Специфика роста и накопления флавоноидов у растений и клеточных культур Lychnis chalcedonica, полученных от эксплантов разных органов

Полный текст

Сокращения: ВМ – вторичные метаболиты; ДГКВ – дигидрокверцетин; КВ – кверцетин; Про – пролин; Р – рутин; Фл – флавоноиды; ФС – фенольные соединения; ЦК – цитокинины.

ВВЕДЕНИЕ

Ухудшение условий существования растений в силу изменения климата и загрязнения почвы вследствие интенсивной сельскохозяйственной, нефте- и рудодобывающей деятельности человека, усиленная эксплуатация дикорастущих и плантационных растений – традиционного источника лекарственных средств – приводят к растущему дефициту сырья. Использование культур клеток и тканей растений в качестве источника биологически активных веществ (БАВ) помогает спасти от уничтожения редкие дикорастущие растения, синтезирующие необходимые для жизнедеятельности человека вещества. Кроме того, этот биотехнологический метод позволяет решить проблему круглогодичного получения БАВ в отсутствии загрязнения патогенами и их продуктами жизнедеятельности и др. [1]. В случае, если условия культивирования установлены и стандартизированы, то производство желаемых БАВ постоянно, в то время как в интактных растениях их концентрация зависит от многих факторов.

Растения характеризуются способностью синтезировать вторичные метаболиты (ВМ), среди которых выделяют многочисленную группу флавоноидов (Фл). Фл представляют собой класс гидроксилированных фенольных соединений (ФС), имеющий сложную гетероциклическую структуру. Фл построены на основе структуры C6 (кольцо A)-C3 (кольцо C)-C6 (кольцо B). В зависимости от степени окисления трехуглеродного участка, Фл разделяют на антоцианы (дигидрофлавонолы), флавононы, флавоны, флавонолы и изофлавонолы [2–4].

Биогенетическим предшественником Фл служит фенилаланин, который образуется в шикиматном пути в хлоропластах и из которого в цитозоле синтезируются Фл. Комплекс Фл с глутатионом транспортируется ABC-переносчиком в вакуоли клетки, где происходит их накопление и хранение [1, 5, 6]. Фл могут накапливаться в свободном пространстве и хлоропластах [1].

На накопление БАВ в растениях влияют их стадии развития и возраст [7]. Многие лекарственные растения накапливают большое количество ВМ в основном в период репродуктивного роста. На стадии плодоношения корень и корневище 2-летней Echinácea purpúrea (L.) Moench имеют более высокий уровень цикориевой кислоты, а Astragalus compactus Lam. (Fabaceae) – фенолов, тогда как олеаноловая кислота и экдистерон в корне Achyranthes bidentata выше в период вегетативного роста. Содержание общих Фл в корне Scutellaria baicalensis Georgi стабильно на протяжении всей стадии роста, но содержание байкалина увеличивается, а затем постепенно снижается. Содержание сапонинов в Panax ginsen C.A. Mey. увеличивается с возрастом растения. В процессе жизнедеятельности растений меняется состав ВМ. Например, содержание рутина (Р) и кверцетина (КВ) максимально у 7-летних растений, магнолола – у 10-летних растений, тогда как хлорогеновой кислоты, гиперина и КВ – в коре 13-летних растений Magnolia officinalis Rehder & E.H. Wilson.

Фл выполняют защитную функцию от патогенов, УФ-излучения и света высокой интенсивности, осуществляют биологическую коммуникацию в ризосфере, регуляцию транспорта ИУК и его метаболизма, повышают эффективность извлечения питательных веществ во время старения растения, реализуют антиоксидантную функцию [8]. Обобщая сведения для интактного растения, профессор А.М. Носов [9] среди основных функций вторичных метаболитов называет экологическую функцию. В то же время, опираясь на принцип мультифункциональности вторичного метаболизма, он считает, что второстепенные функции метаболитов в случае культивирования клеток in vitro могут быть полезными для интенсивной или устойчивой пролиферации клеток.

Известно, что лихнис хальцедонский характеризуется присутствием фитоэкдистероидов, содержание которых зависит от органа, стадии развития и условий существования. В то же время представляет интерес присутствие других ВМ, которые позволяют повысить значимость вида для фармакологии. В растениях лихниса обнаружены следующие Фл: виценин, витексин и неовитексин [10]. В совокупности комплекс Фл оказывает противовоспалительную и анальгетическую активность [11].

Для оценки важности отдельных лекарственных растений для фармакологии необходимо изучить органно-тканевую специфичность тех или иных лекарственных компонентов, а также взаимосвязь между морфогенезом, синтезом и накоплением этих компонентов в лекарственных растениях. Выявление закономерностей накопления Фл необходимо и для решения проблемы расширения разнообразия продукции растениеводства.

В связи с этим целью исследования явилось изучение роста и содержания индивидуальных веществ флавоноидной природы в каллусных и суспензионных культурах, полученных на основе эксплантов разных органов молодых растений Lychnis chalcedonica L. Кроме того, нами изучено суммарное содержание ФС и их отдельных представителей в интактных растениях на вегетативной и репродуктивной стадиях онтогенеза. Выполнено сравнительное исследование суммарного накопления Фл и близких по структуре Фл: Р, КВ и дигидрокверцетина (ДГКВ).

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Объект исследования. Работу выполняли на растениях лихниса хальцедонского (Lychnis chalcedonica L.) и его каллусных и суспензионной культурах. Одна группа растений лихниса выращена в природных условиях на дерново-подзолистой почве Томской области и получены семена. Другая группа растений выращена в условиях лаборатории в осветительной установке при плотности потока фотонов 130‒170 мкмоль/(м² с), при 16-часовом фотопериоде и температуре воздуха 20‒22°C на почвогрунте “Гарант” Универсал цветочный (ПК “Темп-2”, Кисловка, Томская область). Грунт содержал (мг/кг): N – 40, P₂O₅ – 70, K₂O – 150 и микроэлементы (Mg, Fe, Cu, Mo, B, Mn). Состав почвогрунта: 25% – биогумус, 35% – торфоперегной, 35% – торфонизинный, переходный, 5% – песок речной, pH 6.5‒7.0.

У вегетирующих 1.5-месячных растений, выросших на почвогрунте, анализировали биохимические параметры листьев разных ярусов, при этом ввели понятия: молодые, зрелые и стареющие листья. В качестве параметров для выделения групп листьев использовали площадь пластинки и интенсивность ее окраски. Молодыми листьями считали активно растущие листья, зрелыми – завершившие растяжение листовой пластинки, стареющими – теряющие интенсивность зеленой окраски (данные не приведены). Для характеристики физиологического состояния листьев дополнительно анализировали интенсивность перекисного окисления липидов (ПОЛ) и уровень свободного пролина (Про). Для анализа листья брали в утренние часы (через 2 ч после начала освещения).

У цветущих 3-месячных растений природной популяции оценивали уровень Фл в различных органах (корень, листья цветочного побега, соцветия).

У каллусных (6 и 92 пассаж) и суспензионных (10 пассаж) культур определяли ростовые показатели и содержание индивидуальных Фл и суммы ФС.

Получение стерильных проростков. Сухие семена лихниса стерилизовали раствором, содержащим 96% С₂Н₅ОН : Н₂О : 33% Н₂О₂ в соотношении 13 : 1 : 1 по объему [12]. Для этого семена помещали на 15 мин в чашки Петри на стерильные бумажные фильтры, смоченные стерилизующим раствором, в ламинарном боксе БМБ-II-“Ламинар-С”-1.8 (Neoteric, Россия), затем высушивали в потоке воздуха ламинара и перед посевом обрабатывали под УФ в течение 2 мин. Семена (по 15–20 шт.) переносили в сосуды для культивирования на 50% безгормональную питательную среду Мурасиге-Скуга (MС-среда) [13], содержащую 4.5 г/л агара, 15 г/л сахарозы и 0.5 мг/л каждого витамина (тиамин, никотиновая кислота, пиридоксин), рН 5.7‒5.8. Из стерильных семян в асептических условиях выращивали 5- и 14-дневные растения. У 5-дневных растений лихниса семядольные листья достигали 6‒8 мм и появился первый настоящий лист (рис. 1а), тогда как у 14-дневных растений начала формироваться розетка из двух настоящих листьев размером 10‒15 мм (рис. 1б), корни имели длину около 10 мм. Растения были рассечены на разные структурные элементы (корень, гипокотиль, основание побега – стебель с почками, семядоли), которые были использованы в качестве эксплантов.

 

Рис. 1. Стерильные 5- (а) и 14-дневные (б) растения Lychnis chalcedonica; каллусная культура линий 5Г (в), 14ОП (г), 5К (д) и 14К (е) через 25 суток культивирования (6 пассаж); суспензионная культура (ж) и ее клетки (з). Экспланты: Г – гипокотиль, ОП – основание побега, К – корень. Размер бара – 100 мкм.

 

Получение каллусных культур. Экспланты переносили на 50% МС-среду, содержащую гормоны НУК (2 мг/л) и БАП (0.5 мг/л) и культивировали в темноте при температуре 23 ± 1°С. Полученный от эксплантов каллус переносили вместе с эксплантом на свежую МС-среду того же состава, а при хорошем приросте каллуса его отделяли от экспланта и культивировали отдельно [1]. Для получения каллуса от эксплантов гипокотиля использовали стерильные 5-дневные растения лихниса (рис. 1а). Размер гипокотиля в этот период не превышал 2‒3 мм, что замедляло образование каллуса, однако позднее выделение гипокотиля из растений было затруднено, так как уже с 4‒5 суток начинался следующий этап развития – формирование побега с узлами и настоящими листьями. Оптимальным возрастом растений для выделения эксплантов из семядольных листьев были 5 сутки. В этом возрасте семядольные листья достигали длины 8‒10 мм (рис. 1а). На эксплантах, взятых с 14-дневных растений, наблюдали менее интенсивное каллусообразование (рис. 1б). Первичный каллус формировался плотным и имел светло-зеленую или желто-зеленую окраску.

Из полученных каллусов было отобрано несколько линий для дальнейшего культивирования: 5Г, 14СЛ, 14К, 14ОП (рис. 1в, 1г, 1д, 1е). Отбор проводили по следующим критериям: сохранение разнообразия исходных эксплантов; отсутствие посторонних морфогенных структур на первичном каллусе; стабильный рост; хорошая выживаемость, отсутствие значительных некрозов.

Получение суспензионной культуры корня. Суспензионную культуру лихниса получали из длительно культивируемой каллусной культуры корня (92 пассаж), которую помещали в плоскодонные конические колбы Эрленмейера с жидкой МС-средой. Колбы размещали на орбитальном шейкере Multi PSU-20 BIOSAN (SIA Biosan, Латвия), режим перемешивания (100‒110 об/мин), температура 25‒26°С. Исходная навеска каллусной культуры (4 г) была помещена в 50 мл МС-среды. Через 21 сутки было проведено первое пассирование с последующим 10‒15-кратным субкультивированием через каждые 14 суток. За это время суспензионная культура перешла к экспоненциальной стадии роста и представляла собой мелкие клеточные агрегаты и отдельные клетки (рис. 1ж, 1з).

Ростовые параметры культур. Используя гравиметрический метод, определяли свежую (FW) и абсолютно сухую (DW) биомассу каллусов с помощью аналитических весов PA-114 (Ohaus, КНР). Сухую биомассу в последующем использовали для оценки содержания в ней антиоксидантов фенольной природы, в том числе Фл.

Оценку относительного прироста культуры на 28 сутки производили по формуле:

РИ₂₈ = (М₂₈ – М₀)/М₀, (1)

где М₂₈ – конечная сырая или сухая масса каллусов (на 28 сутки субкультивирования, М₂₈), М₀ – начальная биомасса каллуса [14].

Растворимые фенольные соединения (ФC) определяли по методу Фолина-Дениса [15]. Оптическую плотность раствора измеряли при 725 нм против контроля, содержащего этанол вместо тканевого экстракта. Суммарное содержание ФC рассчитывали в пересчете на рутин и DW.

Спектрофотометрическое определение общего содержания флавоноидов. Определение суммарного содержания флавоноидов (Фл) основано на их комплексообразовании с хлоридом алюминия и последующем измерении оптической плотности окрашенных растворов при 415 нм на спектрофотометре Genesys 10S UV-Vis (ThermoScientific, США) [16]. Суммарное содержание Фл рассчитывали в пересчете на рутин и DW.

ВЭЖХ-анализ флавоноидов. Количественное определение Фл проводили методом ВЭЖХ с использованием жидкостного хроматографа Agilent 1260 Infinity с детектором на диодной матрице DAD (Agilent Technologies Inc., США). Использовали оригинальную колонку Zorbax Eclipse Plus C18 (4.6 мм × 100 мм × 3.5 мкм). Обнаружение пиков проводили в диапазоне от 190 до 390 нм. Длина волны обнаружения рутина составила 254 нм, кверцетина – 290 нм, дигидрокверцетина – 360 нм. Разделение проводили с использованием смеси ацетонитрила и 0.04 М калия фосфорнокислого монозамещенного с ортофосфорной кислотой в качестве подвижной фазы (pH 2.8). Скорость потока элюента составила 0.25 см³/мин. Идентификацию индивидуальных Фл в каждом экстракте определяли путем сравнения времени удерживания и УФ-спектров образцов с данными стандартов: рутина гидрата (содержание основного вещества более 95%) (Merck, Германия), КВ (содержание основного вещества не менее 98%) (Россия), ДГКВ (содержание не менее 90%, ГОСТ 33504) (Россия) (рис. 2а, б, в).

 

Рис. 2. Хроматографическое разделение флавоноидов стандартных растворов: а – рутин (Ru) С = 0.1 мг/см³, λ = 254 нм (время выхода – 16.691 ± 0.080 мин); б – дигидрокверцетин (DQ) С = 0.1 мг/см³, λ = 290 нм (время выхода – 17.252 ± 0.090 мин); в – кверцетин (Q) С = 0.1 мг/см³, λ = 360 нм (время выхода – 24.220 ± 0.050 мин).

 

Для количественного определения Фл в растительном сырье навеску образца для анализа (около 1 г) абсолютно сухого растительного сырья экстрагировали 70% раствором этилового спирта (10 – 20 мл, в зависимости от образца). Колбу присоединяли к рефлюкс-конденсатору и нагревали на кипящей водяной бане в течение 60 мин. После охлаждения фильтровали через целлюлозный фильтр [17].

Содержание Фл в растительном сырье определяли путем сравнения площади пиков, полученных при разделении индивидуальных Фл в пробе и соответствующих веществ в рабочих стандартных образцах.

Массовую концентрацию Фл рассчитывали по формуле:

Х = (S_x × С × V × 10) / (S_рсо × 25 × m), (2)

где S_x – площадь пика определяемого Фл в подготовленной пробе; S_рсо – площадь пика рабочего стандартного раствора Фл; С – концентрация Фл в рабочих стандартных образцах, мг/см³ (0.1 мг/см³); m – навеска пробы, г; V – объем этилового спирта, добавленного для экстракции Фл, см³ [18].

Пример разделения Фл в растительном сырье приведен на рис. 3а, 3б.

 

Рис. 3. Пример определения дигидрокверцетина (DQ) и кверцетина (Q) в растительном сырье: а – DQ, время выхода – 17.170 мин; б – Q, время выхода – 24.235 мин.

 

Выбор данных представителей Фл был основан на их функциях в человеческом организме (для КВ – противовоспалительная, антиоксидантная, антидепрессивная, противоопухолевая) [19] и метаболической связи [20, 21]. ДГКВ преобразуется в КВ с помощью фермента FLS (флаванолсинтазы) под контролем MYB11/12/111 (рис. 4). Гликозилирование КВ с образованием Р происходит в 2 этапа: F3GT (флавонол-3-О-глюкозилтрансфераза) превращает КВ в изокверцитрин (кверцетин-3-О-глюкозид), а затем F3G6″RhaT (флавонол-3-О-глюкозид-6"-O-рамнозилтрансфераза) превращает изокверцитрин в Р (кверцетин-3-О-рутинозид).

 

Рис. 4. Структурные формулы исследуемых флавоноидов и ферменты их биосинтеза. 1 – общая формула; 2 – дигидрокверцетин; 3 – кверцетин; 4 – изокверцитрин; 5 – рутин; D – FLS (флаванолсинтаза); E – F3GT (флавонол-3-О-глюкозилтрансфераза); F – F3G6″RhaT (флавонол-3-О-глюкозид 6"-O-рамнозилтрансфераза).

 

Спектрофотометрическое определение интенсивности перекисного окисления липидов. Интенсивность ПОЛ определяли по содержанию МДА, по цветной реакции с тиобарбитуровой кислотой (ТБК) [22]. Для этого образец листьев измельчали в 20% растворе ТХУ. Экстракт центрифугировали на центрифуге Eppendorf 5430R (Eppendorf, Германия) в течение 15 мин при 12000 g и температуре 4°C. Цветную реакцию аликвоты супернатанта с ТБК проводили при 98°C в течение 30 мин. Оптическую плотность раствора с образовавшимся розовым хромогеном измеряли при двух длинах волн − 532 и 600 нм на спектрофотометре Genesys 10S UV-Vis (ThermoScientific, США).

Спектрофотометрическое определение свободного пролина (Про). Уровень Про определяли по реакции с нингидрином в кислой среде [23] и измерению оптической плотности раствора при 520 нм.

Статистический анализ. Для сравнения параметров использовали параметрический t-критерий Стьюдента и непараметрический U-критерий Манна-Уитни для попарного сравнения групповых параметров. На рисунках представлены средние арифметические (M) значения для роста и биохимических (n = 5) параметров с двухсторонними доверительными интервалами (M ± 1.96 × SEM). Различия между значениями, отмеченными разными надстрочными латинскими буквами, были статистически значимыми при Р ≤ 0.05.

РЕЗУЛЬТАТЫ

В ходе исследования изучены темпы роста 4-х линий 28-дневной каллусной культуры L. chalcedonica, эксплантами для которой служили гипокотили (5-дневные растения), корень, основание побега – нижняя часть стебля с почками и семядоли (14-дневные растения). Проведен биохимический анализ образцов растений природной популяции (у листьев разного физиологического состояния и разных органов растений) и каллусных культур на общее содержание Фл и содержание Р, КВ и ДГКВ (таксифолина). Последний представляет собой КВ, гидрированный в положениях 2 и 3 (рис. 4). Определен общий пул фенольных соединений у длительных каллусной и суспензионной культур, полученных от эксплантов корня лихниса.

Эффективность каллусообразования на различных эксплантах определяли при их культивировании на МС-среде с гормонами НУК (2 мг/л) и БАП (0.5 мг/л) в темноте и температуре 24 ± 1°С. Начало индукции каллуса наблюдали через 12‒14 суток от начала культивирования на всех типах эксплантов. Первичный каллус лихниса имел белый, светло-желтый или светло-зеленый цвет, плотную (от эксплантов семядольных и настоящих листьев) или рыхлую, оводненную (от эксплантов гипокотилей и корней) консистенцию.

Каллусные культуры лихниса к пятому пассажу утрачивали явно выраженные внешние различия, были светло-желтого цвета, преимущественно рыхлые, рассыпчатые, легко распадались на отдельные фрагменты массой 15–30 мг (рис. 1в–е). При этом линии 5К и 14К были светлее и плотнее (рис. 1д, е). В ходе субкультивирования оптимальную продолжительность пассажа для сохранения жизнеспособности культуры сокращали с 35 до 28 суток.

Спектрофотометрически и методом ВЭЖХ проанализировали суммарное содержание Фл (табл. 1) и трех индивидуальных Фл в растениях L. chalcedonica на стадии вегетации и репродукции, а также в культурах in vitro, полученных от эксплантов отдельных органов молодых растений (рис. 5).

 

Таблица 1. Содержание метаболитов в листьях разных ярусов растений лихниса в фазу вегетации

Ярусы	Физиологическое состояние листьев	МДА, мкмоль/г FW	Пролин, мкмоль/г FW	Флавоноиды, %
7–9 4–6 1–3	молодые зрелые стареющие	0.01 ± 0.001с 0.02 ± 0.002b 0.04 ± 0.002a	0.709 ± 0.01c 0.827 ± 0.02b 1.582 ± 0.03a	0.186 ± 0.01b 0.234 ± 0.02a 0.094 ± 0.01c

Примечание. Одинаковыми надстрочными латинскими буквами обозначены величины, различия между которыми не достоверны при P ≤ 0.05.

 

Рис. 5. Содержание индивидуальных флавоноидов в органах цветущих растений Lychnis chalcedonica, культивируемых в природной популяции, и в длительной каллусной и суспензионной культурах корней. 1 – рутин; 2 – кверцетин; 3 – дигидрокверцетин. Одинаковыми латинскими буквами обозначены величины, различия между которыми не достоверны при P ≤ 0.05.

 

Биохимический анализ растений L. chalcedonica, выросших в почвенной культуре в лабораторных условиях, показал, что содержание метаболитов, в том числе и суммарное содержание Фл, изменялось в зависимости от физиологического состояния листьев – их индивидуального возраста (разного яруса) (табл. 1).

На вегетативной стадии развития растений в почвенной культуре отмечали изменение интенсивности ПОЛ, оцениваемой по содержанию МДА, в листьях разных ярусов, а, следовательно, разного времени закладки и индивидуального возраста листа. Это, возможно, было связано с физиологическим состоянием листьев в процессе их формирования. По данным анализа интенсивность ПОЛ повышалась от листьев верхних ярусов (7‒9, молодые) к листьям нижних ярусов (1‒3, стареющие), т.е. молодые активно растущие листья имели меньшую интенсивность ПОЛ. Вслед за увеличением окислительного статуса листа активировались антиоксидантные системы клеток листа, включающие увеличение уровня Про и суммарного уровня Фл (табл. 1). Однако при формировании систем защиты отмечено взаимовлияние их представителей: двукратное увеличение Про в стареющих листьях приводило к аналогичному снижению суммарного содержания Фл.

При исследовании цветущих растений природной популяции обнаружили органоспецифичность в накоплении индивидуальных Фл (рис. 5). В корнях присутствовал преимущественно ДГКВ, тогда как в соцветиях и верхних листьях – Р. Анализ индивидуальных Фл показал тенденцию уменьшения Р в ряду органов: соцветие ≥ листья > корень. В распределении КВ показана обратная Р зависимость корень ≥ листья > соцветие, однако с существенно меньшим абсолютным уровнем этого Фл. Содержание ДГКВ в листьях было в 1.9 раза меньше (P < 0.05), чем в соцветии. В то же время уровень этого Фл в корнях был многократно выше (P < 0.05), чем в надземных органах.

Длительно культивируемая каллусная культура (92 пассаж), полученная от эксплантов корня, аккумулировала к 30 суткам в 2.7 и 1.5 раза больше Р и КВ соответственно и на 35% меньше ДГКВ, чем корень растений природной популяции (рис. 3). В то же время полученная из каллуса суспензия (10 пассаж) на 14 сутки имела близкое содержание Р и ДГКВ с исходной линией каллусной культуры. При этом, однако, существенно снижался уровень КВ.

Многократно больший уровень ДГКВ (P < 0.05) в каллусной культуре, полученной от эксплантов корня растений лихниса, согласуется с его высоким уровнем в корне интактного цветущего растения. Однако специфика существования клеток в составе каллусной ткани определяла особенности метаболизма Фл. Каллусная культура корня в сравнении с интактным органом 2.7-кратно увеличивала содержание Р и 1.5-кратно – КВ (P < 0.05). У активно растущей суспензионной культуры на стационарной фазе к 14 суткам снижалось содержание Р и КВ (P < 0.05) относительно исходной каллусной культуры. На основе полученных данных можно предположить возможное участие Фл в регуляции роста культуры за счет их антиоксидантных или регуляторных свойств.

Установив схожие уровни ДГКВ корня интродуцированных растений и длительной культуры корня in vitro, мы повторно получили каллусные культуры от разных эксплантов (корень, гипокотиль, основание побега, семядоля) 5- и 14-дневных растений, выросших в пробирках (рис. 1а, 1б).

Наибольший относительный прирост сырой массы на 28 сутки и обводненность клеток отмечены у гипокотильной линии, полученной от эксплантов 5-дневных растений (табл. 2). В то время как каллусные культуры, полученные от эксплантов более взрослых растений (14-дневных) имели меньший прирост сырой массы и обводненность, но большую сухую массу.

 

Таблица 2. Ростовые характеристики разных линий каллусной культуры лихниса на 28 сутки субкультивирования (6 пассаж)

Линия	Возраст проростков, сут	Эксплант	Относительный прирост FW	Содержание DW, %	Обводненность, %
5Г 14СЛ 14ОП 14К	5 14 14 14	гипокотиль семядольный лист основание побега корень	8.67 ± 0.50a 4.36 ± 0.20c 5.51 ± 0.26b 4.23 ± 0.25c	6.72 ± 0.18d 8.64 ± 0.15a 7.32 ± 0.23c 7.80 ± 0.22b	93.28 ± 0.18a 91.36 ± 0.15d 92.68 ± 0.23b 92.20 ± 0.22c

Примечание. Одинаковыми надстрочными латинскими буквами обозначены величины, различия между которыми не достоверны при P ≤ 0.05.

 

Биохимический анализ индивидуальных Фл показал, что каллус, полученный на основе более молодых тканей гипокотиля 5-дневных проростков, имел следовые количества изученных Фл (табл. 3). В то время как более зрелые ткани основания побега (нижняя часть стебля с почками) 14-дневных проростков формировали каллус с более высокими уровнями разных представителей Фл.

 

Таблица 3. Содержание индивидуальных флавоноидов в разных линиях каллусной культуры лихниса на 28 сутки субкультивирования (6 пассаж)

Линия	Эксплант	Возраст проростков, сут	Содержание флавоноидов, мкг/г DW
			рутин	кверцетин	дигидрокверцетин
5Г 14СЛ 14ОП 14К	гипокотиль семядоля основание побега корень	7 14 14 14	менее 0.01c 170.4 ± 24.7b 333.7 ± 53.4a 394.5 ± 47.3a	менее 0.01b менее 0.01b менее 0.01b 264.4 ± 39.7a	менее 0.01c 96.6 ± 14.5b 1284.0 ± 115.0a менее 0.01c

Примечание. Одинаковыми надстрочными латинскими буквами обозначены величины, различия между которыми не достоверны при P ≤ 0.05.

 

Отмечена специфика в накоплении индивидуальных Фл у разных линий каллусной культуры лихниса (табл. 3). В побеговой и корневой линиях культуры шестого пассажа содержалось одинаковое количество Р, тогда как в семядольной линии его количество было в 2 раза меньше. Корневая линия содержала КВ, уровень которого был в 1.5 раза меньше по сравнению с уровнем Р. В других культурах обнаружены только следовые количества КВ. Содержание ДГКВ в побеговом каллусе было в 13 раз больше такового в семядольной линии и в 4 раза больше, чем Р в анализируемой линии. Наибольший прирост сырой массы и обводненность клеток отмечены у гипокотильной линии, имеющей следовые количества изученных Фл. Тогда как наибольший прирост сухой массы семядольной культуры происходил на фоне меньшего содержания изученных групп Фл.

ОБСУЖДЕНИЕ

Исследования показали зависимость содержания ФС и Фл от физиологического состояния (возраста) листьев вегетирующих растений L. chalcedonica (табл. 1), что согласуется с ранее полученными нами данными для листьев разных ярусов Lactuca sativa [24]. Во взрослых и стареющих листьях L. sativa содержание Фл было в 4 и 6 раз выше соответственно, чем в молодых листьях [24]. Это свидетельствовало об усилении синтеза ВМ с завершением активного роста листа. Полученные нами данные согласуются также с информацией о фотоингибировании биосинтеза Фл на ранней стадии развития волокна Gossypium hirsutum в культуре in vitro, в то же время стимулировании этого процесса – на более поздних стадиях [25]. Однако непропорциональное увеличение уровня Фл у стареющих листьев L. chalcedonica относительно увеличения интенсивности ПОЛ, вероятно, было обусловлено подключением к стабилизации окислительного статуса тканей других антиоксидантных метаболитов, например, Про.

Взаимосвязь уровня ВМ с интенсивностью ростовых процессов также показана на культуре in vitro. Суммарное содержание ФС у суспензионной культуры корня лихниса на 14 сутки субкультивирования соответствовало уровню этих соединений у каллусной культуры корня на 28 сутки (табл. 4). При относительно меньшем (на 30%) приросте сырой массы суспензионной культуры (4.7 ± 0.3) на 14 сутки относительно каллусной культуры (6.75 ± 0.41) на 28 сутки отмечалось более раннее увеличение содержания ФС.

 

Таблица 4. Относительный прирост сырой массы и содержание фенольных соединений (ФС) в каллусной и суспензионной культурах лихниса

Тип культуры	Время культивирования, сут	Относительный прирост FW	Содержание ФС, мг/г DW
Каллусная Каллусная Суспензионная	28 35 14	6.75 ± 0.46a 5.54 ± 0.26b 4.75 ± 0.35c	10.72 ± 0.20a 9.11 ± 0.32b 11.40 ± 0.80a

Примечание. Одинаковыми надстрочными латинскими буквами обозначены величины, различия между которыми не достоверны при P ≤ 0.05.

 

В то же время сравнение содержания индивидуальных Фл в этих культурах показало снижение уровня КВ в более быстрорастущей суспензионной культуре (рис. 3). Нельзя исключить и высвобождение в питательную среду Фл, содержание которых предполагаем изучить в дальнейшем. Полученные данные свидетельствуют о возможном участии КВ в регуляции роста суспензионной культуры. В соответствии с нашими более ранними исследованиями [26] показана зависимость конечного ростового индекса по сырой массе семядольной линии каллусной культуры Saussurea orgaadayi V. Khan. and Krasnob от суммарного содержания Фл. Максимальное 3.5-кратное увеличение конечного ростового индекса по сырой массе, отмеченное у каллусной культуры на питательной среде с 1 мкМ мета-хлорбензгидрилмочевины (индуктора монооксигеназной системы человека, ключевые ферменты которой относятся к суперсемейству цитохромов Р-450 – CYP), происходило на фоне снижения суммы Фл на 83% [26]. Другими исследователями показано влияние Фл на регуляцию клеточного цикла [27, 28].

Самыми значимыми свойствами Фл как биологически важных активных компонентов считаются их антиоксидантные свойства и способность регулировать функции ферментов [29, 30]. Фл способны прямо или косвенно ослаблять или предупреждать клеточные повреждения, в том числе разрушение клеточных мембран, вызываемые свободными радикалами [30]. Фл могут осуществлять свой антиоксидантный эффект с помощью следующих механизмов: прямого скавенирования АФК и азота; редукции альфа-токоферильных радикалов; активации антиоксидантных ферментов и/или низкомолекулярных антиоксидантов; хелатирования переходных металлов; ингибирования оксидаз. В зависимости от концентрации Фл и экзогенных факторов одни и те же Фл могут проявлять как антиоксидантные, так и прооксидантные свойства. В свою очередь небольшая степень оксидативного стресса, индуцируемая некоторыми Фл, активирует антиоксидантную защиту организма путем стимулирования экспрессии генов антиоксидантных ферментов и таким образом усиливает процессы цитопротекции.

В соответствии с данными других авторов существует тесная взаимосвязь между химической структурой и антиоксидантной активностью Фл, что лежит в основе различий активности изученных индивидуальных Фл [31]. КВ является более эффективным антиоксидантом по сравнению с ДГКВ. Предполагают, что именно наличие двойной связи между 2 и 3 углеродами в С-кольце у КВ необходимо для проявления ингибирующей активности. Так же показано, что КВ сильнее ингибирует ПОЛ и обладает более высокой радикал-защитной способностью, чем Р [32].

Известно, что рост клеток растений контролируется гормонами, прежде всего ауксинами. С другой стороны, Фл регулируют транспорт индол-3-уксусной кислоты (ИУК) и ее метаболизм [8, 33], что может отразиться на ростовых процессах. Производные КВ являются ингибиторами базипетального транспорта ауксина, гравитропизма и роста корня удлинением.

Показана зависимость роста клеточной культуры и биосинтеза ВМ от природы ауксинов [34]. 2,4-Д активирует пролиферацию, но снижает синтез ВМ, тогда как НУК вызывает цитодифференцировку, приводящую к замедлению и остановке роста культуры, но активирует образование вторичных соединений.

В исследовании Bota и Deliu [35] показана зависимость флавоноидного пути от цитокининов (ЦК). Дефект передачи сигналов ЦК индуцировал экспрессию нескольких регуляторных генов, таких как MYB11, MYB111, PRODUCTION OF ANTHOCYANIN PIGMENT 1 (PAP1/MYB75), PAP2/MYB90, TRANSPARENT TESTA GLABRA 2 (TTG2) и ТТ8, тем самым модулируя накопление флавонолов и антоцианов до и после стресса.

При выращивании клеточной культуры очень важно использовать оптимальное соотношение концентраций ауксинов и ЦК [34], поскольку ЦК в зависимости от природы и концентрации могут модулировать действие ауксинов.

В нашем эксперименте культуры in vitro, выращенные на МС-среде с 2 мг/л НУК и 0.5 мг/л 6-БАП, поддерживали активный рост и накопление Фл (табл. 4). Наши результаты согласуются с данными других авторов. Оценку эффективности соотношения ауксинов и ЦК для регуляции ВМ провели Liu и Saxena [36]. Авторы протестировали три ауксина (2,4-Д, ИУК, НУК) и один ЦК (БАП) в различных сочетаниях и концентрациях. Для всех вариантов отмечено увеличение количества Фл с возрастом суспензионных культур (14 дней субкультивирования). Наибольшая продукция Фл была достигнута в суспензионных культурах клеток S. medusa при использовании комбинации 2 мг/л НУК и 0.5 мг/л БАП [36]. Ауксины НУК и ИУК сильнее стимулировали биосинтез Фл, чем 2,4-Д. Увеличение концентрации ИУК и БАП значительно (в 3 раза) снижало количество Фл. Усиление продукции Фл показано также для суспензионной культуры Digitalis lanata после обработки 0.1 мг/л ИУК и 1 мг/л БАП [35], однако для другой линии этой культуры значимым была иная комбинация гормонов 0.1 мг/л НУК и 1 мг/л БАП. Нами ранее показано, что каллусная культура S. orgaadayi двукратно увеличивала суммарное содержание эндогенных Фл при переходе от экспоненциального роста в стационарную фазу при субкультивировании на МС-среде, содержащей 0.8 мг/л 2,4-Д и 0.5 мг/л БАП [26].

Другими авторами показано, что рост и выработка биологически активных соединений клеточной суспензионной культурой Elaecarpus grandiflorus сильно зависели не только от типа, но и концентрации регуляторов роста [37]. Наибольшая продукция Фл была получена в культурах клеток, поддерживаемых на среде WPM (Woody Plant Medium) с добавлением 2.5 ppm 2,4-Д (1.575 мг КВ/г DW), а наименьшая – 3.5 ppm 2,4-Д. Показана видоспецифичность в накоплении Фл представителями одного и того же рода. Производство Фл культурой E. grandiflorus ниже, чем производство Фл культурой S. burahol [38]. На уровень Фл влияет и содержание их предшественников. Было обнаружено, что каллусные культуры Anthocephalus indicus, выращенные на среде WPM с добавлением 3 мг/л БАП и 100 мг/л фенилаланина, продуцировали 77.2 ± 1.92 и 104.4 ± 4.39 мг Фл/г сухой массы соответственно [39].

Опираясь на данные гормональной регуляции пролиферации клеток и содержания Фл, нами планируется изучение эндогенного уровня фитогормонов (ауксинов и цитокининов) и содержания Фл в культурах L. chalcedonica in vitro и питательных средах.

Таким образом, нами показано, что молодая каллусная культура L. chalcedonica способна синтезировать БАВ, содержащиеся как в побеге, так и в корне интактных растений. На уровень Фл влияет возраст растений, с которых отделены экспланты. Установлена органная специфика в накоплении Р, КВ и ДКВ. На примере культуры in vitro показана динамика трех Фл при получении суспензионной культуры из каллусной культуры.

Исходя из полученных данных, можно заключить, что присутствие Фл в исследуемом экдистерон-содержащем виде L. chalcedonica делает его более перспективным для использования в качестве лекарственного сырья. Кроме того, каллусная и суспензионная культуры лихниса хальцедонского являются полноценным заменителем растений природной популяции по содержанию трех исследованных Фл.

Данная работа была поддержана Программой развития Томского государственного университета (Приоритет 2030).

Авторы выражают благодарность центру “Физико-химические методы анализа” Томского политехнического университета за помощь в количественном определении флавоноидов.

Настоящая статья не содержит каких-либо исследований с участием людей и животных в качестве объектов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Об авторах

И. Ф. Головацкая

Федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего образования “Национальный исследовательский Томский государственный университет”

Автор, ответственный за переписку.
Email: golovatskaya.irina@mail.ru
Россия, Томск

Ю. В. Медведева

Федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего образования “Национальный исследовательский Томский государственный университет”

Email: golovatskaya.irina@mail.ru
Россия, Томск

М. К. Кадырбаев

Федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего образования “Национальный исследовательский Томский государственный университет”

Email: golovatskaya.irina@mail.ru
Россия, Томск

Е. В. Бойко

Федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего образования “Национальный исследовательский Томский государственный университет”

Email: golovatskaya.irina@mail.ru
Россия, Томск

Список литературы

Дополнительные файлы