Влияние окислительного стресса на липидный состав рафтовых структур вакуолярной мембраны

Full Text

Сокращения: ЖК – жирные кислоты; НЖК – насыщенные жирные кислоты; ННЖК – ненасыщенные жирные кислоты; СФ – сфинголипиды; ДГДГ – дигалактозилдиацилглицериды; МГДГ – моногалактозилдиацилглицериды; ФК – фосфатидная кислота; ФХ – фосфатидилхолины; ФЭ – фосфатидилэтаноламины; ФГ – фосфатидилглицерины; ФИ – фосфатидилинозитолы; ФС – фосфатидилсерины.

ВВЕДЕНИЕ

Влияние неблагоприятных факторов внешней среды на растения приводит к нарушению метаболизма и существенному снижению продуктивности растений. Изучение изменений, которые происходят в ответ на стрессовые воздействия, и способы их преодоления являются одной из основных задач биологии. Действие экстремальных факторов, вызывающих у клеток состояние стресса, приводит к перестройке метаболизма клетки, которая должна способствовать успешному преодолению негативной ситуации и восстановлению нарушенного гомеостаза. Одним из наиболее опасных стрессов для растений является окислительный стресс. К нему приводит любое другое стрессовое воздействие [1]. Первыми с неблагоприятными внешними воздействиями сталкиваются биологические мембраны. Известно, что мембранные липиды могут принимать участие в защите растительной клетки от стрессовых воздействий [2]. Вакуолярная мембрана является одной из наименее изученных, хотя имеет большое значение в жизнедеятельности растительной клетки. Тонопласт, как внутренняя мембрана протопласта, ограничивает вакуоль растительной клетки и обладает избирательной проницаемостью, активно участвует в процессах транспорта метаболитов, во многом определяет способность клетки к осморегуляции, к регуляции рН и ионного гомеостаза цитозоля, трансдукции сигналов различной природы, а также принимает активное участие в защите клетки от абиотического стресса.

В настоящее время общепринятым является мнение о том, что биологические мембраны неоднородны и имеют доменную организацию [3]. В плазматической мембране выявлено присутствие целого ряда микро- и нанодоменов [4]. Микродомены первыми выделенные из плазмалеммы были названы рафтами [5]. По определению рафты являются микродоменами клеточных мембран, в которых вокруг определенных белков образуются области, обогащенные гликосфинголипидами, стеринами и липидами с насыщенными жирными кислотами, что делает их более плотными, чем окружающая мембрана [6]. Известно, что эти мембранные структуры принимают активное участие во многих важных для растительной клетки процессах, таких как экзо- и эндоцитоз, деление, поляризация, внутриклеточная передача сигналов, образование мембранных контактов, связь с цитоскелетом и др. [7]. В тонопласте также были обнаружены рафты [8]. Используя более “мягкий” бездетергентный метод выделения рафтов из вакуолярной мембраны после высокоскоростного разделения в градиенте плотности сахарозы были выделены 3 зоны, в которых присутствовали мембранные фракции, содержащие в большом количестве липиды, характерные для липид-белковых микродоменов относимых к рафтам [9]. В липидном составе рафтов могут происходить определенные изменения, которые будут отражаться на таких биофизических параметрах мембраны как текучесть (микровязкость) и пластичность, что может быть связано с участием этих структур в адаптационных механизмах растительной клетки. Кроме того, изменения в содержании ряда мембранных фосфолипидов и гликоглицеролипидов могут стабилизировать ламеллярную структуру мембраны, предотвращая ее переход в гексагональную фазу [10], что также будет способствовать усилению защитных механизмов при воздействии стресса. Ранее нами была показана важная роль липидов вакуолярной мембраны в защите клетки от абиотических стрессов [11]. В данном исследовании было выявлено, что в выполнении этой защитной функции могут принимать участие липиды микродоменов (рафтов), присутствующие в тонопласте. Анализируя и сравнивая наши результаты с данными других исследователей, изучающих роль мембранных липидов в защите растительной клетки от стрессов, мы полагаем, что липиды, входящие в состав рафтов вакуолярной мембраны, играют важную роль в защите растительной клетки от абиотических стрессов.

Цель данного исследования состояла в изучении изменений происходящих в составе липидов рафтовых микродоменов тонопласта после окислительного стресса, и выяснении роли рафтовых структур в защитных механизмах растительной клетки.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

В качестве объекта исследования использовали корнеплоды столовой свеклы (Beta vulgaris L.), которые самостоятельно выращивали в полевых условиях. Корнеплоды, находились в периоде покоя и хранились в течение нескольких месяцев при температуре 4–6°С.

Вакуолярные мембраны получали описанным ранее методом [12] из контрольных корнеплодов и корнеплодов, подвергнутых окислительному стрессу. Чистоту выделенной мембранной фракции оценивали при помощи специфических ингибиторов H⁺-АТФаз. Азид натрия (NaN₃), ванадат натрия (Na₃VO₄) и бафиломицин являются ингибиторами F-, P- и V-типа H⁺-АТФаз соответственно. В экспериментах по определению чистоты полученных фракций тонопласта, азид натрия и ванадат натрия практически не влияли на активность Н⁺-АТФаз изолированных везикул, в то время как бафиломицин подавлял активность на 95%. АТФазную активность измеряли путем количественного определения неорганического фосфата, высвобождаемого из АТФ по методу [13] в модификации Скулачева и выражали как отношение концентрации неорганического фосфата к концентрации белков за 1 ч. Количество белка определяли по методу Брэдфорд [14], используя бычий сывороточный альбумин в качестве стандарта. Проведенные исследования позволили сделать вывод о том, что мембранная фракция является достаточно чистой и может быть использована в экспериментах.

Выделение липидно-белковых микродоменов (рафтов). Схема выделения липид-белковых микродоменов из мембранных везикул тонопласта контрольных корнеплодов и корнеплодов, подвергнутых стрессу, приведена в статье [15]. Мембранные везикулы замораживали и оттаивали, затем встряхивали в течение 30 мин при скорости 1200–1400 об/мин на шейкере (“IKA Werke”, Германия) при 4°C в буфере, содержащем 20 мМ Tris-HCl, 1 мМ MgCl₂, 1 мМ CaCl₂, 300 мМ сахарозы, 0.2 мМ амино-этилбензол сульфонил фторида, 1 мг/мл апротинина, 10 мкМ бестатина, 3 мкМ E-64, 10 мг/мл лейпептина, 2 мкМ пепстатин, pH 7.8, и помещали под раствор с градиентом плотности сахарозы 15–60%. Центрифугировали в течение 18 ч при 200000 g. После центрифугирования мембранные фракции в градиенте сахарозы были разделены на зоны, представленные на схеме в ранее опубликованной статье [15]. В ранее проведенных экспериментах было показано, что рафтовые структуры находятся в зоне 2 (15% сахарозы, плотность 1.050 г/см³), зоне 4 (35% сахарозы, плотность 1.110 г/см³) и зоне 6 (60% сахарозы, плотность 1.154 г/см³). Затем анализировали в этих зонах количественный и качественный состав липидов, стеринов и жирных кислот.

Условия создания окислительного стресса. Для создания окислительного стресса кусочки ткани корнеплода инкубировали в растворе 100 мМ Н₂О₂ в течение 16 ч. В контрольном варианте инкубацию таких же кусочков ткани корнеплодов проводили в дистиллированной воде. Таким образом, мы исключали влияние гипоосмотического стресса. При подборе эффективных условий стрессового воздействия использовали более низкие концентрации перекиси водорода (20, 40 и 50 мМ), но они не давали достаточно эффективного стрессового воздействия, которое оказывала концентрация 100 мМ. Для характеристики эффективности стрессового воздействия на корнеплоды использовали кондуктометрический метод [16]. Также определяли содержание диеновых коньюгатов, которое проводили по методу [17]. Влияние стрессов на барьерные свойства мембран (стабильность мембран) изучали с использованием цейтраферной видеосъемки [18].

Анализ мембранных липидов. Суммарные липиды из рафтовых микродоменов тонопласта расположеных в 2, 4 и 6 зонах градиента плотности сахарозы экстрагировали по методу [19]. Количество общих липидов в экстрактах определяли гравиметрическим методом в вакууме до постоянной массы аликвот экстракта. Полярные липиды разделяли методом ТСХ с использованием двумерной системы: первое направление – хлороформ–метанол–бензол–28% NH₄OH (65 : 30 : 10 : 6 по объему), второе направление – хлороформ–метанол–уксусная кислота–ацетон–бензол–вода (70 : 30 : 4 : 5 : 10 : 1 по объему). Нейтральные липиды разделяли в системе гексан-диэтиловый эфир-уксусная кислота (80 : 20 : 1 по объему). Идентификацию пятен осуществляли распылением специальных реагентов, определением Rf пятен и использованием соответствующих стандартов. Денситометрический анализ проводился с использованием ImageJ и Microsoft Excel. Сканирование выполнялось с помощью МФУ Brother dcp-l2500dr. Определение содержания отдельных липидов в зонах градиента плотности сахарозы представлено в процентах от общего количества.

Анализ стеринов. Для анализа стеринов использовали одномерную ТСХ в системе растворителей нейтральных липидов гексан–диэтиловый эфир–уксусная кислота (80 : 20 : 1 по объему). Стерины, элюированные с пластинок хлороформом и этилацетатом, силилировали гексаметилдисилазаном и N,O-бис(тиметилсилил)ацетамидом. Полученные триметилсилильные производные стеринов анализировали с помощью хромато-масс-спектрометра GC-MS 7000/7890A Triple Quad (“Agilent Technologies”, США). Стерины идентифицировали путем сравнения времени их удерживания со стандартами. Также использовались библиотеки масс-спектров NIST08 и WILEY7. Количественный анализ проводили с использованием калибровочной кривой для холестерина, кампестерина, стигмастерина и β-ситостерина. В качестве внутреннего стандарта использовали эргостерин. Распределение содержания каждого стерина в зонах градиента плотности сахарозы, содержащих рафтовые микродомены, представлено в процентах от общего количества.

Анализ жирных кислот. Экстрагированные липиды были использованы в экспериментах по изучению состава жирных кислот (ЖК) в рафтовых микродоменах тонопласта, выделенных из 2, 4 и 6 зон сахарозного градиента. Метиловые эфиры жирных кислот получали по методу [20]. Анализ метиловых эфиров ЖК тонопласта проводили с использованием хромато-масс-спектрометра 5973N/6890N MSD/DS (“Agilent Technologies”, США). Детектором служил квадрупольный масс-спектрометр (“Agilent Technologies”, США); в качестве метода ионизации использовался электронный удар; энергия ионизации составляла 70 эВ. Для анализа использовался режим регистрации полного ионного тока. Для разделения использовали капиллярную колонку HP-INNOWAX (30 м × 250 мкм × 0.50 мкм) (“Hewlett-Packard”, США). Неподвижной фазой служил полиэтиленгликоль. Подвижной фазой служил гелий со скоростью потока 1 мл/мин. Температура составляла: 250°С для испарителя, 230°С для источника ионов, 150°С для детектора и 280°С для линии, соединяющей хроматограф с масс-спектрометром. Диапазон сканирования составлял 4–450 а.е.м. Объем вводимой пробы составлял 1 мкл при соотношении потоков 5 : 1. Хроматографию проводили в изотермическом режиме при 200°С. Для идентификации пиков метиловых эфиров ЖК использовали стандарты метиловых эфиров (“Sigma”, США) и метод масс-спектрометрии с использованием библиотеки масс-спектров NIST 05. Результаты представлены в процентах от общего количества ЖК.

Статистический анализ. Для статистической обработки данных использовали программный пакет SigmaPlot 12.5. Эксперименты проводили не менее чем в трех независимых повторностях. Результаты приведены в %. В таблицах данные представлены как медианы в виде межквартильной широты (25; 75 процентиль). Статистическую значимость различий между сравниваемыми средними значениями оценивали с помощью U-критерия Манна-Уитни (* – Р < 0.01).

РЕЗУЛЬТАТЫ

На первом этапе проводилась оценка влияния окислительного стресса. Результаты проведенных экспериментов показали, что в условиях окислительного стресса выход электролитов из кусочков тканей корнеплода увеличивался более чем в 1.5 раза. Это свидетельствовало о нарушении избирательной проницаемости мембран растительной клетки при окислительном стрессе. Подобные результаты были получены при оценке стабильности изолированных вакуолей. Было показано, что при окислительном стрессе период полураспада вакуолей уменьшался более чем в 2 раза, то есть темпы разрушения были очень высокими. О процессах перекисного окисления липидов, которые происходили при окислительном стрессе судили по увеличению количества диеновых коньюгатов, которое возросло на 15%. Таким образом, был сделан вывод, что стрессовая нагрузка при воздействии перекиси водорода на клетки корнеплода столовой свеклы была достаточно интенсивной.

В табл. 1 приведены результаты анализа содержания основных классов липидов в рафтовых микродоменах тонопласта после окислительного стресса. Отличия наблюдались во всех микродоменах, но в каждом виде микродоменов в разной степени. В микродоменах, выделенных из 4-й зоны сахарозного градиента изменения в составе липидов связаны с заметным увеличением содержания сфинголипидов (СФ), дигалактозилдиацилглицеридов (ДГДГ) и небольшим увеличением содержания фосфатидилсеринов (ФС) и стеринов. В то же время отмечено снижение фосфатидной кислоты (ФК), фосфатидилглицеринов (ФГ) и углеводородов. Среди липидов микродоменов 2-й зоны сахарозного градиента произошло небольшое увеличение содержания СФ и фосфатидилинозитолов (ФИ) и снижение содержания ФК, ФС, моногалактозилдиацилглицеридов (МГДГ), стеринов и эфиров стеринов. Изменения после окислительного стресса среди липидов микродоменов из 6-й зоны сахарозного градиента были связаны с заметным увеличением содержания фосфатидилхолинов (ФХ) и МГДГ. Также было обнаружено появление небольшого количества таких фосфолипидов как фосфатидилэтаноламины (ФЭ), ФК, ФИ и ФГ, которые до стресса не выявлялись.

 

Таблица 1. Количественное содержание основных классов липидов в рафтовых микродоменах из 2, 4 и 6 зон сахарозного градиента после высокоскоростного центрифугирования тонопласта, выделенного из контрольных и подвергнутых окислительному стрессу корнеплодов, % от общей массы липидов

Липиды, %	Рафты зоны 2		Рафты зоны 4		Рафты зоны 6
	Контроль	Окислит. стресс	Контроль	Окислит. стресс	Контроль	Окислит. стресс
ФХ	3.5 [3.5; 4.1]	3.4 [3.4; 3.6]	3.4 [3.3; 3.9]	4.4 [4.2; 4.5]	0.5 [0.4; 0.5]	2.4 [2.0; 3.8]*
ФЭ	2.6 [2.5; 3.1]	2.8 [2.3; 2.8]	4.0 [3.0; 5.5]	3.0 [2.8; 4.3]	−	1.2 [1.1; 1.8]
ФХ/ФЭ	1.4	1.2	0.9	1.5	−	2.0
ФС	0.8 [0.6; 0.8]	0.2 [0.1; 0.3]*	0.2 [0.1; 0.2]	0.4 [0.4; 0.4]*	−	−
ФИ	0.8 [0.8; 1.2]	1.4 [1.4; 1.8]*	0.9 [0.8; 1.0]	0.9 [0.7; 1.1]	−	0.5 [0.5; 1.1]
ФГ	1.0 [0.8; 1.1]	0.7 [0.6; 0.9]	1.0 [0.9; 1.0]	0.2 [0.2; 0.2]*	−	1.0 [1.0; 1.1]
ФК	4.0 [3.2; 4.0]	0.5 [0.4; 1.1]*	4.3 [3.3; 4.4]	0.3 [0.3; 0.3]*	−	1.5 [1.4; 1.9]
ДГДГ	9.9 [8.2; 10.4]	6.2 [6.0; 6.4]	1.4 [1.4; 1.8]	7.2 [6.9; 7.3]*	5.2 [5.1; 6.0]	8.3 [7.3; 10.2]
МГДГ	6.3 [6.0; 6.9]	4.6 [4.4; 4.7]*	4.9 [4.6; 5.3]	5.7 [5.4; 6.3]	1.5 [1.3; 1.7]	4.8 [4.5; 6.4]*
МГДГ/ДГДГ	0.6	0.7	3.5	0.8	0.3	0.6
СФ	13.6 [12.3; 13.8]	19.8 [19.0; 20.4]*	4.3 [3.2; 5.3]	18.0 [17.2; 18.6]*	8.8 [8.2; 9.2]	10.5 [9.4; 10.6]
Стерины	5.8 [5.8; 5.9]	4.1 [4.0; 4.5]*	6.4 [6.1; 6; 7]	7.2 [7.2; 7.6]*	4.0 [4.0; 4.4]	3.7 [3.5; 4.2]
Эфиры стеринов	9.7 [9.3; 9.9]	5.4 [5.2; 6.2]*	7.2 [6.8; 7.6]	7.0 [6.7; 7.6]	10.3 [9.7; 11.2]	9.2 [8.8; 10.0]
Углеводороды	12.2 [11.8; 12.7]	14.2 [12.7; 14.2]	23.8 [21.0; 24.1]	15.6 [15.2; 16.3]*	29.7 [27.6; 31.0]	22.9 [22.3; 25.2]

Примечание. Данные представлены в виде медиан, а диапазон значений представлен в виде межквартильной широты [25; 75 процентиль]. Статистическую значимость различий между сравниваемыми средними значениями оценивали с помощью U-критерия Манна-Уитни (* – Р < 0.01). Данные были получены методом ТСХ-денситометрии. ДГДГ – дигалактозилдиацилглицерин; МГДГ – моногалактозилдиацилглицерин; ФК – фосфатидная кислота; ФХ – фосфатидилхолин; ФЭ – фосфатидилэтаноламин; ФГ – фосфатидилглицерин; ФИ – фосфатидилинозитол; ФС – фосфатидилсерин; СФ – сфинголипид.

 

Рассматривая изменения в содержании стеринов микродоменов тонопласта после окислительного стресса, можно отметить, что, как и в предыдущей серии экспериментов были выявлены заметные различия между микродоменами (табл. 2). Так, содержание холестерина увеличивалось в рафтах из 2 зоны сахарозного градиента, снижалось в рафтах из 4 зоны и не изменялось в рафтах из 6 зоны сахарозного градиента. Увеличение β-ситостерина после окислительного стресса происходило в рафтах из 4 и 6-й зон сахарозного градиента. Изменения в составе кампестерина и стигмастерина происходили только в рафтах из 6-й зоны, причем содержание каспестерина увеличивалось, а стигмастерина снижалось.

 

Tаблица 2. Количественное содержание основных классов стеринов в рафтовых микродоменах из 2, 4 и 6 зон сахарозного градиента после высокоскоростного центрифугирования тонопласта в контроле и после окислительного стресса, % от суммы всех стеринов

Стерины, %	Рафты зоны 2		Рафты зоны 4		Рафты зоны 6
	Контроль	Окислит. стресс	Контроль	Окислит. стресс	Контроль	Окислит. стресс
холестерин	4.3 [4.2; 4.6]	11.0 [10.2; 11.1]*	9.1 [8.2; 9.3]	3.6 [3.6; 4.0]*	5.9 [5.5; 6.0]	5.8 [5.4; 5.9]
кампестерин	10.0 [9.4; 10.2]	9.8 [8.4; 9.9]	7.5 [6.6; 7.8]	7.2 [6.3; 7.6]	9.9 [9.3; 10.0]	11.2 [10.9; 11.5]*
стигмастерин	36.1 [33.2; 37.4]	31.5 [31.2; 36.6]	46.1 [43.4; 46.7]	39.7 [34.7; 40.4]	37.3 [35.3; 39.0]	26.0 [23.6; 28.3]*
β-ситостерин	49.1 [48.0; 52.8]	47.7 [44.8; 47.9]	38.5 [38.2; 40.4]	49.9 [49.3; 54.21]*	47.7 [45.5; 49.7]	57.5 [55.0; 59.6]*

Примечание. Данные представлены как медианы в виде межквартильной широты [25-й; 75-й процентиль]. Статистическую значимость различий между сравниваемыми средними значениями оценивали с помощью U-критерия Манна-Уитни (* – Р < 0.01). Данные были получены методом ГХ-МС.

 

При анализе изменений в составе ЖК рафтовых микродоменов тонопласта после окислительного стресса отмечено, что почти во всех микродоменах преобладала пальмитиновая ЖК (С16:0) (табл. 3). Наименее заметные изменения отмечены в микродоменах 2-й зоны сахарозного градиента. Произошло перераспределение в составе насыщенных жирных кислот (НЖК): уменьшилось содержание пальмитиновой ЖК и, соответственно, увеличилось содержание миристиновой (С14:0), маргариновой (С17:0) и стеариновой (С18:0) ЖК. Сумма НЖК после окислительного стресса достоверно не изменилась. В составе ЖК микродоменов из 4 зоны сахарозного градиента были также отмечены различия связанные, главным образом, с изменениями в содержании НЖК, кроме того произошло увеличение ненасыщенной линоленовой ЖК (С18:3(n-3)). В результате этого уменьшилась сумма НЖК и, соответственно, увеличилось соотношение ∑ННЖК/∑НЖК. Другие изменения произошли в составе ЖК у рафтовых микродоменов 6 зоны сахарозного градиента. Здесь в отличие от предыдущих микродоменов наблюдается хорошо заметное увеличение содержания ненасыщенной линолевой ЖК (С18:2(n-6)), еще более заметное снижение суммы НЖК и увеличение соотношения ∑ННЖК/∑НЖК.

 

Таблица 3. Содержание жирных кислот в рафтовых микродоменах из 2, 4 и 6 зон сахарозного градиента после высокоскоростного центрифугирования тонопласта из контрольных и подвергнутых окислительному стрессу корнеплодов столовой свеклы, % от суммы всех ЖК

ЖК, %	Рафты зоны 2		Рафты зоны 4		Рафты зоны 6
	Контроль	Окислит. стресс	Контроль	Окислит. стресс	Контроль	Окислит. стресс
C14:0	−	7.2 [7.0; 7.6]	−	−	−	−
C15:0	1.7 [1.6; 1.8]	1.7 [1.5; 2.8]	1.4 [1.4; 1.4]	1.2 [1.1; 1.2]*	9.3 [8.2; 9.5]	1.4 [1.1; 1.6]*
C16:0	53.2 [51.8; 56.9]	37.8 [37.3; 39.3]*	36.3 [36.1; 37.1]	27.7 [26.5; 28.5]*	46.4 [45.4; 47.7]	37.1 [36.3; 40.8]
C17:0	−	0.4 [0.4; 0.4]	−	1.7 [1.6; 1.8]	−	−
C18:0	8.4 [7.5; 9.5]	12.1 [12.0; 12.7]*	7.4 [5.9; 8.0]	2.6 [2.5; 2.9]*	24.5 [22.4; 24.4]	12.3 [11.9; 12.8]*
C18:1(n-9)	22.2 [18.6; 22,2]	23.0 [22.9; 23.9]	23.1 [21.3; 23.3]	22.0 [21.8; 24.6]	10,0 [8.1; 10.3]	19.7 [14.8; 20.4]
C18:1(n-7)	3.9 [3.8; 4.0]	5.6 [3.1; 6.2]	5.6 [4.2; 5.6]	8.4 [6.7; 8.5]	4.6 [3.8; 7.0]	9.7 [9.4; 10.0]
C18:2(n-6)	10.6 [9.4; 12.8]	11.1 [10.5; 11.4]	26.3 [24.9; 29.0]	35.0 [32.9; 35.7]	4.9 [4.4; 7.8]	20.7 [20.3; 21.0]*
C18:3(n-3)	−	−	1.1 [1.1; 1.4]	2.3 [1.9; 2.5]*	−	−
ΣНЖК	65.5 [62.3; 68.0]	59.7 [59.2; 62.6]	46.0 [44,1; 46.3]	32.84 [31.5; 34.2]*	80.6 [77.2; 81.5]	51.4 49.9; 55.0]*
ΣННЖК	34.5 [32.0; 37.7]	40.3 [37.4; 40.8]	54.0 [53.8; 55.9]	67.2 [65.8; 68.5]*	19.4 [18.5; 22.8]	48.6 [45.0; 50.1]*
ΣННЖК/ΣНЖК	0.5 [0.5; 0.6]	0.7 [0.6; 0.7]	1.2 [1.2; 1.3]	2.2 [1.9; 2.2]*	0.2 [[0.2; 0.3]	0.9 [0.8; 1.0]*

Примечание. Данные представлены как медианы в виде межквартильной широты [25; 75 процентиль]. Статистическую значимость различий между сравниваемыми средними значениями оценивали с помощью U-критерия Манна-Уитни (* – Р < 0.01). Данные получены методом ГХ-МС. НЖК – насыщенные жирные кислоты; ННЖК– ненасыщенные жирные кислоты.

 

ОБСУЖДЕНИЕ

Изучению роли мембранных липидов в защите клеток от стресса посвящено много исследований. Выявлены классы мембранных липидов, которые могут принимать активное участие в защите растительной клетки от стресса. Отчетливо показана стабилизирующая, упорядочивающая роль мембранных стеринов и сфинголипидов при стрессовых воздействиях. Они регулируют микровязкость (текучесть) и пластичность мембран, участвуют в адаптационных механизмах растительных клеток [21]. В наших экспериментах после окислительного стресса хорошо заметно увеличение этих липидов в микродоменах 2 и особенно 4-й зоны сахарозного градиента. Рассматривая подробно изменения в составе стеринов вакуолярной мембраны после окислительного стресса, можно отметить более чем двукратное увеличение в микродоменах 2-й зоны содержания холестерина. Этот стерин, который встречается в растительных мембранах в небольшом количестве, играет важную роль в регуляции биофизических характеристик мембран. Ранее было показано, что холестерин экранирует отрицательные заряды и, тем самым, снижает поверхностный заряд мембраны [22]. Это способствует более плотной упаковке углеводородных цепей в фазе геля, а, следовательно, дополнительному повышению микровязкости мембраны и возможному уменьшению ее проницаемости. Также из изменений, которые могут иметь адаптивный характер можно отметить увеличение содержания “антистрессового” стерина – кампестерина в микродоменах 6-й зоны, который, по мнению ряда исследователей, связан с защитными механизмами растительной клетки [23]. В микродоменах 4 и 6 зон отмечено увеличение содержания ситостерина. Известно, что среди различных стеринов β-ситостерин является основным стерином, укрепляющим растительные мембраны [24]. Кроме того, известно, что β-ситостерин обладает высокой антиоксидантной активностью [25] и способен регулировать текучесть и проницаемость мембран путем взаимодействия с насыщенными алкильными цепями фосфолипидов и сфинголипидов, ограничивая их подвижность, так же, как и холестерин в клетках млекопитающих [26]. Мутанты с повышенным содержанием β-ситостерина обладали большей устойчивостью к окислительному стрессу по сравнению с диким типом [27].

После воздействия окислительного стресса отмечены также изменения среди полярных липидов в исследуемых рафтовых микродоменах. Фосфолипиды и гликолипиды играют существенную роль в стабилизации липидного бислоя, что особенно важно при защите от стрессового воздействия. Известно, что увеличение содержания таких липидов как ФХ, ФИ, ФГ и ДГДГ обеспечивает стабилизацию бислойной структуры, тогда как увеличение содержания ФЭ и МГДГ способствует переходу мембран в гексагональную фазу [28]. Изменения в составе фосфолипидов у разных микродоменов существенно различались. Из липидов, которые стабилизируют бислойную структуру в рафтовых микродоменах отмечено увеличение ДГДГ у рафтов из 4-й зоны сахарозного градиента и увеличение ФИ в рафтовых микродоменах из 2-й зоны. В рафтовых структурах из 6 зоны также увеличилось содержание ФХ, ФИ и ФГ, что может быть связано со стабилизацией липидной мембраны. Наиболее заметные изменения среди фосфолипидов этих микродоменов произошли в содержании ФК, которые существенно уменьшились в микродоменах 2 и 4 зон и увеличивались в рафтовых микродоменах 6 зоны. Это изменение в содержании ФК могут быть связаны с адаптивной защитной реакцией, поскольку из литературных данных известно, что снижение содержания ФК способствовало поддержанию бислойной структуры мембраны, усиливало ее текучесть, процессы дегидратации и препятствовало индукции гидрофильных водных каналов [29]. Высокое содержание ФК среди фосфолипидов является отличительной особенностью вакуолярной мембраны. В тонопласте, выделенном из корнеплодов столовой свеклы, содержание ФК составляло 14.6% от всех фосфолипидов [30]. Тогда как в других мембранах содержание ФК было значительно меньше – так в плазмалемме из ананаса содержание ФК составляло 3–4% от суммы фосфолипидов [31]. При изучении влияния стрессов на липидные профили другие исследователи наиболее часто отмечали повышение содержание ФК [32, 33]. После низкотемпературной обработки в 10 раз увеличивалось содержание ФК в листьях Arabidopsis, но в этих экспериментах содержание ФК в контрольных растениях составляло 0.7% от суммы всех фосфолипидов [34], а не 14.6%, как в вакуолярной мембране из корнеплодов столовой свеклы. У микродоменов 6 зоны сахарозного градиента адаптивные изменения в большей степени связаны с увеличением содержания ФХ, который хорошо стабилизирует ламеллярную структуру мембран [10].

После окислительного стресса произошли изменения и среди гликоглицеролипидов: заметно увеличилось содержание МГДГ у микродоменов 6 зоны и снизилось в микродоменах 2 зоны, в то время как для ДГДГ отмечено увеличение содержания, но только в микродоменах 4 зоны. Эти изменения привели к существенному снижению соотношения МГДГ/ДГДГ у микродоменов 4 зоны и увеличению в других микродоменах, особенно заметному для микродоменов 6 зоны. Известно, что у более устойчивых растений увеличение этого соотношения связывают со стабилизацией структуры мембраны [35]. Также с процессом стабилизации мембраны и упорядочением липидного бислоя связывают повышение содержания ДГДГ, тогда как увеличение содержания МГДГ может нарушать целостность липидного бислоя, вызывая переход в гексагональную липидную фазу [36]. Таким образом, изменения содержания гликоглицеролипидов также могут участвовать в защите растительной клетки от окислительного стресса.

Изменения в составе ЖК мембранных липидов при стрессе ответственны за структурные перестройки клеточных мембран, поэтому в настоящее время они рассматриваются как один из механизмов адаптации организмов к стрессовому воздействию [37]. Анализируя результаты экспериментов по изменению содержания ЖК в рафтовых микродоменах 2, 4 и 6-й зон сахарозного градиента после высокоскоростного разделения тонопласта из контрольных корнеплодов и корнеплодов, подвергнутых окислительному стрессу, можно сделать вывод, что наиболее существенные изменения произошли в микродоменах из 4 и 6 зон. Эти изменения привели к увеличению суммы ННЖК и соотношения ∑ННЖК/∑НЖК. Важным показателем включения защитных механизмов клетки при неблагоприятных воздействиях является увеличение содержания ненасыщенных ЖК в составе мембранных липидов [38]. Это явление было отмечено при разных видах абиотического стресса. Увеличение концентрации ненасыщенных ЖК один из важнейших факторов низкотемпературной адаптации, что было неоднократно продемонстрировано на многих растительных объектах [39]. Установлено также, что повышение содержания ненасыщенных ЖК в мембранах растительных тканей увеличивает устойчивость растений к действию патогенов [40]. Увеличение ненасыщенных ЖК мембранных липидов определяет такие показатели как микровязкость, проницаемость и делает мембрану более эластичной.

Ранее нашим коллективом исследовалось влияние окислительного стресса на липидный состав исходной вакуолярной мембраны [11]. Было показано, что в тонопласте после окислительного стресса из наиболее заметных адаптивных изменений отмечалось существенное снижение ФК (37% от контроля), увеличение содержания ДГДГ (353%), увеличение содержания суммы стеринов (194%). В полученных нами результатах по анализу состава липидов рафтовых структур тонопласта после окислительного стресса мы видим подобные изменения в составе липидов, что подтверждает роль рафтовых структур в защитных механизмах растительной клетки.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Рассматривая участие рафтовых микродоменов из разных зон сахарозного градиента после высокоскоростного разделения тонопласта в защитных механизмах растительной клетки можно сделать вывод о том, что после окислительного стресса во всех зонах, были отмечены изменения в составе липидов, которые можно отнести к адаптационным. Так, в микродоменах 2 и 4 зон сахарозного градиента отмечено увеличение содержания СФ, способных стабилизировать структуру мембран и приводить к снижению содержания ФК, что способствует поддержанию бислойной структуры мембраны. Кроме того, в 4 зоне отмечено увеличение содержания β-ситостерина и ДГДГ, что может усиливать защитные механизмы клетки. У микродоменов 2 зоны из изменений, которые можно отнести к адаптивным отмечено уменьшение содержания МГДГ, а среди стеринов увеличение содержания холестерина. Другие варианты возможных защитных механизмов присутствовали у микродоменов из 6 зоны сахарозного градиента. Это увеличение содержания ФХ и соотношения МГДГ/ДМГДГ, которые способствовали стабилизации ламеллярной структуры мембран, а также увеличение среди стеринов доли “антистрессового” кампестерина.

Комплекс выявленных изменений липидного состава у рафтовых микродоменов вакуолярной мембраны может быть связан с защитными механизмами, которые запускаются в клетках растений в условиях окислительного стресса, а функциональная роль мембранных рафтовых структур связана с адаптационными механизмами растительной клетки.

Работа выполнена с использованием оборудования Центрального аналитического центра “Биоаналитика” Сибирского института физиологии и биохимии растений СО РАН, г. Иркутск. Данная работа выполнена в рамках проекта, финансируемого за счет государственного бюджета (№ 122041100052-0).

Настоящая статья не содержит каких-либо исследований с участием людей в качестве объектов исследований. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

About the authors

Н. В. Озолина

Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Сибирский институт физиологии и биохимии растений СО РАН

Author for correspondence.
Email: ozol@sifibr.irk.ru
Russian Federation, Иркутск

И. С. Капустина

Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Сибирский институт физиологии и биохимии растений СО РАН

Email: ozol@sifibr.irk.ru
Russian Federation, Иркутск

В. В. Гурина

Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Сибирский институт физиологии и биохимии растений СО РАН

Email: ozol@sifibr.irk.ru
Russian Federation, Иркутск

Е. В. Спиридонова

Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Сибирский институт физиологии и биохимии растений СО РАН

Email: ozol@sifibr.irk.ru
Russian Federation, Иркутск

В. Н. Нурминский

Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Сибирский институт физиологии и биохимии растений СО РАН

Email: ozol@sifibr.irk.ru
Russian Federation, Иркутск

References

Supplementary files