователи Сайта, которые дали согласие на обработку файлов «cookie».

5. Способы обработки: сбор, запись, систематизация, накопление, хранение, уточнение (обновление, изменение), извлечение, использование, передача (доступ, предоставление), блокирование, удаление, уничтожение персональных данных.

6. Срок обработки и хранения: до получения от Субъекта персональных данных требования о прекращении обработки/отзыва согласия.

7. Способ отзыва: заявление об отзыве в письменном виде путём его направления на адрес электронной почты Оператора: info@rcsi.science или путем письменного обращения по юридическому адресу: 119991, г. Москва, Ленинский просп., д.32А

8. Субъект персональных данных вправе запретить своему оборудованию прием этих данных или ограничить прием этих данных. При отказе от получения таких данных или при ограничении приема данных некоторые функции Сайта могут работать некорректно. Субъект персональных данных обязуется сам настроить свое оборудование таким способом, чтобы оно обеспечивало адекватный его желаниям режим работы и уровень защиты данных файлов «cookie», Оператор не предоставляет технологических и правовых консультаций на темы подобного характера.

9. Порядок уничтожения персональных данных при достижении цели их обработки или при наступлении иных законных оснований определяется Оператором в соответствии с законодательством Российской Федерации.

10. Я согласен/согласна квалифицировать в качестве своей простой электронной подписи под настоящим Согласием и под Политикой обработки персональных данных выполнение мною следующего действия на сайте: https://journals.rcsi.science/ нажатие мною на интерфейсе с текстом: «Сайт использует сервис «Яндекс.Метрика» (который использует файлы «cookie») на элемент с текстом «Принять и продолжить».