The role of different subunits of INO80 remodeling complex in repair chromatin assembly in yeast Saccharomyces cerevisiae

Texto integral

Геном эукариот упакован в хроматин в виде ядерных нуклеосомных частиц, содержащих ядро октамера гистонов, обернутое примерно дважды 147 парами оснований ДНК [1]. Гистоны – это сильно заряженные основные белки, которые могут связываться с различными белками и нуклеиновыми кислотами. Для предотвращения неспецифического взаимодействия гистонов используются шапероны, которые помогают регулировать их правильную укладку в нуклеосомах [2]. Было показано, что посттрансляционное ацетилирование N-концевых хвостов гистонов является важным механизмом, с помощью которого клетки регулируют доступность хроматина [3]. Известно, что в ходе эксцизионной репарации нуклеотидов (НЭР) вновь репарированная ДНК собирается в хроматин [4] при помощи гистоновых шаперонов Asf1, CAF-1 и комплекса NuB4 [4, 5].

Ремодуляторы хроматина – это специализированные мультибелковые машины, которые могут изменять структуру, состав и расположение нуклеосом в ДНК. Ремоделирующие комплексы (РМК) по-разному влияют на структуру хроматина. Эукариоты содержат как минимум пять семейств РМК: SWI/SNF, ISWI, NURD, INO80 и SWR1. Все РМК содержат АТФазные субъединицы, которые имеют очень похожие АТФазные домены. С-концы этих белков имеют уникальные домены, которые определяют их специфическое связывание или регуляцию. Ферментативная активность этих комплексов приводит к изменению положения нуклеосом вдоль ДНК, увеличению доступности ДНК на поверхности нуклеосомы и/или обмену гистоновых белков внутри нуклеосом [6, 7].

Комплекс INO80 представляет собой эволюционно консервативный АТФ-зависимый комплекс ремоделирования хроматина, который первоначально был описан как участвующий в транскрипции и репарации ДНК [8–11]. В дрожжах S. cerevisiae INO80 необходим для адекватного процессинга репликативных вилок в клетках после обработки метилметансульфонатом вследствие его роли в толерантности к повреждениям ДНК [12]. Было показано, что INO80 необходим для эффективного привлечения Rad18, который инициирует безошибочный путь пострепликативной репарации. Таким образом, INO80 является регулятором толерантности к повреждениям ДНК во время репликации [13].

Комплекс INO80 у S. cerevisiae состоит из 15 различных субъединиц: Ino80, Rvb1, Rvb2, Arp4, Arp5, Arp8, Act1, Taf14, Nhp10, Ies1, Ies2, Ies3, Ies4, Ies5 и Ies6 [12]. В дополнение к каркасу Ino80–Ies2 были идентифицированы четыре топологических модуля: Nhp10–Ies1–Ies3–Ies5 (Nhp10-модуль), Arp4–Arp8–Act1–Taf14–Ies4 (Arp8-модуль), Rvb1–Rvb2 (Rvb1/2-модуль) и Arp5–Ies6 (Arp5-модуль). Сборка Arp5–Ies6 необходима для сопряжения гидролиза АТФ с продуктивным движением нуклеосом [14]. Функция модуля Arp5 важна для стимулируемого нуклеосомами гидролиза АТФ и ремоделирования хроматина [15], что подтверждает идею о том, что модуль Arp5 функционирует как комплекс нуклеосома/гистон–шаперон и посредник ремоделирования, который связывается с ДНК. Модуль Nhp10 INO80 представляет собой модуль связывания нуклеосом с высоким сродством. Nhp10 представляет собой HMG2-box белок, который, как известно, связывает искаженную ДНК [16, 17]. Nhp10–Ies3–Ies5 тесно связан с ДНК и нуклеосомами, что позволяет предположить, что этот модуль способствует высокоаффинному нацеливанию INO80. Однако модуль Nhp10 не оказывал влияния на активность АТФазы и способность перемещать нуклеосомы, что позволяет предположить, что он не является частью основной ремоделирующей активности [12]. Таким образом, эти данные позволяют предположить, что модули Arp8 и Arp5 участвуют в реакции ремоделирования, тогда как модуль Nhp10 способствует высокоаффинному распознаванию ДНК или нуклеосом [12].

Комплекс NuB4 взаимодействует с шапероном Asf1p, который контролирует сборку хроматина. Это взаимодействие эволюционно консервативно и наблюдается у множества организмов [18–21]. Hat1 – каталитическая субъединица комплекса NuB4, в который входят Hat1p, Hat2p и Hif1p [22–23]. Hat2p обладает активностью шаперона гистонов и, как полагают, облегчает взаимодействие различных комплексов NuB4 с гистонами [24–27]. Hif1p является членом семейства гистоновых шаперонов N1 и специфически связывается с гистонами H3 и H4. Hif1p может играть роль в укладке гистонов на ДНК, что позволяет предположить, что Hat1p может быть непосредственно вовлечен в процесс сборки хроматина [22]. Комплекс NuB4 физически взаимодействует с Hsm3p, который мы ранее идентифицировали как функциональную субъединицу комплекса NuB4 [5, 28–30]. Ранее было показано, что инактивация субъединиц Hif1 и Hsm3 комплекса NuB4 приводит к снижению экспрессии гена RNR3, кодирующего субъединицу рибонуклеотидредуктазного комплекса RNR [5]. В настоящем исследовании мы сосредоточились на процессах, которые происходят во время репаративной сборки хроматина в дрожжевых клетках. Наши результаты впервые показали, что мутации в генах, контролирующих ремодуляторы хроматина, могут проявлять сильное взаимодействие с мутациями в генах гистоновых шаперонов.

Материалы и методы

Штаммы

Делеции генов получали путем ПЦР-опосредованного разрушения генов с использованием специфических маркеров [31]. Все штаммы, используемые в работе, происходят из коллекции группы генетических исследований хроматина и репарации Лаборатории экспериментальной генетики или были получены в ходе исследования. Генотипы штаммов дрожжей, использованных в данном исследовании, представлены в табл. 1.

 

Таблица 1. Штаммы дрожжей, использованные в работе

Штамм	Генотип	Источник
LMG-3031	MATα ade2Δ-248 ura3-160, 188 leu2-3, 112 trp1	Наша коллекция
TAE-200	MATα ade2Δ-248 ura3-160, 188 leu2-3, 112 trp1 ies5Δ	Получены в ходе исследования
TAE-201	MATα ade2Δ-248 ura3-160, 188 leu2-3, 112 trp1 nhp10Δ	»
TAE-203	MATα ade2Δ-248 ura3-160, 188 leu2-3, 112 trp1 ies5Δ hsm3Δ	»
TAE-204	MATα ade2Δ-248 ura3-160, 188 leu2-3, 112 trp1 ies5Δ hif1Δ	»
TAE-205	MATα ade2Δ-248 ura3-160, 188 leu2-3, 112 trp1 nhp10Δ hsm3Δ	»
TAE-206	MATα ade2Δ-248 ura3-160, 188 leu2-3, 112 trp1 nhp10Δ rad2Δ	»
LMG-352	MATα ade2Δ-248 ura3-160, 188 leu2-3, 112 trp1 ies5Δ rad2Δ	»
EAA-1	MATα ade2Δ-248 ura3-160, 188 leu2-3, 112 trp1 rpd3Δ	Наша коллекция
EAA-2	MATα ade2Δ-248 ura3-160, 188 leu2-3, 112 trp1 ies5Δ rpd3Δ	Получены в ходе исследования
TAE-202	MATα ade2Δ-248 ura3-160, 188 leu2-3, 112 trp1 ies6Δ	»
ТАЕ-207	MATα leu2-3, 112 ade2-192 ies6Δ	»
ТАЕ-208	MATα leu2-3, 112 ade2-192 ies6Δ/MATa leu2-3, 112 ade2-192 ies6Δ	»
TAE-209	MATα leu2-3, 112 ade2-192/MATa leu2-3, 112 ade2-192	»

 

Получение штаммов

Для разрушения открытой рамки считывания гена IES5 (YER092W) клетки штамма дрожжей дикого типа (LMG-3031) трансформировали фрагментом ДНК, содержащим маркер NatMX, с фланкирующими нуклеотидными последовательностями, гомологичными флангам гена IES5. Фрагмент генерировали путем ПЦР-амплификации с праймерами IES5-1 (5’-TGACTGCGATGACTCTAGCG-3’) и IES5-2 (5’-CGGTTTAAGCCACATGTTAGG-3’) и ДНК, выделенной из штамма KFY-827 в качестве матрицы. Трансформанты с делецией гена IES5 отбирали по их устойчивости к кланату с использованием полной среды, содержащей нурсеотрицин в концентрации 20 мкг/мл. Разрушение гена IES5 было подтверждено с помощью ПЦР.

Для разрушения открытой рамки считывания гена IES6 (YEL044W) клетки штамма дрожжей дикого типа (LMG-3031) трансформировали фрагментом ДНК, содержащим маркер KanMX, с фланкирующими нуклеотидными последовательностями, гомологичными флангам гена IES6. Фрагмент генерировали путем ПЦР-амплификации с праймерами IES6-1 (5’-GGCTCTCTGTGCGAAGGAAG–3’) и IES6-2 (5’-GAGACTGGCATCCATGCATG-3’) и ДНК, выделенной из штамма KFY-1437 в качестве матрицы. Трансформанты с делецией гена IES6 отбирали по их устойчивости к генетицину с использованием полной среды, содержащей генетицин в концентрации 200 мкг/мл. Разрушение гена IES6 было подтверждено с помощью ПЦР.

Для разрушения открытой рамки считывания гена NHP10 (YDL002C) клетки штамма дрожжей дикого типа (LMG-3031) трансформировали фрагментом ДНК, содержащим маркер NatMX, с фланкирующими нуклеотидными последовательностями, гомологичными флангам гена NHP10. Фрагмент генерировали путем ПЦР-амплификации с праймерами NHP10-1 (5’-GCTAAGAAATCTTGTGCACGA-3’) и NHP10-2 (5’-TAGGAATCGTCTGCCCACGT-3’) и ДНК, выделенной из штамма KFY-1803 в качестве матрицы. Трансформанты с делецией гена NHP10 отбирали по их устойчивости к кланату с использованием полной среды, содержащей нурсеотрицин в концентрации 20 мкг/мл. Разрушение гена NHP10 было подтверждено с помощью ПЦР.

Питательные среды

Состав минимальной среды, использованной в качестве селективной, а также среды D для выращивания культур и учета выживаемости приведены в [31]. Специальную среду с добавлением 96%-ного этанола (15 мл/л) и 40%-ной глюкозы (4 мл/л), исключающую рост мутантов с дыхательной недостаточностью, использовали для оценки индуцированного мутагенеза в локусах ADE4–ADE8 [32]. Для определения частоты спонтанных мутаций устойчивости к канаванину методом упорядоченного посева использовали среду минимального состава с добавлением аминокислот и азотистых оснований, необходимых для роста тестируемых штаммов, и различных концентраций канаванина. Во флуктуационном методе медиан использовали среду того же состава, но обогащенную полным набором аминокислот (за исключением аргинина) и азотистых оснований и содержащую более высокие концентрации канаванина [33].

Чувствительность к УФ-излучению

Тесты на выживаемость клеток проводили путем выращивания в течение ночи культуры соответствующего штамма в жидкой YPD при 30 °C. Клетки промывали и ресуспендировали в воде с плотностью 1 × 10⁷ кл./мл. Суспензию клеток облучали УФ-лампой БУВ-30 (диапазон УФ-С) с мощностью дозы на верхнем уровне 1.4 Дж/м²с (для штаммов дикого типа, ies5Δ, nhp10Δ, ies6Δ, rpd3Δ, ies5Δ rpd3Δ, ies5Δ him1Δ, ies5Δ hsm3Δ, ies5Δ hif1Δ, nhp10Δ him1Δ, nhp10Δ hsm3Δ и nhp10Δ hif1Δ) и на нижнем уровне – 0.21 Дж/м² с (для штаммов rad2Δ, rad2Δ ies5Δ и rad2Δ nhp10Δ). Аликвоты отбирали после различных доз облучения, разбавляли и помещали на чашки с YPD для определения количества выживших [5].

Мутационные тесты

Мутационные тесты проводили путем выращивания в течение ночи культуры соответствующего штамма в жидкой YPD при 30 °C. Клетки промывали и ресуспендировали в воде с плотностью 1 × 10⁷ кл./мл. Клетки облучали УФ-лампой БУВ-30. Аликвоты отбирали после различных доз облучения, разбавляли и помещали на чашки с YPD для определения количества выживших. Для определения частоты мутаций неразведенные аликвоты высевали на среду YPD со спиртом вместо глюкозы, состав которой был описан ранее [32].

Спонтанный мутагенез определяли с использованием стандартного метода медиан (флуктуационный тест), который регистрирует в основном ошибки репликации [34]. После трехдневной инкубации отбирали 12 отдельных колоний, каждую из которых суспендировали в 1 мл воды и высевали на селективную среду с канаванином в концентрации, исключающей возможность роста чувствительных к канаванину клеток. При оценке количества высеянных клеток мы разбавляли суспензии и высевали их на полную среду. После инкубации в течение трех-четырех дней подсчитывали количество колоний, устойчивых к канаванину, и общее количество колоний, чувствительных к канаванину, на чашке Петри. Частоту возникновения спонтанных мутаций оценивали по специальной формуле [34].

В других экспериментах скорость спонтанных мутаций устойчивости к канаванину оценивали по методу упорядоченного посева Хромова-Борисова [35]. Этот метод позволяет измерять скорость репаративного мутагенеза. В этих экспериментах тестируемые дрожжевые культуры выращивали на чашках с полной средой в течение суток. Затем готовили 5 мл суспензии (1×10⁶ кл./мл). Специальный репликатор на 150 штырей был погружен в эту суспензию и перенесен на чашку Петри со средой, содержащей канаванин. Репликатор переносил 150 равных капель дрожжевой суспензии (около 2 мкл каждая) на равных расстояниях друг от друга, каждая капля содержала приблизительно 2000 клеток. Концентрация канаванина для оценки скорости мутаций устойчивости к антибиотику была определена в специальных предварительных экспериментах для всех штаммов и составила 50 мг/л. Мутанты имеют более быстрый рост, который проявляется в виде “бородавок” на пятнах с ограниченным ростом исследуемой культуры. После 14–15 дней инкубации подсчитывали бородавки мутантов, устойчивых к канаванину, и общее количество клеток. Последнее было сделано после смыва клеток с ряда реплик капель, лишенных бородавок. Частоты мутаций на одно деление клеток определяли путем деления числа бородавок на общее количество клеток на чашке. Результаты представлены как средние значения 3–5 независимых экспериментов с 95%-ным доверительным интервалом.

ПЦР в реальном времени

Для проведения ПЦР в реальном времени была использована система детекции RT-PCR CFX96 (Bio-Rad, Великобритания). Реакции проводили в 25 мкл объемах, состоящих из 10 мкл 2.5-кратной реакционной смеси для ОТ-ПЦР в присутствии красителя SYBR Green I и эталонного красителя Rox (Syntol, Россия), 13.8 мкл воды, 1 мкл кДНК и 0.1 (2 мМ) соответствующих праймеров (праймеры для гена RNR3: ForRNR3 5-ACACCTTTCATGGTTTATAAG-3ꞌ и RevRNR3 5-CGACGATTTCACAACATAA-3ꞌ; для гена ACT1: ForACT1 5ꞌ-GAAGGTCAAGATCATTGC-3ꞌ и RevACT1 5ꞌ- GTTGGAAGGTAGTCAAAG-3ꞌ).

Условия амплификации ПЦР были следующими: 1 цикл по 5 мин при 95 °С, затем 39 циклов по 15 с при 95 °С и 20 с при 52 °С. Анализ кривой плавления показал 5-секундное увеличение на 1 °C с 55 до 95 °C.

Контрольные реакции с праймером и без матрицы реакционных смесей были включены. Два биологических и три технических повтора были выполнены для каждого образца. Результаты были обработаны с использованием программы CFX Manager.

Статистический анализ

Экспериментальные данные представлены как стандартная ошибка среднего (SEM) по крайней мере от трех повторов, а статистические различия определялись с помощью t-критерия Стьюдента. Значимость определяли на уровне р < 0.05 [5].

Результаты

Сборка хроматина накладывает ограничения на многие клеточные процессы, требующие доступа к хромосомной ДНК. Гистоновые шапероны играют ключевую роль в динамике хроматина, контролируя процессы его разборки и сборки [36–37]. В отличие от репликативной сборки хроматина процесс репарационной сборки менее изучен. Это связано с тем, что еще не все участники выявлены и не все связи между этапами этого процесса установлены. Показано, что мутанты по гену INO80 влияют на процессы репарации у дрожжей [9]. Мутации некоторых компонентов комплекса INO80 проявляют гиперчувствительность к генотоксическим агентам [8, 38, 39].

Ранее мы показали, что анализ индуцированного мутагенеза у различных мутантов по репарации может служить тонким инструментом для изучения процесса репарационной сборки хроматина [5, 40, 41]. Как отмечалось ранее, Ies5, Ies6 и Nhp10 являются компонентами комплекса ремоделирования хроматина INO80. Роль генов NHP10, IES5 и IES6, кодирующих субъединицы двух модулей комплекса INO80, в генетическом контроле мутационного процесса ранее не изучалась. Мы получили нулевые мутанты по этим генам и охарактеризовали их чувствительность к УФ-излучению, а также влияние мутаций в генах NHP10, IES5 и IES6 на частоту УФ-индуцированных и спонтанных мутаций.

IES6

Потеря каталитической субъединицы Ies6 или Ino80 приводит к быстрому увеличению плоидности. Одним из путей к полиплоидии является аномальная сегрегация хромосом из-за аберрантной структуры центромеры [42]. Поэтому мы попытались изучить эффекты мутации ies6Δ, когда мутация является гомозиготной в диплоидных клетках, несущих мутацию ade2-192 также в гомозиготном состоянии. ade2-192 представляет собой редко ревертирующую миссенс-мутацию. Частота спонтанных реверсий у диплоидного штамма дикого типа, гомозиготного по мутации ade2-192, составила 2.9 ± 0.5 × 10⁻⁸. У диплоида, гомозиготного по мутациям ies6Δ и ade2-192, эта частота составила 1.4 ± 0.4 × 10⁻⁸. Таким образом, мутация ies6Δ снижает частоту спонтанного мутагенеза примерно в 2 раза. Для дальнейшего тестирования выживаемости мутанта ies6Δ ade2-192 мы провели эксперименты с УФ-светом. Было обнаружено, что этот мутант проявлял такую же чувствительность к УФ, как и штамм дикого типа (рис. 1).

 

Рис. 1. Чувствительность к УФ-свету и частота УФ-индуцированного мутагенеза в локусе CAN1 у штамма дикого типа и мутантного диплоидного штамма ies6Δ при обработке различными дозами ультрафиолетового излучения. На графиках показаны стандартные ошибки среднего значения (± SEM), полученные в результате пяти независимых экспериментов.

 

Далее мы проверили, как мутация гена IES6 влияет на УФ-индуцированный мутагенез. Как показано на рис. 1, мутант ies6Δ ade2-192 продемонстрировал уровень УФ-индуцированного мутагенеза, свойственный штамму дикого типа. Таким образом, мутация ies6Δ не оказывает существенного влияния на выживаемость и мутагенез дрожжевых клеток после УФ-облучения.

IES5 и NHP10

В настоящей работе проведено сравнительное исследование генетических свойств мутаций ies5Δ и nhp10Δ и их взаимодействия с делеционными мутациями в генах HSM3 и HIF1, которые кодируют субъединицы комплекса NuB4 и принимают участие в репаративной сборке хроматина. Сначала мы протестировали чувствительность к УФ-излучению штамма дикого типа и одиночных мутантов ies5Δ и nhp10Δ. Как видно из рис. 2,а, одиночный мутант продемонстрировал чувствительность к УФ, сравнимую с чувствительностью штамма дикого типа. Мутация ies5Δ в сочетании с rad2Δ не приводила к изменению устойчивости к УФ-излучению клеток двойного мутанта ies5Δ rad2Δ по сравнению с клетками одиночного мутанта rad2Δ (рис. 3). На основании полученных данных можно сделать вывод, что мутации в гене IES5, кодирующем субъединицу модуля Nhp10 комплекса INO80, не изменяют устойчивости клеток к УФ-излучению и не влияют на НЭР. В отличие от ies5Δ, мутант nhp10Δ показал незначительное увеличение чувствительности к УФ-излучению (рис. 2,б). Двойной мутант nhp10Δ rad2Δ значительно отличался от одиночного мутанта rad2Δ (рис. 3). Таким образом, мутанты по генам, кодирующим субъединицы одного модуля комплекса INO80, по-разному влияют на УФ-чувствительность дрожжевых клеток.

 

Рис. 2. Чувствительность к УФ-свету и частота УФ-индуцированного мутагенеза в локусах ADE4–ADE8 у штамма дикого типа и мутантного штамма ies5Δ (а) и мутантного штамма nhp10Δ (б) при обработке различными дозами ультрафиолетового излучения.

 

Рис. 3. Чувствительность к УФ-свету и частота УФ-индуцированного мутагенеза в локусах ADE4–ADE8 у штамма дикого типа и мутантных штаммов rad2Δ, rad2Δ ies5Δ и rad2Δ nhp10Δ при обработке различными дозами ультрафиолетового излучения.

 

Далее была исследована возможная роль Ies5 и Nhp10 в мутационном процессе. Мы решили сравнить спонтанный мутагенез у мутантов ies5Δ и nhp10Δ со штаммом дикого типа. При изучении частоты возникновения спонтанных мутаций использовали два разных метода: флуктуационный тест (метод “медианы Коулсона – Ли”), который в основном позволяет определить уровень спонтанного репликативного мутагенеза, и метод упорядоченного посева, по результатам которого можно судить об уровне репаративного мутагенеза [5]. В обоих случаях была рассчитана частота мутаций гена CAN1, приводящих к устойчивости к канаванину. Из табл. 2 видно, что наличие в клетках мутации ies5Δ приводит к снижению скорости спонтанного репликативного мутагенеза. Поскольку метод упорядоченного посева одновременно выявляет репликативный и репаративный спонтанный мутагенез, вклад репаративного мутагенеза в общую скорость спонтанного мутагенеза у мутанта ies5Δ составит около 100%. Учитывая это обстоятельство, можно заключить, что мутация ies5Δ увеличивает скорость репаративного мутагенеза примерно в два раза. Мутация nhp10Δ не изменяла скорость репликативного спонтанного мутагенеза, но увеличивала репаративный мутагенез в 6–7 раз (табл. 2).

 

Таблица 2. Спонтанный мутагенез устойчивости к канаванину

Штаммы	Упорядоченный посев, ×10−7	Флуктуационный тест, ×10−7
WT	3.0 ± 0.24	3.0 ± 0.16
ies5Δ	4.4 ± 0.7	>1
ies6Δ / ies6Δ	2.7 ± 0.7	>1
nhp10Δ	19.8 ± 3.4	–

 

Для оценки влияния мутаций ies5Δ и nhp10Δ на УФ-индуцированный мутагенез мы измерили частоту прямых мутаций в локусах ADE4–ADE8, индуцированных УФ-лучами у штамма дикого типа и одиночных мутантов ies5Δ и nhp10Δ. Данные, представленные на рис. 2,б, позволяют предположить, что мутация ies5Δ не влияет на частоту УФ-индуцированного мутагенеза. Частота УФ-индуцированного мутагенеза у двойного мутанта ies5Δ rad2Δ практически не отличалась от одиночного rad2Δ (рис. 3). В отличие от ies5Δ мутант nhp10Δ усиливал УФ-индуцированный мутагенез по сравнению со штаммом дикого типа (рис. 2,б). Двойной мутант nhp10Δ rad2Δ проявлял гиперчувствительность по сравнению с одиночным мутантом. Это взаимодействие было аддитивным, что указывает на разницу в механизмах чувствительности к УФ-излучению, опосредованную мутациями nhp10Δ и rad2Δ (рис. 3). Однако при равной выживаемости частота мутаций у мутанта nhp10Δ и штамма дикого типа была одинаковой. Такая же картина наблюдалась для мутантов rad2Δ и nhp10Δ rad2Δ.

Ранее было показано, что комплекс NuB4 может принимать непосредственное участие в процессе сборки хроматина [5, 22]. На основании полученных данных мы предположили, что инактивация субъединиц Hif1 и Hsm3 комплекса NuB4 приводит к неправильной сборке нуклеосом, что влияет на активацию киназы Rad53 [5]. Модуль Nhp10 способствует высокоаффинному связыванию с ДНК или нуклеосомой [12]. Исходя из нашего предположения, если между белками Hsm3 и Hif1 существует генетическое взаимодействие с белками Ies5 и Nhp10, то можно ожидать изменения фенотипических проявлений их мутаций в двойных мутантах. С помощью этого анализа мы стремились подтвердить, что мутации hsm3Δ и hif1Δ действительно нарушают правильную сборку нуклеосом.

Одиночные мутанты hif1Δ и hsm3Δ показали такую же чувствительность к УФ, как и штамм дикого типа [5], а также одиночный ies5Δ. Однако двойной мутант hsm3Δ ies5Δ показал гиперчувствительность к УФ-облучению (рис. 4,а). Точно такую же природу взаимодействия показали мутации hif1Δ и ies5Δ (рис. 4,а). В отличие от мутанта ies5Δ, одиночный nhp10Δ проявлял гиперчувствительность к УФ-облучению, и оба двойных hif1Δ nhp10Δ и hsm3Δ nhp10Δ ничем не отличались от одиночного nhp10Δ (рис. 4,б). Таким образом, дефекты структуры нуклеосомы, вызванные мутациями hif1Δ и hsm3Δ, не приводят к дальнейшему увеличению УФ-чувствительности мутанта nhp10Δ.

 

Рис. 4. Чувствительность к УФ-свету и частота УФ-индуцированного мутагенеза в локусах ADE4–ADE8 у штамма дикого типа и мутантных штаммов ies5Δ hsm3Δ, ies5Δ hif1Δ и ies5Δ him1Δ (а) и nhp10Δ hsm3Δ, nhp10Δ hif1Δ и nhp10Δ him1Δ (б) при обработке различными дозами ультрафиолетового излучения.

 

Дальнейший генетический анализ изученных мутантов был проведен для понимания взаимодействия соответствующих белковых продуктов в УФ-индуцированном мутагенезе. Характерной особенностью мутантов hif1Δ и hsm3Δ является высокий УФ-индуцированный мутагенез [5], тогда как ies5Δ по этому показателю не отличается от штамма дикого типа. Как видно из рис. 4,а, мутация ies5Δ полностью подавляет характерный мутагенез hif1Δ и hsm3Δ, частота УФ-индуцированных мутаций у этих мутантов даже ниже по сравнению со штаммом дикого типа. Мутация nhp10Δ снижала характерный для hif1Δ и hsm3Δ мутагенез до уровня штамма дикого типа, в то же время подавлялся nhp10-зависимый мутагенез (рис. 4,б). В совокупности эти результаты подтверждают нашу гипотезу о том, что мутации hif1Δ и hsm3Δ приводят к некорректной сборке нуклеосом и указывают на то, что ремоделирующий комплекс INO80 не может редактировать эти искажения структуры нуклеосом.

Для завершения сборки хроматина необходимо удалить ацетильные группы с N-концевых хвостов гистонов. Для этого клетка использует гистондеацетилтрансферазы (HDAC), одной из таких HDAC является комплекс RPD3. У S. cerevisiae этот комплекс представляет собой HDAC класса I и существует в виде комплексов Rpd3L или Rpd3S, оба из которых имеют общие субъединицы Rpd3, Sin3 и Ume1 [43, 44], которые могут проявлять свойства гистонового шаперона во время репаративной сборки хроматина [45]. Было решено изучить взаимодействие мутаций ies5Δ и rpd3Δ. Чтобы оценить эффект мутации в гене, кодирующем субъединицу Rpd3 комплекса RPD3, мы разрушили ген IES5 в одиночном мутанте rpd3Δ. Как показано на рис. 5, оба одиночных мутанта не отличались по выживаемости от двойного мутанта ies5Δ rpd3Δ. Однако УФ-индуцированный мутагенез у двойного мутанта был подавлен и находился на том же уровне, что и у мутанта ies5Δ him1Δ (рис. 4, 5). Эти результаты позволяют предположить, что отсутствие деацетилирования вновь собранных нуклеосом препятствует нормальному функционированию комплекса INO80.

 

Рис. 5. Чувствительность к УФ-свету и частота УФ-индуцированного мутагенеза в локусах ADE4–ADE8 штамма дикого типа и мутантных штаммов ies5Δ rpd3Δ и rpd3Δ при обработке различными дозами ультрафиолетового излучения.

 

Him1 и комплекс INO80

Одиночный мутант him1Δ показал большую устойчивость к УФ-излучению по сравнению со штаммом дикого типа [46]. На основании этих данных мы исследовали потенциальные эпистатические связи между мутациями генов NHP10, IES5 и HIM1. Мутация nhp10Δ подавляет him1-зависимую устойчивость к УФ-излучению до уровня одиночного мутанта nhp10Δ (рис. 4). Как и в случае с мутантами hsm3Δ и hif1Δ, мутация him1Δ приводила к гиперчувствительности двойного мутанта him1Δ ies5Δ (рис. 4,а).

УФ-индуцированный мутагенез у мутанта him1Δ высок, как и у мутантов hsm3Δ и hif1Δ [45]. Мы создали двойные мутанты ies5Δ him1Δ и nhp10Δ him1Δ и изучили УФ-индуцированный мутагенез у этих двойных мутантов. Характер взаимодействия мутации him1Δ с мутациями ies5Δ и nhp10Δ при УФ-индуцированном мутагенезе был аналогичен мутациям hsm3Δ и hif1Δ (рис. 4,б). Таким образом, на основании полученных данных можно заключить, что мутация him1Δ, как и мутации hsm3Δ и hif1Δ, приводит к некорректной сборке нуклеосом.

Экспрессия RNR3 у мутантов ies5Δ и nhp10Δ

Ранее мы показали, что причиной усиленного УФ-мутагенеза мутантов hsm3Δ и hif1Δ является промежуточная УФ-индуцированная активация киназы Rad53 [5]. Уровень активации киназы Rad53 можно определить при помощи уровня экспрессии гена RNR3, продукт которого является субъединицей рибонуклеотидредуктазного комплекса RNR, активность которого непосредственно регулируется киназой Rad53 [41]. При самом высоком и самом низком уровнях активации киназы hsm3- и hif1-специфический мутагенез подавляется [5]. Поскольку мутации ies5Δ и nhp10Δ подавляют мутагенез, специфичный для him1Δ, hsm3Δ и hif1Δ, было протестировано влияние мутаций ies5Δ и nhp10Δ на уровень УФ-индуцированной экспрессии гена RNR3. Мы облучали УФ-светом мутантные клетки дикого типа, ies5Δ и nhp10Δ и через 4 часа измеряли уровни мРНК гена RNR3 в облученных и необлученных клетках. Как видно из рис. 6, уровень мРНК в клетках дикого типа увеличился почти в 2 раза.

 

Рис. 6. Гистограммы показывают относительную нормализованную экспрессию гена RNR3 в штамме дикого типа и мутантных штаммах: ies5Δ, ies5Δ him1Δ, ies5Δ hsm3Δ и ies5Δ hif1Δ (а); nhp10Δ, nhp10Δ him1Δ, nhp10Δ hsm3Δ и nhp10Δ hif1Δ (б) до и после облучения их ультрафиолетовым светом (после УФ-облучения клетки выдерживали в течение четырех часов при 30° C в термостате для индукции), доза УФ-излучения составляла 252 Дж/м²; * р < 0.05, t-критерий Стьюдента.

 

У одиночного мутанта ies5Δ уровень экспрессии гена RNR3 был немного снижен по сравнению с уровнем штамма дикого типа (рис. 6,а), что не влияло на частоту УФ-индуцированного мутагенеза. С другой стороны, мутация nhp10Δ подавляет уровень экспрессии до промежуточного уровня, что объясняет усиление УФ-индуцированного мутагенеза у этого штамма. Возникает вопрос, почему мутации ies5Δ и nhp10Δ подавляют him1-, hsm3- и hif1-специфический мутагенез? Аналогичное подавление УФ-специфического мутагенеза мы наблюдали у двойных мутантов hat1Δ hsm3Δ и hsm3Δ hif1Δ [5]. Hat1 является ключевой субъединицей комплекса NuB4, и ее отсутствие полностью разрушает комплекс, поэтому у мутанта нарушается репаративная сборка нуклеосом. Именно это событие приводит к гиперактивации экспрессии гена RNR3 у мутанта hat1Δ. У двойного мутанта hsm3Δ hif1Δ уровень УФ-индуцированной экспрессии гена RNR3 подавлен до уровня клеток дикого типа без облучения. В этом случае подавление RNR3 происходит за счет аддитивного эффекта обеих мутаций. В экспериментах с УФ-облучением двойные мутанты ies5Δ him1Δ, ies5Δ hsm3Δ и ies5Δ hif1Δ показали дальнейшее снижение уровней экспрессии RNR3 по сравнению с одиночным мутантом ies5Δ. Согласно этому наблюдению, можно предположить, что у двойных мутантов ies5Δ him1Δ, ies5Δ hsm3Δ и ies5Δ hif1Δ наблюдается аддитивное взаимодействие мутаций. В экспериментах без УФ-облучения мутация nhp10Δ более эффективно снижает уровень экспрессии гена RNR3 по сравнению с мутацией ies5Δ. Та же тенденция наблюдалась у двойных мутантов nhp10Δ him1Δ и nhp10Δ hsm3Δ (рис. 6,б). Однако мутант nhp10Δ hif1Δ имел более высокий уровень экспрессии RNR3 по сравнению с мутантом ies5Δ hif1Δ как до, так и после УФ-облучения. При этом уровень экспрессии RNR3 после облучения достиг уровня штамма дикого типа. Возможно, этот эффект связан, как и в случае с мутацией hat1Δ, с полной дисфункцией вновь собранных нуклеосом.

Обсуждение

Было показано, что посттрансляционное ацетилирование N-концевых хвостов гистонов является важным механизмом, с помощью которого клетки регулируют доступность хроматина [3]. Процесс сборки репарационного хроматина имеет ряд отличий от процесса сборки при репликации и менее полно изучен, чем последний. В ряде недавних работ мы попытались расширить наши знания о механизме репарационной сборки хроматина [5, 40, 41]. Ассоциация гистонового шаперона Hif1 с NuB4 стала первым прямым доказательством роли комплекса HAT1 в процессе сборки хроматина [22]. Показано, что Hat1, помимо Hif1 и Hat2, взаимодействует с шаперонами Asf1 и Hsm3 [5, 47]. Ранее мы показали, что инактивация обеих вспомогательных субъединиц NuB4 комплекса Hsm3 и Hif1 частично подавляет УФ-индуцированную экспрессию генов комплекса RNR, тогда как инактивация обеих субъединиц приводит к ее полному подавлению [5]. Предполагается, что потеря вспомогательных субъединиц комплекса NuB4 при репарационной сборке хроматина приводит к дефектам нуклеосомы.

Эксперименты по взаимодействию мутаций ies5Δ и rpd3Δ показали, что отсутствие деацетилирования вновь встроенных нуклеосом препятствует нормальному функционированию комплекса INO80, что указывает на то, что ацетилированные нуклеосомы воспринимаются комплексом INO80 как поврежденные и подтверждают роль комплекса RPD3 в репаративной сборке хроматина. Nhp10–Ies3–Ies5 тесно связан с ДНК и нуклеосомами, что позволяет предположить, что этот модуль способствует высокоаффинному нацеливанию INO80 на ДНК. Мы предположили, что дефекты структуры нуклеосомы, возникающие в результате некорректной сборки хроматина, могут препятствовать эффективному связыванию комплекса INO80 с восстановленным хроматином. Для проверки этих гипотез были проведены эксперименты с двойными мутантами, включая мутации ies5Δ, nhp10Δ, с одной стороны, и мутации hsm3Δ, hif1Δ, him1Δ, с другой стороны. Мутация nhp10Δ вызывает гиперчувствительность к УФ-облучению, что указывает на нарушение связывания комплекса INO80 с восстановленным хроматином. У двойных мутантов дефекты структуры нуклеосом, вызванные мутациями him1Δ, hsm3Δ и hif1Δ, существенно не влияют на выживаемость мутанта nhp10Δ после УФ-облучения. Возможно, белок Nhp10 обеспечивает соединение комплекса INO80 с ДНК и не играет существенной роли в связывании этого комплекса с нуклеосомой. Одиночная мутация ies5Δ не вызывает гиперчувствительности к УФ-облучению, что указывает на нормальное связывание комплекса INO80 с репарированным хроматином. Однако у двойного мутанта дефекты структуры нуклеосомы, вызванные мутациями him1Δ, hsm3Δ и hif1Δ, приводят к гиперчувствительности клеток к УФ-облучению. Мы предполагаем, что белок Ies5, возможно, обеспечивает соединение комплекса INO80 с нуклеосомой и не играет существенной роли в связывании этого комплекса с ДНК. Наши данные о взаимодействии мутации him1Δ с мутациями ies5Δ и nhp10Δ, кодирующими субъединицы ремоделирующего комплекса INO80, подтверждают нашу гипотезу о том, что белок Him1 выполняет шаперонную функцию в процессе репарационной сборки хроматина.

Таким образом, мы впервые продемонстрировали, что мутации в генах, контролирующих ремодуляторы хроматина, могут проявлять сильные взаимодействия с мутациями в генах гистоновых шаперонов.

Ранее мы показали, что одиночные мутации в генах ISW1, ISW2 и CHD1 слабо влияют на репарационные и мутагенные процессы в дрожжевых клетках. В то же время существуют различия во влиянии этих мутаций на уровни спонтанных мутаций, что указывает на определенную специфичность действия белковых комплексов ISW1, ISW2 и CHD1 на экспрессию разных генов, контролирующих процессы репарации и мутации у дрожжей [48]. Функция модуля Arp5 важна для стимулируемого нуклеосомами гидролиза АТФ и ремоделирования хроматина [12], поэтому мы не наблюдали влияния инактивации гена IES6 на индуцированный мутагенез, аналогичного мутациям в генах, кодирующих субъединицы других ремоделирующих комплексов ISW1, ISW2 и CHD1. В то же время инактивация различных субъединиц INO80 влияет на уровень спонтанного мутагенеза (табл. 2), как и мутации в генах, кодирующих упомянутые выше ремодуляторы.

Фосфорилированный Rad9 взаимодействует с COOH-концевым доменом Rad53. Инактивация этого домена устраняет зависимое от повреждения ДНК фосфорилирование Rad53, остановку фазы клеточного цикла G2/M и увеличение транскрипции RNR3 [49]. Ранее мы использовали аллель гена RAD53 с поврежденной С-терминальной последовательностью. Мутация rad53+HA-F не увеличивала экспрессии RNR3 по сравнению с клетками дикого типа в нормальных условиях роста и после УФ-облучения. В двойном мутанте rad53+HA-F hsm3Δ мутаторный фенотип мутанта hsm3Δ полностью подавлялся [41]. Таким образом, Rad9 отвечает за максимальную гиперактивацию киназы Rad53 при репарации повреждений ДНК. На основании этих данных мы предположили, что искажения структуры нуклеосомы, вызванные отсутствием вспомогательных субъединиц комплекса NuB4, ухудшают связывание белка Rad9 с хроматином, что и приводит к супрессии hsm3-, hif1- и him1-специфического мутагенеза. Роль комплекса INO80 в этом процессе, по-видимому, состоит в организации архитектуры хроматина, которая способствует эффективному связыванию Rad9 с хроматином.

Действие факторов ремоделирования завершает репарацию хроматина. Наши результаты показывают, что комплекс INO80 играет важную роль в этом процессе. Отсутствие белка Nhp10, входящего в состав модуля, отвечающего за связывание с ДНК, по-видимому, инактивирует основную функцию комплекса INO80 и приводит к снижению эффективности систем репарации. Инактивация другой субъединицы этого модуля, Ies5, не приводит к заметным изменениям фенотипа клетки. Однако у двойных мутантов, несущих некорректно собранные нуклеосомы и мутации nhp10Δ или ies5Δ, мы наблюдали большие изменения в функционировании пострепликативной репарации, выразившиеся в появлении гиперчувствительности к летальному действию УФ-облучения и подавлению мутаторного фенотипа.

Работа выполнена при финансовой поддержке “Курчатовского геномного центра – ПИЯФ” программой развития центров генетических исследований мирового уровня, соглашение № 075-15-2019-1663.

Настоящая статья не содержит каких-либо исследований с использованием в качестве объекта животных.

Настоящая статья не содержит каких-либо исследований с участием в качестве объекта людей.

Авторы заявляют, что у них нет конфликта интересов.

Sobre autores

T. Evstyukhina

Petersburg Nuclear Physics Institute Named by B.P. Konstantinov of National Research Centre “Kurchatov Institute”; Kurchatov Genome Center—Petersburg Nuclear Physics Institute

Autor responsável pela correspondência
Email: alekseeva_ea@pnpi.nrcki.ru
Rússia, 188300, Gatchina; 188300, Gatchina

E. Alekseeva

Petersburg Nuclear Physics Institute Named by B.P. Konstantinov of National Research Centre “Kurchatov Institute”; Kurchatov Genome Center—Petersburg Nuclear Physics Institute

Email: alekseeva_ea@pnpi.nrcki.ru
Rússia, 188300, Gatchina; 188300, Gatchina

I. Skobeleva

Petersburg Nuclear Physics Institute Named by B.P. Konstantinov of National Research Centre “Kurchatov Institute”

Email: alekseeva_ea@pnpi.nrcki.ru
Rússia, 188300, Gatchina

V. Peshekhonov

Petersburg Nuclear Physics Institute Named by B.P. Konstantinov of National Research Centre “Kurchatov Institute”; Kurchatov Genome Center—Petersburg Nuclear Physics Institute

Email: alekseeva_ea@pnpi.nrcki.ru
Rússia, 188300, Gatchina; 188300, Gatchina

V. Korolev

Petersburg Nuclear Physics Institute Named by B.P. Konstantinov of National Research Centre “Kurchatov Institute”; Kurchatov Genome Center—Petersburg Nuclear Physics Institute

Email: alekseeva_ea@pnpi.nrcki.ru
Rússia, 188300, Gatchina; 188300, Gatchina

Bibliografia

Arquivos suplementares