Определение полифенольного комплекса в Reynoutria japonica Houtt. методом тандемной масс-спектрометрии

Полный текст

Введение

Лекарственное растение рейнутрия японская (Reynoutria japonica Houtt., Polygonum cuspidatum Siebold & Zucc.) принадлежит к семейству Polygonaceae. Это многолетнее растение высотой 1–3 м, широко распространенное на Дальнем Востоке России, в Южной Корее, Японии, Китае, Северной Америке и Европе [1]. R. japonica представляет собой богатый источник функциональных метаболитов, ее нежный стебель используется в повседневных продуктах питания [2], а корни – в качестве красителя для риса. Кроме того, корень этого растения традиционно используется в качестве лекарственного средства при лечении воспалений, инфекций, желтухи, ожогов кожи, хронического бронхита и гиперлипидемических заболеваний [3]. Из R. japonica было выделено большое количество вторичных метаболитов, включая хиноны, стильбены, флавоноиды, кумарины и другие полифенольные соединения. Известно, что эти функционально важные фитохимические вещества обладают противовоспалительной, противораковой, противовирусной и антибактериальной активностью [3, 4].

Нафтохиноны – это вторичные метаболиты, обнаруженные в растениях и обладающие множеством интересных биологических свойств. Многие из 1,4-нафтохинонов, особенно 5-гидрокси-1,4-нафтохинон (юглон) и его производные, проявляют мощную биологическую активность, включая антибактериальную, противогрибковую и противовирусную, антиагрегантное, противодиабетическое, противоопухолевое и цитотоксическое действие [4]. Известно, что 1,4-нафтохиноны природного происхождения или близкородственные химические вещества используются в качестве антибиотиков или химиотерапевтических средств. В работе Khalil с соавт. [5] сообщалось о химической структуре и активности против Helicobacter pylori пяти антрахинонов, двух стильбенов и производного 1,4-нафтохинона из корневой части R. japonica. Среди изолятов юглон, 2-метокси-6-ацетил-7-метилюглон, проявлял выраженную антибактериальную активность как природное соединение. Ингибирующая активность была самой высокой среди известных производных юглона [6].

Цель работы – одновременная оценка присутствия как фенольных соединений в экстрактах листьев и стеблей R. japonica, так и соединений других химических классов. Начальный метаболомный анализ показал наличие 30 биоактивных соединений, обнаруженных в представленных экстрактах R. japonica. Метаболомный анализ был осуществлен методом многомерной тандемной масс-спектрометрии для 6 экстрактов стеблей и листьев R. japonica.

Материалы и методы

Объект исследования. В качестве объекта исследований использовались шесть образцов Reynoutria japonica Houtt., представленных в коллекции Федерального научного центра агробиотехнологий Дальнего Востока им. А.К. Чайки. Все образцы собраны в июне-июле 2023 г. Образцы хранились в морозильной камере при температуре –15°С не более 1 недели до начала экспериментов. Все образцы соответствовали морфологическим стандартам Фармакопеи Евразийского экономического союза [7].

Дробная мацерация. Для получения высококонцентрированных экстрактов применяли метод фракционной мацерации. Для мацерации случайным образом отбирали около 200 г отдельно листьев и отдельно стеблей R. japonica. Общее количество экстрагента (этилового спирта х.ч., 96%) делили на три равные части и последовательно настаивали листья и стебли растения первой, второй и третьей частями. Соотношение твердого вещества и растворителя составляло 1 : 15. Настаивание каждой части экстрагента проводили в течение 7 дней при комнатной температуре.

Высокоэффективная жидкостная хроматография. Для выполнения разделения многокомпонентных смесей использовался жидкостный хроматограф высокого давления Shimadzu LC-20 Prominence HPLC (Shimadzu, Япония), оборудованный UV-детектором и обращенно-фазовой колонкой Shodex ODP-40 4E (250 × 4.6, размер частиц 4 мкм). Элюировали в градиенте от воды к ацетонитрилу (А): 0–4 мин – 0% А; 4–60 мин – 25% А; 60–75 мин – 100% А; 75–120 мин – 100% А, скорость потока составляла 0.5 мл/мин. ВЭЖХ-анализ проведен при помощи UV-VIS-детектора SPD-20A (Kanda-Nishikicho 1-chrome, Shimadzu, Chiyoda-ku, Tokyo, Япония) при длинах волн 230 нм и 330 нм, температура 50°С. Объем загрузочной петли составлял 200 мкл.

Тандемная масс-спектрометрия. Масс-спектрометрические данные получены с помощью ионной ловушки amaZon SL (Bruker Daltoniks, Германия), оснащенной источником ионизации электрораспылением в режимах отрицательных и положительных ионов. Оптимизированные параметры получены следующим образом: температура источника ионизации – 70°С, поток газа – 4 л/мин, газ-небилайзер (распылитель) – 7.3 psi, капиллярное напряжение – 4500 В, напряжение на изгибе торцевой пластины – 1500 В, фрагментатор – 280 В, энергия столкновения – 60 eВ. Масс-спектрометр использовался в диапазоне сканирования m/z 100 – 1.700 для MС и МС/МС. Произведена фрагментация 4 порядка. Идентификация химических компонентов проводилась путем сравнения их индекса удерживания, масс-спектров и фрагментации МС с базой данных домашней библиотеки, созданной Группой биотехнологий, биоинженерии и пищевых систем “Передовые инженерные школы” Дальневосточного федерального университета (Россия) на основе данных других спектроскопических методов, таких как ядерный магнитный резонанс, ультрафиолетовая спектроскопия и МС, а также сравнения полученных экспериментальных данных с известными научными результатами, опубликованными в открытой научной литературе, которые постоянно обновляются и пересматриваются.

Результаты и их обсуждение

Уточнение состава вторичных метаболитов является чрезвычайно важной задачей в общей системе биохимического анализа. В данной работе был использован метод ВЭЖХ-MС/MС с электрораспылительной ионизацией и анализом фрагментированных ионов. Ниже представлен график, показывающий распределение плотности выхода биологически активных веществ при тандемной масс-спектрометрии анализируемых целевых аналитов экстракта R. japonica (рис. 1). Всего на ионных хроматограммах было обнаружено 300 пиков выделенных целевых аналитов. Для простоты идентификации составлена унифицированная таблица молекулярных масс целевых аналитов, выделенных из экстрактов отдельно листьев и отдельно стеблей R. japonica (табл. 1). При масс-спектрометрическом анализе было предварительно идентифицировано 18 соединений полифенольной группы и 13 соединений других химических групп. Полифенольные соединения, представленные в табл. 1, охватывают практически все классы полифенолов: флавоны, флаванолы, антоцианиновая группа, гидроксибензойные и гидроксикоричные кислоты, халконы, кумарины, лигнаны и т.д.

 

Таблица 1. Унифицированная системная таблица целевых соединений, выделенных из экстрактов листьев и стеблей Reynoutria japonica

№	Класс соединений	Соединение	Химическая формула	Мол. м., Д	tR	Ион-аддукт		Фрагментация			Источники
						[M+H]+	[M-H]–	МС/МС 1 порядка	МС/МС 2 порядка	МС/МС 3 порядка
Полифенольные соединения
1	Флавоны	Формононетин	C16H12O4	268.26	7.1		269.29	213.22	196.21	167.13	Huolisu Oral Liquid [10]; Chinese herbal formula Jian-Pi-Yi-Shen pill [11]
2	Флавоны	Гарденин Б	C19H18O7	358.34	42.4		359.27	326.14	298.17	283.14	Mentha [17]; Ocimum [18]
3	Флавонолы	Кверцетин	C15H10O7	302.23	8.0		303.15	257.15	229.08	161.19	Propolis [13]
4	Флавонолы	Кверцитрин [Кверцетин-рамнозид]	C21H20O11	448.37	7.4	447.38		301.18	179.19; 271.17	151.18	Euphorbia hirta [12]; Propolis [13]
5	Флавонолы	Рамнозилгексозил-метилкверцетин	C26H28O17	612.49	49.0		613.68	595.6	521.59; 315.26; 185.15	503.54; 393.47; 173.14	Phoenix dactylifera [19]
6	Флаваноны	Пиносембрин	C15H12O4	256.25	42.1		257.1	210.22	182.14		Propolis [13]; Punica granatum [20]
7	Флаваноны	Аромадендрин [Дигидрокемпферол]	C15H12O6	288.25	35.2		289.17	271.15	243.17	185.15	Phoenix dactylifera [19]; Juglans mandshurica [16]; F. glaucescens [21]
8	Флаваноны	Пиностромбин	C16H14O4	270.28	40.3		271.16	229.13	201.15	173.13	Propolis [13]; Jatropha gossypifolia [22]
9	Метилированные флавоноиды	Артеметин	C20H20O8	388.36	39.6		389.27	356.21	341.16	312.03	Pubchem
10	Флавоноид	Полигалин А	C23H24O11	476.43	42.5		477.42	458.36; 335.32; 155.15	413.87; 261.32	261.21; 163.17	Polygala japonica [23]; P. sibirica [24]
11	Антоцианины	Дельфинидин	C15H11O7	303.24	25.1		303.18	257.14; 165.14	229.16	201.13; 145.14	A. cordifolia [21]
12	Гидроксикоричная кислота	Кофейная кислота	C9H8O4	180.15	31.9		181.18	163.2	145.25	117.2	Vaccinium myrtillus [8]
13	Гидроксикоричная кислота	3,4-дигидрокси-коричная кислота	C9H10O4	182.17	31.5		183.1	153.23	127.15	114.33	Eucalyptus Globulus [25]; Chilean currants [9]
14	Гидроксибензойная кислота	Эллаговая кислота	C14H6O8	302.19	8.0		303.15	257.15	229.08	161.19	Euphorbia hirta [12]; Punica granatum [20]
15	Гидроксикоричная кислота	Хлорогеновая кислота	C16H18O9	354.31	19.7		355.11	163.13	145.16	117.13	Vaccinium myrtillus [8]; Ribes magellanicum [9]
16	Дигидрохалкон	Аспалатин	C21H24O11	452.41	25.1		453.48	435.44; 336.35; 227.28	336.34; 226.30	209.28	Malus toringoides [26]; Aspalathus linearis [27]
17	Кумарины	Умбеллиферон	C9H6O3	162.14	8.8		163.17	145.15	117.11		F. glaucescens [21]; Actinidia [28]; Zostera marina [29]
18	Лигнан	Сирингарезинол	C22H26O8	418.44	8.4		419.25	326.08; 401.24; 165.11	298.11	252.10; 154.21	Magnolia [30]; Lignans [31]
Соединения других химических групп
19	Аминокислоты	L-Глутаминовая кислота	C5H7NO4	145.11	7.6		146.1	127.19			Soybean leaves [32]; Lonicera japonica [33]
20	Аминокислоты	Теанин	C7H14N2O3	174.19	10.9		175.13	157.07			Camellia kucha [34]
21	Хромоны	Альтехромон А	C11H10O3	190.19	7.8		191.12	150.05			Chinese herbal formula Jian-Pi-Yi-Shen pill [11]
22	Омега-5 жирная кислота	Миристолеиновая кислота	C14H26O2	226.36	9.3		227.23	209.25	139.21	110.26	F. glaucescens [21]; Maackia amurensis [35]
23	Антрахинон	1,4,8-Тригидрокси-антрахинон	C14H8O5	256.21	41.2		257.1	210.18	181.93	181.14	Juglans mandshurica [16]
24	Антрахинон	Emodin [6-Methyl-1,3,8-trihydroxy-anthraquinone]	C15H10O5	270.24	40.3		271.16	229.13	201.15	173.13	Chinese herbal formula Jian-Pi-Yi-Shen pill [11]; R. japonica (Polygonum cuspidatum) [14]; Reynoutria [15]
25	Омега-3 жирная кислота	Линоленовая кислота	C18H30O2	278.42	37.8		279.25	219.16	159.09	178.67	Jatropha [22]; Soybean leaves [32]; Soybean [36]
26	Ненасыщенная жирная кислота	Оксо-эйкозатетраеновая кислота	C20H30O3	318.45	39.5		319.4	300.39; 119.30	282.35	264.25	F. potsii [21]
27	Полисахариды	Фруктозо-1,6-бисфосфат	C6H10O12P2	336.08	10.9		337.07	277.06	233.99		Soybean leaves [32]; Soybean [36]
28	Тритерпеноиды	Уваол	C30H50O2	442.72	36.0		443.7	425.36; 175.27	367.33; 174.72	117.2	F. herrerae [21]
29	Сесквитерпеновый алкалоид	Сеспендол	C33H45NO4	519.71	45.6		520.47	184.15; 502.48	125.13		Hylosereus polyrhizus [37]
30	Иридоиды	п-Кумарил монотропеин гексозид	C37H62O12	698.88	38.6		699.54	537.45; 347.20; 203.16	375.30; 259.10		Vaccinium myrtillus [38]
31	Продукт деградации хлорофилла	Феофитин A	C55H74N4O5	871.2	48.6		872.1	593.46	533.41	461.36	Physalis peruviana [39]

Примечание. t_R – время удерживания, t (мин).

 

Рис. 1. Распределение плотности выхода биологически активных веществ при тандемной масс-спектрометрии анализируемых целевых аналитов экстракта Reynoutria japonica.

 

На рис. 1 и 2 представлены распределение плотности выхода биологически активных веществ при тандемной масс-спектрометрии анализируемых целевых аналитов экстракта и распределенный график тандемной масс-спектрометрии анализируемых целевых аналитов экстракта R. japonica, представленный ионной хроматограммой. Впервые в экстрактах R. japonica обнаружены следующие полифенольные соединения: дигидрохалкон аспалатин, кумарин умбеллиферон, лигнан сирингарезинол, а также флавоны формононетин и гарденин Б.

 

Рис. 2. Масс-спектр хлорогеновой кислоты из экстракта листьев Reynoutria japonica. Вверху МС-скан в диапазоне 100–1700 m/z, внизу спектры фрагментации (сверху-вниз): МС2 протонированного иона хлорогеновой кислоты (355.11 m/z, красный ромб), МС3 фрагмента 355.11→163.13 m/z и МС4 фрагмента 355.19→163.13→145.16 m/z.

 

На рис. 2–5 представлены масс-спектры, полученные методом тандемной масс-спектрометрии, и расшифровка выделенных химических соединений из экстрактов R. japonica. Масс-спектр хлорогеновой кислоты из экстракта листьев R. japonica представлен на рис. 2. [M + H]⁺ ион-аддукт продуцирует один фрагментарный ион с m/z 163.13 (рис. 2). В свою очередь фрагментарный ион с m/z 163.13 продуцирует дочерний ион с m/z 145.16, который далее фрагментирует ион с m/z 117.13. Данное соединение идентифицировано, согласно полученной фрагментации, как хлорогеновая кислота, что подтверждается подобными фрагментациями указанного химического соединения в следующих растительных матрицах: Vaccinium myrtillus [8] и Ribes magellanicum [9].

Путь фрагментации молекулы хлорогеновой кислоты, выраженный в структурных формулах, представлен ниже на рис. 3. Данный путь фрагментации, представленный в структурных формулах, практически полностью совпадает с масс-спектром хлорогеновой кислоты, представленным на рис. 2. Масс-спектр флавона формононетина из экстракта стеблей R. japonica представлен на рис. 4. [M + H]⁺ ион продуцирует один фрагментарный ион при m/z 213.22 (рис. 4). Фрагментарный ион при m/z 213.22 порождает один дочерний ион при m/z 196.21. Фрагментарный ион при m/z 196.21 продуцирует один дочерний ион при m/z 167.13. Это соединение идентифицировано по подобным фрагментациям в Huolisu Oral Liquid [10], Chinese herbal formula Jian-Pi-Yi-Shen pill [11].

 

Рис. 3. Путь фрагментации молекулы хлорогеновой кислоты.

 

Рис. 4. Масс-спектр формононетина из экстракта стеблей Reynoutria japonica. Вверху МС-скан в диапазоне 100–1700 m/z, внизу спектры фрагментации (сверху-вниз): МС2 протонированного иона формононетина (269.29 m/z, красный ромб), МС3 фрагмента 269.29→213.22 m/z и МС4 фрагмента 269.29→213.22→196.21 m/z.

 

Масс-спектр флавонола кверцитрина из экстракта листьев R. japonica представлен на рис. 5. [M – H]^- ион продуцирует один фрагментарный ион при m/z 301.18 (рис. 5). Фрагментарный ион при m/z 301.18 порождает два дочерних иона при m/z 271.17 и m/z 179.19. В фрагментации четвертого порядка присутствует один дочерний ион с m/z 151.18. Это соединение предположительно идентифицировано как кверцитрин по похожей фрагментации данного химического соединения в Euphorbia hirta [12], Propolis [13].

 

Рис. 5. Масс-спектр кверцитрина из экстракта листьев Reynoutria japonica. Вверху МС-скан в диапазоне 100–1700 m/z, внизу спектры фрагментации (сверху-вниз): МС2 протонированного иона кверцитрина (447.38 m/z, красный ромб), МС3 фрагмента 447.38→301.18 m/z и МС4 фрагмента 447.38→301.18→179.19 m/z.

 

На рис. 6 представлена диаграмма Венна, которая обобщает масс-спектрометрические исследования, представленные выше в табл. 1, и наглядно показывает совпадения и расхождения в обнаруженных химических соединениях отдельно в листьях и стеблях R. japonica. На диаграмме Венна (рис. 6) показано, что присутствует большая степень схожести по химическим соединениям в листьях и стеблях R. japonica. Данные диаграммы Венна расшифрованы в табл. 2, представляющей присутствие тех или иных химических соединений в стеблях и листьях, или отдельно в стеблях и отдельно в листьях.

 

Рис. 6. Диаграмма Венна предварительно идентифицированных химических соединений Reynoutria japonica.

 

Таблица 2. Присутствие химических соединений в листьях и стеблях Reynoutria japonica

Исследуемые объекты	Химические соединения
Листья Стебли	Аспалатин; 3,4-дигидроксигидрокоричная кислота; Феофитин A; Миристоленовая кислота; Сеспендол; Линоленовая кислота; Кверцитрин; Фруктоза-1,6-бифосфат; L-теанин;
Листья	Уваол; Кофеиновая кислота; Дигидрокемпферол; 1,4,8-тригидроксиантрахинон; Полигалин А; Сирингарезинол; Оксо-эйкозатетраеновая кислота; Кверцетин; Дельфинидин; Умбеллиферон; Рамносилгексозил-метил-кверцитин; п-кумарил-монотропеин гексозид; Пиносембрин; Пиностромбин; Хлорогеновая кислота; Эллаговая кислота
Стебли	Альтехромон A; Артеметин; Формононетин; Гарденин Б

 

Из табл. 2 можно заключить, что 9 выявленных химических соединений встречаются как в экстрактах листьев, так и в экстрактах стеблей растений R. japonica. Это химические соединения: аспалатин, 3,4-дигидроксигидрокоричная кислота, феофитин A, миристоленовая кислота, сеспендол, линоленовая кислота, кверцитрин, фруктоза-1,6-бифосфат, L-теанин. 17 химических соединений, в основном это полифенольные соединения, встречаются только в экстрактах листьев растений и 4 химических соединения встречаются только в экстрактах стеблей растений. Предварительный масс-спектрометрический анализ показал, что листья R. japonica гораздо богаче по полифенольному составу, нежели стебли растения.

Антрахиноны эмодин, эмодин-8-О-глюкозид, а также емодин-8-О-(6’-О-малонил)-глюкозид ранее были обнаружены и идентифицированы у изученных видов R. japonica, R. sachalinensis, R. bohemica с помощью масс-спектрометрического анализа [14, 15] В данных соединениях наиболее распространены ионы-продукты при m/z 269 [M – H-162] (из-за потери глюкозильного фрагмента), что характерно для эмодина. Соединение 1,4,8-тригидрокси-антрахинон также было охарактеризовано впервые в данном исследовании (рис. 7). Здесь депротонированная молекула при m/z 256 [M + H]⁺ для соединения 23 показала наиболее распространенный ион-продукт при m/z 210 [M + H – 46]⁺ и ион-продукт при m/z 181 [M + H – 46 – 29]⁺, что соответствует характеру фрагментации 1,4,8 – тригидрокси-антрахинона, ранее выявленного в Juglans mandshurica [16]. Следующим антрахиноном, идентифицированным во всех экстрактах, был эмодин (соединение 24) из-за его характерного УФ-спектра и фрагментации (наиболее распространенный ион-продукт при m/z 229 и меньшие ионы-продукты при m/z 201 и 173).

 

Рис. 7. Масс-спектр 1,4,8 – тригидрокси-антрахинона из экстракта листьев Reynoutria japonica. Вверху МС-скан в диапазоне 100–1700 m/z, внизу спектры фрагментации (сверху-вниз): МС2 протонированного иона 1,4,8 – тригидрокси-антрахинона (256.17 m/z, красный ромб), МС3 фрагмента 256.17→210.18 m/z и МС4 фрагмента 256.17→210.18→181.93 m/z.

 

На основании литературных данных (Chinese herbal formula Jian-Pi-Yi-Shen pill [11], R. japonica (Polygonum cuspidatum) [14], Reynoutria [15]) соединение 24 было предварительно идентифицировано как эмодин, данное соединение наблюдалось во всех экстрактах R. japonica. Масс-спектрометрические исследования других видов рейнутрии в научной литературе показали присутствие нафтохинона эмодина также в R. sachalinensis и R. bohemica [15].

Таким образом, экстракты из листьев и стеблей растения R. japonica содержат большое количество полифенольных соединений, а также и другие биологически активные вещества. В данной работе авторы впервые попытались сделать метаболомное исследование образцов растения R. japonica, полученной из дальневосточных образцов зон произрастания данного растения. В данном исследовании для идентификации целевых аналитов использовался метод тандемной масс-спектрометрии (ВЭЖХ в соединении с ионной ловушкой).

Результаты исследований показали присутствие 18 соединений полифенольного класса, соответствующих семейству Polygonaceae. В добавление к обнаруженным целевым соединениям некоторые соединения были обнаружены и предварительно идентифицированы впервые в данных сортообразцах R. japonica. Впервые в экстрактах R. japonica идентифицированы следующие полифенольные соединения: дигидрохалкон аспалатин, кумарин умбеллиферон, лигнан сирингарезинол, а также флавоны формононетин и гарденин Б. Полученные данные могут поддержать будущие исследования по производству различных фармацевтических и диетических добавок, содержащих экстракты растения R. japonica. Широкий спектр биологически активных соединений обеспечивает большие возможности для создания новых лекарственных и биологически активных добавок на основе экстрактов из семейства Polygonaceae.

Работа выполнена при финансовой поддержке Министерства науки и высшего образования Российской Федерации в рамках достижения результатов федерального проекта “Передовые инженерные школы” (Соглашение № 075-15-2022-1143 от 07.07.2022).

Настоящая статья не содержит каких-либо исследований с участием людей и животных в качестве объектов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Об авторах

М. П. Разгонова

Федеральное государственное бюджетное научное учреждение “Федеральный исследовательский центр Всероссийский институт генетических ресурсов растений им. Н.И. Вавилова”

Автор, ответственный за переписку.
Email: m.razgonova@vir.nw.ru
Россия, Санкт-Петербург

Е. И. Черевач

Федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего образования “Дальневосточный федеральный университет”

Email: m.razgonova@vir.nw.ru

Передовая инженерная школа “Институт биотехнологий, биоинженерии и пищевых систем”

Россия, Владивосток

Н. С. Кириленко

Федеральное государственное бюджетное научное учреждение “Федеральный исследовательский центр Всероссийский институт генетических ресурсов растений им. Н.И. Вавилова”

Email: m.razgonova@vir.nw.ru
Россия, Санкт-Петербург

Е. Н. Демидова

Федеральное государственное бюджетное научное учреждение “Федеральный исследовательский центр Всероссийский институт генетических ресурсов растений им. Н.И. Вавилова”

Email: m.razgonova@vir.nw.ru
Россия, Санкт-Петербург

К. С. Голохваст

Федеральное государственное бюджетное научное учреждение “Сибирский федеральный научный центр агробиотехнологий Российской академии наук”

Email: m.razgonova@vir.nw.ru
Россия, Краснообск

Список литературы

Дополнительные файлы