Накопление пролина, флавоноидов и органических кислот в листьях кресс-салата в условиях солещелочного стресса

Толық мәтін

Введение

Солевой стресс и механизмы толерантности растений к засолению в настоящее время остаются в центре внимания исследователей [1, 2, 3]. В природных условиях засоление может сопровождаться щелочной реакцией почвенной среды. Солевой и щелочной стрессы рассматриваются как разные типы стресса; одновременно отмечают, что щелочные соли (Na₂CO₃ + NaHCO₃) оказывают более негативное влияние на культурные растения, по сравнению с нейтральными солями (Na₂SO₄ + NaCl). При щелочном засолении нарушается проницаемость мембран, накапливаются активные формы кислорода, снижаются фотосинтетические показатели, замедляется рост листьев и корней. В основе адаптации к щелочному засолению находятся антиоксидантная и осмопротекторная защиты, а также активизация процессов рН-регуляции растений [4–8].

Устойчивость растений как к засолению, так и к высоким значениям рН связана с накоплением в растениях низкомолекулярных органических соединений, в том числе пролина, флавоноидов и органических кислот. Пролин проявляет антиоксидантную активность [2, 9], участвует в рН-регуляции [10, 11], а также в осморегуляции цитоплазмы растений при солевом [1] и щелочном стрессе [8, 12]. Флавоноиды стабилизируют мембраны при окислительном стрессе, являются антиоксидантами [13–15]. Органические кислоты восстанавливают осмотический баланс растительной клетки в условиях засоления [16, 17]. При воздействии щелочных солей органические кислоты в растениях накапливались в связи с необходимостью рН-гомеостаза [4, 6, 18].

В условиях щелочного засоления отмечали определенную трудность в отделении эффекта засоления от воздействия высоких рН на растения [19, 20]. При выстраивании картины устойчивости растений при воздействии нескольких факторов внешней среды используются статистические методы [7, 19, 21]; так, применение двухфакторного дисперсионного анализа позволило сопоставить влияние видовой принадлежности, микроклиматических условий и их взаимодействия на параметры структуры листа растений [22].

Цель наших исследований – в условиях комбинированного (солещелочного) стресса изучить влияние NaCl-засоления, щелочности и взаимного их действия на накопление пролина, флавоноидов и органических кислот в листьях кресс-салата Lepidium sativum L.

Материалы и методы

Объект и условия выращивания. Исследования проводили на растениях кресс-салата (Lepidium sativum L.) сорта Весенний в двухфакторном опыте с комбинированным воздействием NaCl-засоления (50, 100, 150, 200 мМ) и боратного буфера (при pH = 7–10) (табл. 1). Реакцию среды у растворов контролировали на приборе Экотест-120 (“ЭКОНИКС”, Россия).

 

Таблица 1. Схема двухфакторного эксперимента (варианты опыта)

NaCl 0 мМ + рН = 7	NaCl 0 мМ + pH = 8	NaCl 0 мМ + pH = 9	NaCl 0 мМ + pH = 10
NaCl 50 мМ + рН = 7	NaCl 50 мМ + рН = 8	NaCl 50 мМ + рН = 9	NaCl 50 мМ + рН = 10
NaCl 100 мМ + рН = 7	NaCl 100 мМ + рН = 8	NaCl 100 мМ + рН = 9	NaCl 100 мМ + рН = 10
NaCl 150 мМ + рН = 7	NaCl 150 мМ + рН = 8	NaCl 150 мМ + рН = 9	NaCl 150 мМ + рН = 10
NaCl 200 мМ + рН = 7	NaCl 200мМ + рН = 8	NaCl 200 мМ + рН = 9	NaCl 200 мМ + рН = 10

 

Сухие семена кресс-салата (2 г) высаживали в умеренно увлажненный вермикулит в контейнеры размером 16×12×7 см. Растения выращивали в течение 6 дней, на 7 день в корневую среду вносили растворы с определенной концентрацией соли и разной реакцией среды (pH).

Определение морфофизиологических и биохимических параметров. Высоту и сырую массу надземной части кресс-салата исследовали через 24 и 48 ч после стресс-воздействия в 25-кратной повторности. Для определения количества воды в листьях через 24 и 48 ч после стресс-воздействия в каждом варианте опыта отбирали листья десяти растений кресс-салата в 5-кратной повторности. После их высушивания при температуре 60°С (до постоянного веса) по потере воды вычислили относительное содержание воды (в %).

Для изучения содержания натрия, пролина, флавоноидов и органических кислот через 1, 4 и 24 ч после стресс-воздействия проводили сбор листьев. Листья растений фиксировали при температуре 95^оС в течение 20 мин и досушивали при 60^оС.

Содержание Na⁺ измеряли в водном экстракте листьев методом пламенной фотометрии (ФПА-2 “Загорский оптико-механический завод”, Россия) [23]. Количество пролина установили методом Bates с соавт. [24]. Флавоноиды извлекали 70% раствором этанола; суммарное содержание продуктов взаимодействия с 5% хлоридом алюминия в 95% спирте установили методом спектрофотометрии при длине волны 425 нм (СФ-2000 “ОКБ Спектр”, Россия) [25].

Органические кислоты (лимонную, яблочную и янтарную) измеряли в водном экстракте листьев растений методом обращено-фазной высокоэффективной жидкостной хроматографии с ультрафиолетовой детекцией при длине волны 263 нм (Ultimate 3000 “Dionex”, США). Тип колонки: “Polar Advantage II C18” (“Thermo Fisher Scientific”, США) 2.1×150 мм, 3 мкм, 120 Ǻ. Подвижная фаза: элюент А – фосфатный буфер рН = 2.5, 20 мМ, элюент Б – ацетонитрил ОСЧ сорт 0, скорость потока 0.19 мл/мин, режим элюирования градиентный: 0–3.0 мин элюент Б 5%; 3.0–3.5 мин элюент Б до 10%; 3.5–6.5 мин элюент Б 10%; 6.5–7.5 мин элюент Б до 25%; 7.5–10 мин элюент Б 25%; 10– 2 мин элюент Б до 5%. Объем ввода пробы 20 мкл [26].

Все биохимические определения проведены в трехкратной биологической и двукратной аналитической повторности.

Математическая обработка данных. Математическую обработку данных проводили с помощью статистической диалоговой системы STADIA 8.0. Распределение данных по высоте и массе кресс-салата не отличались от нормального распределения (уровень значимости Р = 0.06–0.87), тестировали по критериям Колмогорова и омега-квадрат. Значимость различий между средними значениями контроля и опыта по измеренным показателям оценивали с использованием двухфакторного дисперсионного анализа с повторными измерениями по критерию Фишера и наименьшей существенной разнице (НСР₀₅). Сила влияния факторов определена по Снедекору, при Р < 0.05.

Результаты

Высота и масса растений

Через 24 ч после стресс-воздействия наблюдали значимое снижение высоты кресс-салата в варианте с отдельным воздействием щелочности (рН = 8) и при комбинированном воздействии факторов стресса, особенно при максимальном засолении (табл. 2). Во второй период наблюдений (48 ч) высота растений в условиях солещелочного стресса не отличалась от высоты растений в контрольном варианте опыта (NaCl 0 мМ + + рН = 7), значимое уменьшение высоты наблюдали лишь в варианте NaCl 200 мМ + pH = 8.

 

Таблица 2. Изменение высоты и сырой массы надземной части кресс-салата, содержание воды в листьях при соле-щелочном стрессе

Период наблю-дений, ч	pH	Высота, мм					Масса, мг					Содержание воды, %
		NaCl, мМ
		0	50	100	150	200	0	50	100	150	200	0	50	100	150	200
24	7	27	27	27	25	23	11.1	12.0	12.5	11.5	12.2	90.1	90.2	90.1	89.7	88.4
	8	24	27	27	25	24	9.6	8.9	9.5	8.8	8.2	89.8	85.2	87.2	86.4	85.8
	9	26	24	26	23	24	9.3	9.1	10.5	9.1	9.7	87.6	86.9	88.3	87.8	87.5
	10	25	26	23	25	24	9.5	12.1	9.0	10.6	10.0	87.6	86.2	87.8	87.5	87.7
	НСР05 = 2.4						НСР05 = 2.6					НСР05 = 1.63
48	7	27	29	29	29	29	10.7	11.0	12.3	12.3	11.4	89.4	90.4	90.1	88.6	87.0
	8	26	29	28	25	23	7.1	7.8	10.0	10.6	9.1	83.3	82.6	85.3	85.1	81.6
	9	26	25	27	25	25	10.2	10.1	10.5	8.7	10.2	87.1	87.6	86.6	85.0	85.1
	10	29	27	27	29	29	7.3	8.2	9.4	11.0	10.4	82.0	82.4	85.3	86.2	84.3
	НСР05 = 2						НСР05 = 1.4					НСР05 = 1.96

Примечание: НСР₀₅ – наименьшая существенная разность при Р < 0.05.

 

По результатам двухфакторного дисперсионного анализа в первый период наблюдений влияние факторов солещелочного стресса на высоту кресс-салата было небольшим, показатели отдельного влияния засоления, а также взаимного действия факторов составили по 6–7%. Через 48 ч влияние высоких значений рН и взаимного действия на высоту кресс-салата осталось низким – 4% (рис. 1).

 

Рис. 1. Результаты двухфакторного дисперсионного анализа высоты, массы и содержания воды в растениях кресс-салата в зависимости от 1 – NaCl-засоления (NaCl), 2 – щелочности (рН) и 3 – взаимного действия этих факторов (NaCl + рН) в условиях солещелочного стресса; влияние факторов значимо: * – при уровне P ≤ 0.015; ** – P ≤ 0.001; *** –P ≤ 0.0001.

 

Значимое снижение массы надземной части кресс-салата через 24 ч после стресс-воздействия наблюдали лишь в одном варианте опыта (NaCl 200 мМ + рН = 8) относительно растений в контроле (табл. 2). Через 48 ч после стресс-воздействия уменьшение массы растений было отмечено в шести вариантах опыта как при отдельном действии факторов засоления и высоких значений рН, так и при их комбинированном воздействии. Двухфакторный дисперсионный анализ показал, что в первый период наблюдений небольшое влияние на массу растений оказывал фактор высоких значений рН (4%). Во второй период наблюдений показатели отдельного влияния NaCl-засоления, высоких значений рН и их взаимного действия на массу кресс-салата составили 6–7% (рис. 1).

Содержание воды

Через 24 ч развития солещелочного стресса пониженное содержание воды в листьях кресс-салата наблюдали в большинстве вариантах опыта, по сравнению с контролем (табл. 2). Через 48 ч после стресс-воздействия потери воды в листьях кресс-салата увеличились.

В первый период наблюдений на содержание воды почти в равной степени воздействовал фактор засоления (показатель влияния 17%) и взаимное действие факторов (15%). Во второй период наблюдений при некотором снижении влияния засоления и взаимного действия факторов на количество воды существенно усилилось отдельное воздействие высоких значений рН – до 31%. Суммарное влияние стресс-факторов на изменение количества воды в кресс-салате усиливалось с 35% в первый период наблюдений и до 53% – во второй период наблюдений (рис. 1).

Содержание Na⁺

В условиях соле-щелочного стресса отмечали тенденцию к накоплению Na⁺ в листьях кресс-салата (табл. 3). Через 1 ч после стресс-воздействия повышенное количество Na⁺ наблюдали в шести вариантах опыта при комбинировании засоления и высоких значений рН; при этом в варианте NaCl 200 мМ + pH = 10 содержание Na⁺ было вдвое выше, чем на контроле. Во второй период наблюдений (4 ч) содержание Na⁺ увеличилось, особенно, в вариантах NaCl 150, 200 мМ при всех уровнях рН. Через сутки после стресс-воздействия аккумуляция Na⁺ в кресс-салате еще усилилась, в вариантах 150 и 200 мМ NaCl при всех значениях рН его количество было в 7–15 раз выше, чем у растений в контрольном варианте опыта.

 

Таблица 3. Изменение содержания Na⁺ и пролина в листьях кресс-салата при солещелочном стрессе, мг/100 г сухой массы

Период наблюдений, ч	pH	Na+					Пролин
		NaCl, мМ
		0	50	100	150	200	0	50	100	150	200
1	7	105	92	113	146	96	222	607	1254	502	722
	8	122	151	176	117	126	375	689	313	260	790
	9	138	176	147	117	185	571	574	703	453	626
	10	117	105	206	169	219	612	676	270	726	547
	НСР05 = 52						НСР05 = 108
4	7	143	181	147	176	245	186	478	1126	397	475
	8	159	193	227	211	236	183	785	206	654	516
	9	126	172	176	257	270	277	486	329	835	204
	10	126	113	168	219	253	428	379	859	507	558
	НСР05 = 46						НСР05 = 113
24	7	150	383	453	1066	1816	330	281	311	488	1105
	8	164	176	654	1961	2234	335	624	638	641	957
	9	194	253	453	1724	2139	329	656	619	1084	836
	10	182	677	515	1316	1888	380	547	559	1349	1124
	НСР05 = 69						НСР05 = 148

Примечание: НСР₀₅ – наименьшая существенная разность при Р < 0.05.

 

В первый период наблюдений на содержание Na⁺ в листьях кресс-салата влияли засоление и высокие значения рН, при этом показатель засоления был выше (рис. 2). Через 4 ч после стресс-воздействия заметно усилилось воздействие высоких значений рН. В третий период наблюдений изменение содержания Na⁺ в равной степени зависело как от отдельных факторов стресса, так и от взаимного их действия. Суммарное влияние факторов возрастало от 42% через 1 ч, до 60% – через 4 ч и до 97% – через 24 ч развития солещелочного стресса.

 

Рис. 2. Результаты двухфакторного дисперсионного анализа содержания Na⁺ и пролина в растениях кресс-салата в зависимости от 1 – NaCl-засоления (NaCl), 2 – щелочности (рН) и 3 – взаимного действия этих факторов (NaCl + рН) в условиях соле-щелочного стресса; влияние факторов значимо: * – при уровне P ≤ 0.015; *** – P ≤ 0.0001.

 

Содержание пролина

В условиях солещелочного стресса в кресс-салате наблюдали аккумуляцию пролина почти во всех вариантах опыта по сравнению с контролем (табл. 3). В первые часы наблюдений наибольшее количество пролина было в варианте NaCl 100 мМ + pH = 7, контрольный уровень превышен в 5–6 раз. Через сутки после стресс-воздействия максимальное содержание пролина отмечали в вариантах NaCl 150, 200 мМ + рН = 10, где его количество в 3.5–4 раза выше, чем в контрольных растениях.

Накопление пролина в наибольшей степени зависело от засоления и взаимного действия факторов стресса, показатели влияния находились в пределах 26–33%. Воздействие высоких значений рН на содержание пролина несколько ниже, при этом показатели влияния возрастали с 9–10% – в первые часы наблюдений и до 21% – через сутки. Суммарное действие стресс-факторов на содержание пролина за период наблюдений увеличилось от 69 до 83% (рис. 2).

Содержание флавоноидов

Через 1 ч после стресс-воздействия, как правило, наблюдали накопление флавоноидов в листьях кресс-салата; лишь в варианте pH = 8 без засоления количество флавоноидов не отличалось от контрольного уровня (табл. 4). Самая высокая аккумуляция флавоноидов (больше контроля на 53%) была в варианте с наибольшим засолением (NaCl 200 мМ + pH = 7). В последующий период наблюдений содержание флавоноидов было ниже или не отличалось от их содержания в контрольных растениях.

 

Таблица 4. Изменение содержания флавоноидов и органических кислот (лимонной, яблочной и янтарной) в листьях кресс-салата при соле-щелочном стрессе

Период наблюдений, ч	pH	Флавоноиды, мг/100 г сухой массы					Сумма органических кислот, мг/10 г сухой массы
		NaCl, мМ
		0	50	100	150	200	0	50	100	150	200
1	7	297	374	381	329	455	335	380	492	521	419
	8	292	384	424	393	416	375	403	511	506	509
	9	352	381	430	438	350	382	434	438	482	454
	10	378	443	423	451	414	404	494	450	508	468
	НСР05 = 55						НСР05 = 18
4	7	360	399	332	352	318	446	543	557	469	458
	8	347	305	375	277	331	460	583	592	518	502
	9	344	392	339	339	283	499	549	569	517	503
	10	356	340	366	323	290	620	579	496	471	536
	НСР05 = 41						НСР05 = 26
24	7	323	277	245	178	224	463	561	577	651	437
	8	253	285	251	249	216	496	654	619	596	457
	9	259	334	184	285	246	509	645	683	567	628
	10	310	338	267	288	231	637	575	656	581	631
	НСР05 = 78						НСР05 = 28

Примечание: НСР₀₅ – наименьшая существенная разность при Р < 0.05.

 

Через 1 ч после стресс-воздействия суммарное влияние показателей стресса на содержание флавоноидов составляло 32%, а наибольшим было воздействие высоких значений рН (рис. 3). В последующий период наблюдений на фоне отсутствия аккумуляции флавоноидов показатели суммарного влияния факторов стресса снизились во второй и третий период наблюдений до 9 и 15% соответственно.

 

Рис. 3. Результаты двухфакторного дисперсионного анализа содержания флавоноидов и суммы органических кислот (лимонной, яблочной и янтарной) в растениях кресс-салата в зависимости от 1 – NaCl-засоления (NaCl), 2 – щелочности (рН) и 3 – взаимного действия этих факторов (NaCl + рН) в условиях соле-щелочного стресса; влияние факторов значимо: ** – P ≤ 0.001; *** – P ≤ 0.0001.

 

Содержание органических кислот

В условиях развития солещелочного стресса установлено увеличение содержания лимонной, яблочной и янтарной кислот в листьях кресс-салата (табл. 4). Через 1 ч после стресс-воздействия наибольшее накопление органических кислот наблюдали в варианте опыта с NaCl 150 мМ + pH = 7, через 4 ч – в варианте pH = 10 без засоления, а через 24 ч – в варианте NaCl 100 мМ + pH = 9 (выше контроля на 55%).

Влияние факторов солещелочного стресса на содержание органических кислот в кресс-салате было максимально высоким, сумма показателей влияния достигала 80–97% (рис. 3). Одинаково высоким было отдельное действие засоления и взаимное действие факторов стресса, их показатели влияния достигали 31–33%. В первые часы наблюдений на аккумуляцию органических кислот в меньшей степени воздействовали высокие значения рН (17–25%), но через сутки развития солещелочного стресса показатель влияния рН увеличился до 31%.

Обсуждение

В течение 24–48 ч развития солещелочного стресса влияние факторов на изменение морфологических показателей кресс-салата было минимальным (показатели влияния на высоту и массу в пределах 4–7%); по-видимому, негативное воздействие щелочного засоления не успело реализоваться за этот период наблюдений.

Прослежено отрицательное влияние засоления на содержание воды в кресс-салате, что соответствует информации о нарушении осморегуляции и уменьшении доступности воды растениям на первой стадии развития солевого стресса [2, 27]. Через 48 ч после стресс-воздействия снижение содержания воды в растении в большей степени зависело от высоких значений рН. Щелочная среда нарушает строение и функции клеточных мембран, по А.А. Захарину и Л.А. Паничкину [28] при избытке ионов гидроксила снижалась проницаемость воды для клеток корня. При этом обезвоживание клеток корня происходило в 2 раза сильнее, чем под воздействием раствора NaCl той же концентрации.

При развитии солещелочного стресса аккумуляция Na⁺ в кресс-салате в значительной степени определялась фактором засоления. Известно, что ионный гомеостаз в растениях при засолении поддерживается с помощью активного транспорта Na⁺, в том числе при участии белков – антипортеров [3]. Концентрация засоляющих ионов в цитозоле гликофитов до определенного уровня не считается проблематичной [20]. Их накопление в условиях засоления позволяет растению поглощать воду даже при снижении интенсивности транспирации [29].

В нашем эксперименте на количество Na⁺ в кресс-салате в значительной степени воздействовали высокие значения рН. Воздействие щелочных растворов на растение приводит к изменению градиента трансмембранного электрохимического потенциала и нарушению транспорта ионов [4, 6, 30]. Через 24 ч после стресс-воздействия в изменение содержания Na⁺ не меньший вклад вносило взаимное действие факторов соле-щелочного стресса, т.к. нарушение состояния мембран под влиянием высоких значений рН может привести к бесконтрольному поступлению Na⁺ в растения [17, 19, 30].

Ответной реакцией растений на дефицит воды является аккумуляция низкомолекулярных соединений в клетке [2, 27, 31]. В нашем эксперименте увеличение содержания пролина под влиянием NaCl-засоления соотносится с данными по накоплению пролина в листьях культурных растений в условиях солевого стресса [6, 7, 32]. Количество пролина в листьях кресс-салата в определенной степени зависело и от высоких значений рН корневой среды, что может быть обусловлено участием пролина в рН-регуляции цитоплазмы растений [10, 11].

С избыточным накоплением Na⁺ связывают окислительный стресс растений [3]. Пролин поддерживает окислительно-восстановительный баланс за счет участия в нейтрализации активных форм кислорода [9, 34]. При щелочном стрессе аккумуляция пролина в проростках пшеницы обеспечивала защиту от окислительного повреждения [12]. Возможно, взаимное действие факторов солещелочного стресса на содержание пролина в кресс-салате обусловлено его антиоксидантной активностью.

Аккумуляцию флавоноидов в растениях связывают с их способностью к антиоксидантной активности и стабилизации мембран при окислительном стрессе [15]. Отмечали высокую антиоксидантную активность флавоноидов, во многом превосходящую активность других антиоксидантов (аскорбиновой кислоты и α-токоферола) [14]. Вероятно, через 1 ч после стресс-воздействия накопление флавоноидов в кресс-салате под влиянием факторов солещелочного стресса было направлено на защиту от окислительного повреждения. В последующем в антиоксидантную защиту включались другие участники, и количество флавоноидов в листьях кресс-салата уменьшалось. Общая активность радикальных окислительных процессов, жизненно важных для поддержания гомеостаза клеток высших растений, поддерживается разными представителями антиоксидантной системы [35].

Органические кислоты участвуют в рН-гомеостазе, осмотической регуляции и балансе избытка катионов [4, 18]. С этим связано высокое отдельное и взаимное влияние засоления и высоких значений рН на накопление яблочной, лимонной и янтарной кислот в кресс-салате в условиях солещелочного стресса. Органические кислоты восстанавливали водный баланс растительных клеток при засолении [5, 6, 16]. Ответом на действие щелочных солей было накопление органических кислот (щавелевая, лимонная, яблочная, муравьиная, этиловая, янтарная), как в побегах, так и в корнях растений [5, 19].

Наши исследования показали, что в первые часы развития солещелочного стресса в кресс-салате наибольшие изменения произошли в метаболизме органических кислот. Общее накопление лимонной, яблочной и янтарной кислот в равной степени связано с отдельным и взаимным действием NaCl-засоления и высоких значений рН, что указывает на их осмо- и рН-регулирующее значение. Аккумуляция пролина в первые часы наблюдений зависела преимущественно от засоления и взаимного действия факторов, влияние высоких значений рН было наименьшим. По-видимому, в условиях солещелочного стресса основная роль пролина направлена на осморегуляцию и защиту от окислительного повреждения. Участие флавоноидов в адаптационных процессах наблюдали лишь в первый час после стресс-воздействия, возможно, их накопление в это время направлено на защиту мембран от свободно-радикального повреждения.

Настоящая статья не содержит каких-либо исследований с участием людей и животных в качестве объектов.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Авторлар туралы

А. Чернышева

Пермский государственный национальный исследовательский университет

Хат алмасуға жауапты Автор.
Email: nast483@bk.ru
Ресей, Пермь

О. Еремченко

Пермский государственный национальный исследовательский университет

Email: nast483@bk.ru
Ресей, Пермь

К. Боталова

Пермский государственный национальный исследовательский университет

Email: nast483@bk.ru
Ресей, Пермь

Әдебиет тізімі

Қосымша файлдар