Comparative characteristics of the lipidome of Cycas revoluta and C. rumphii (Cycadaceae)

Full Text

В последние годы, в связи с расширенным поиском новой объективной информации о фенотипе растений, все чаще используются химические характеристики, полученные методами “омиксных” экспериментальных дисциплин – протеомики, метаболомики, липидомики (Tugizimana et al., 2018; Sharanya et al., 2020; Kaur et al., 2021). В их основе лежат данные о составе и содержании высоко- и низкомолекулярных соединений, полученные с использованием целого ряда гибридных методов анализа, сочетающих разделение смеси метаболитов и определение ее отдельных компонентов. К таким методам относится, например, высокоэффективная жидкостная хроматография с масс-спектрометрическим детектированием (ВЭЖХ-МС). Получаемые с ее помощью массивы данных в сочетании с молекулярными данными и классическими морфологическими, анатомическими и кариологическими характеристиками могут быть использованы в систематике и филогении растений для решения спорных вопросов, касающихся, например, разграничения таксонов (хемосистематика), а также в филогенетических реконструкциях (Reynolds, 2007). Однако на практике, в связи с недостаточной теоретической базой, использование химических признаков для подобных целей затруднено. Так, например, обнаружение сходных по структуре алкалоидов с пиперидиновым циклом у представителей далеких в филогенетическом отношении родов Conium (Apiales), Sarracenia (Ericales), Aloe (Asparagales) долгое время не находило объяснения, пока не было установлено, что они могут образовываться различными метаболически не связанными путями из ацетата или лизина (Reynolds, 2005). В то же время, как уже было неоднократно продемонстрировано нашей научной группой, отсутствие функционально значимого соединения первичного метаболизма в конкретном образце может быть проявлением дифференциальной экспрессии соответствующих генов у данного вида на определенном этапе развития (Senik et al., 2023) или под влиянием внешних условий (Kiseleva, Kotlova, 2008; Senik et al., 2012, 2015).

Тем не менее с развитием “омиксных” технологий и накоплением знаний о весе тех или иных химических признаков, характеристики протеома и метаболома все чаще используются для решения задач систематики и филогении. Наиболее активно это направление развивается в биологических дисциплинах, предметом изучения которых являются организмы с минимальным количеством морфологических признаков, но с максимально полно секвенированными и аннотированными геномами. Так, группе P. Engel методами LC-QTOF-MS метаболомики, на основании результатов анализа вторичных азот-содержащих соединений из семейства колибактинов, удалось выделить новый род энтеробактерий и показать его филогенетические связи с другими представителями этой обширной группы бактерий (Engel et al., 2015). Появились публикации, в которых изложены результаты использования метаболомных методов в систематике цветковых растений, в частности, для 8 видов Paeonia (He et al., 2014), 19 видов Dioscorea (Price et al., 2016) и 55 видов Euphorbia (Geltman et al., 2016; Petrova et al., 2023). Причем для отдельных видов рода Euphorbia дополнительно была охарактеризована популяционная изменчивость метаболома (Kotlova et al., 2018), а также его динамика в онтогенезе (Sazanova et al., 2019). Весьма успешно данный подход был использован для разграничения комплекса видов из рода Olearia (Asteraceae) (Messina et al., 2013, 2014, 2021). Полученные результаты позволили авторам заключить, что метаболомика имеет большой потенциал в таксономии цветковых растений, особенно для проверки границ близкородственных таксонов, где данные о последовательностях ДНК пока оказались неинформативными. При этом особое значение отводится большим массивам химических данных, позволяющим внести существенный вклад в фенетическую характеристику таксонов (хемофенетика) (Zidorn, 2019). Такие массивы могут быть созданы по результатам LC-QTOF-MS метаболомного профайлинга вторичных или, согласно современной терминологии, специализированных метаболитов, отличающихся особым структурным разнообразием, а также тех соединений первичного метаболизма, которые имеют целую сеть структурных гомологов. Ко второй группе, безусловно, можно отнести глицеролипиды. Особенностью их структуры является ограниченное разнообразие гидрофильных частей (полярных групп), определяющих класс липида, и исключительная гетерогенность гидрофобной части (Harayama, Riezman, 2018). Составляющие ее жирные кислоты могут варьировать по длине углеводородной цепи, количеству и положению двойных связей, а также функциональных групп, и, наконец, общему количеству жирных кислот в молекуле липида. В связи с этим, диацильные (с двумя жирными кислотами) липиды, к которым относятся большинство классов мембранных глико- и фосфолипидов, характеризуются значительно большей гетерогенностью, по сравнению с моноацильными липидами. Максимальная структурная гетерогенность характерна для триацилглицеринов, содержащих три жирные кислоты. Показано, что наличие определенных молекулярных форм липидов является таксоноспецифичным признаком (Řezanka et al., 2018).

Тем не менее липидомика, которая изучает многообразие, распределение и функции отдельных молекулярных форм липидов, в первую очередь глицеро- и сфинголипидов, в ботанических исследованиях используется сравнительно редко, поскольку для анализа материала требует особых высокотехнологичных подходов. Значительные трудности, связанные с получением липидомных данных, объясняются особенностями структуры молекул липидов, среди которых выявляется большое количество изомеров с одинаковой молекулярной массой, что не позволяет применять многие широко используемые в протеомике и метаболомике автоматические режимы анализа, основанные на различиях точных масс соединений. Не мень- ше затруднений вызывает интерпретация липидомных данных. Действительно, вес признаков, связанных с химической гетерогенностью класса, может зависеть от особенностей метаболизма, клеточной локализации и функций.

Целью настоящей работы являлся сравнительный анализ четырех классов мембранных глицеролипидов на предмет их молекулярной гетерогенности и возможной видоспецифичности. Среди них – два основных класса гликолипидов, являющихся структурной основой хлоропластов, и два основных класса фосфолипидов, формирующих плазматическую мембрану и мембраны внехлоропластных субклеточных структур. Мы попытались ответить на вопрос, насколько различные классы липидов, принципиально отличающиеся метаболизмом и локализацией, могут отражать специфику растений на уровне таксонов высокого ранга и на видовом уровне. В качестве объекта исследования были выбраны реликтовые растения из семейства Cycadaceae – Cycas revoluta и C. rumphii, которые по предварительным данным липидомного профайлинга, проведенного для представителей покрытосеменных, голосеменных, папоротников и мохообразных, продемонстрировали ряд уникальных особенностей. Выбранные нами представители рода Cycas филогенетически достаточно далеко удалены друг от друга (по данным анализа транскриптомов 339 видов Cycas относятся к сестринским кладам), для них свойственны значительные различия в морфологии, анатомии, ареалах распространения (Liu et al., 2022). Было важно проследить, сохранятся ли существенные межвидовые различия при сопоставлении химических признаков, основанных на данных липидомики.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

В работе использованы растения из оранжерей Ботанического института им. В.Л. Комарова РАН (отдел Ботанический сад), включая 3 экземпляра Cycas revoluta Thunb. (8255: возраст и пол неизвестны; 6602: возраст и пол неизвестны; 6622: экземпляр из довоенной коллекции Ботанического сада, ≈150 лет, женское растение) и 1 экземпляр Cycas rumphii Miq., (59 лет, мужское растение). Латинские названия растений и авторы таксонов приведены в соответствии со стандартами, принятыми в базе данных International Plant Names Index. Все использованные растения содержались в условиях естественного освещения и умеренного полива при температуре +10 – +14°С (C. revoluta) или +18 – +22°С (C. rumphii). Для анализа липидома отбирали 1–2 сегмента из средней части перистых листьев, расположенных в средней части кроны (сбор материала проведен в ноябре 2023 г.).

Липиды экстрагировали в день сбора листьев смесью хлороформ–метанол (1 : 2) (Bligh, Dyer, 1959). Для этого предварительно измельченные листья растирали со смесью растворителей, гомогенат центрифугировали 10 мин. при 10000g и отбирали супернатант. Осадок ресуспендировали в той же смеси растворителей и повторно центрифугировали. К объединенной фракции экстрактов, очищенных путем центрифугирования от растительных волокон, добавляли 2.5% NaCl для разделения водно-метанольной и хлороформной фаз. Нижнюю хлороформную фазу, содержащую липиды, отбирали и упаривали на роторном испарителе (Ika, Германия).

Отдельные классы фосфо- и гликолипидов разделяли с помощью двумерной тонкослойной хроматографии на пластинках TLC Silica gel 60 10 × 10 см (Merck, Германия) в системе растворителей хлороформ–метанол–вода (65 : 25 : 4, по объему) в первом направлении и хлороформ–ацетон–метанол–уксусная кислота–вода (50 : 20 : 10 : 10 : 5, по объему) – во втором направлении (Benning et al., 1995). Разделенные классы липидов визуализировали в парах йода и идентифицировали, как описано ранее (Frolova et al., 2021). Липиды, соответствующие фосфатидилхолинам (ФХ), фосфатидилэтаноламинам (ФЭ), моно- (МГДГ) и дигалактозилдиацилглицеринам (ДГДГ), элюировали с силикагеля смесью хлороформ–метанол (1 : 1), силикагель осаждали центрифугированием 10 мин. при 15000g и отбирали супернатант, растворитель выпаривали, а выделенные липиды перерастворяли в 40 мкл метанола.

Структурное разнообразие молекулярных форм выделенных классов липидов определяли методом обращенно-фазовой ультравысокоэффективной жидкостной хроматографии с масс-спектрометрическим детектированием с ионизацией электрораспылением и тройным квадрупольным масс-анализатором (LC-ESI-QqQ-MS/MS) с использованием прибора Shimadzu LCMS-8030 с УВЭЖХ системой LC-30 Nexera (Shimadzu, Япония). Хроматографическое разделение молекулярных форм липидов проводили на колонке Kinetex C18 (2.6 μм, 2.1 × 150 мм, 100Å, Phenomenex) при следующих параметрах: скорость потока – 0.3 мл/мин., температура термостата – +50°C. В качестве подвижной фазы использовали смесь ацетонитрил–вода (1 : 1, по объему) (элюент А), 2-пропанол–ацетонитрил–вода (85 : 10 : 5, по объему) (элюент B), содержащие 5 mM муравьинокислый аммоний и 0.1% (по объему) муравьиную кислоту (Lange et al., 2021). Для разделения липидов использовали программу градиентного элюирования: 1 мин., 45% B; 11 мин., 90% B; 11.1 мин., 100% B; 15 мин., 100% B; 15.1 мин., 45% B; 16 мин., 45% B. Экспериментальные параметры ионного источника: скорость потока газа-распылителя 3.0 л/мин., скорость потока газа-осушителя 15.0 л/мин., температура газа-осушителя +250°C, температура блока-нагревателя +400°C, напряжение на капилляре 3.5 кВ (в положительной моде), 4.5 кВ (в отрицательной моде).

Протокол анализа профилей фосфо- и гликолипидов состоял из двух стадий: 1) нецелевой профайлинг для обнаружения максимального разнообразия молекулярных форм липидов данного класса с помощью сканирования ионов-предшественников по характеристическим для данного класса фрагментам и 2) целевой профайлинг для определения структуры молекулярных форм, выявленных на первой стадии, и их количества методом мониторинга множественных реакций (MRM). В рамках первого этапа ФХ анализировали в режиме сканирования иона-прекурсора по фрагменту полярной группы 184.1 m/z в положительной моде [М+Н]⁺ при энергии соударения (CE) 34 В. Молекулярные массы ФЭ и гликолипидов получали в режиме сканирования нейтральной потери 141.1 m/z в положительной моде [М+Н]⁺ при CE 20 В (ФЭ); 179.1 m/z в положительной моде [М+Н]⁺при CE 15 В (МГДГ); 341.1 и 359.1 m/z в положительной моде [М+Н]⁺ при CE 18 и 25 В (ДГДГ). Диапазон сканирования во всех случаях устанавливали 630–1050 m/z. На втором этапе целевой профайлинг ФХ и МГДГ проводили в режиме MRM в отрицательной моде [M+HCOOH]^– при CE 40 и 25 В, соответственно. Молекулярные виды ФЭ получали в отрицательной моде [М–Н]^– при CE 20 В, ДГДГ – в положительной моде [М+Н]⁺ при CE 45 В.

Обработку данных проводили в программах LabSolutions Postrun Analysis (Shimadzu) и Skyline (Adams et al., 2020).

Количественный расчет производили по площади хроматографических пиков MRM-переходов, значения нормализовали на сумму всех молекулярных форм данного класса. В качестве внешней калибровки использовали стандартную эквимолярную смесь молекулярных форм 13:0/13:0 ФХ, 16:0/16:0 ФХ, 16:0/18:2, 18:0/18:0 ФХ, 19:0/19:0 ФХ и 15:0/15:0 ФЭ (Avanti Polar Lipids, США).

Данные, полученные после статистической обработки эксперимента, проведенного в 3-х кратной биологической повторности (n = 3), представлены в виде М ± ϭ_M, где М – среднее арифметическое, ϭ_M – отклонение от среднего арифметического. Достоверность различий в составе и содержании липидов двух видов Cycas оценивали по критерию Стьюдента при доверительном уровне значимости P₁ = 95%. В статье обсуждаются только статистически значимые различия. Статистический анализ проводили с помощью Microsoft Excel.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Целевой UPLC-ESI-QqQ-MS/MS анализ липидома двух видов саговниковых из рода Cycas, включая C. revoluta и C. rumphii, показал, что основные классы фосфолипидов отличаются значительно большей гетерогенностью по сравнению с гликолипидами. У C. revoluta выявлено 38 молекулярных форм фосфатидилхолинов (ФХ) и 35 фосфатидилэтаноламинов (ФЭ) (рис. 1). C. rumphii мало отличался по общему количеству молекулярных форм фосфолипидов – 37 ФХ и 33 ФЭ. Однако распределение молекулярных форм липидов в профилях этих классов имело ряд характерных особенностей, специфичных для вида растения.

 

Рис. 1. Состав молекулярных форм фосфолипидов Cycas revoluta (серые столбцы) и С. rumphii (белые столбцы). Эксперимент проведен в трех повторностях (n = 3), бары обозначают стандартное отклонение.

Fig. 1. Phospholipid profiling of Сycas revoluta (grey bars) and C. rumphii (white bars). The experiments were performed in triplicate (n = 3), and error bars indicate standard deviations.

 

У C. revoluta в составе ФХ и ФЭ выявлено значительное содержание липидных молекул с С18:2¹ жирной кислотой, таких как ФХ 16:0_18:2², ФХ 18:2_18:3, ФХ 18:2/18:2, ФХ 18:0_18:2, ФЭ 16:0_18:2, ФЭ 18:2_18:3, ФЭ 18:2/18:2. С18:2 обнаружена также в составе редких молекулярных видов ФХ и ФЭ, содержащих в качестве второго ацильного компонента нечетную жирную кислоту (ФХ 18:2_19:0, ФЭ 17:0_18:2) или жирную кислоту с длинной цепью с 20–24 атомами углерода (ФХ 18:2_20:0, ФЭ 18:2_20:3, ФЭ 18:2_24:0). Наличие значительных количеств липидов, этирифицированных С18:2 кислотой у C. revoluta было отмечено в другой работе (Hashidoko et al., 2019). При этом показано, что в корнях C. revoluta С18:2, ассоциированная с другими жирными кислотами, например, с С16:0, в составе диацилглицеринов, может выступать в качестве химического фактора, индуцирующего образование гормогониев – коротких нитей цианобактерий рода Nostoc, эндосимбионтов цикадовых, локализованных в специализированных коралловидных корнях. Авторами исследования высказано предположение, что 16:0_18:2 диацилглицерины содержатся в экссудатах кончиков корней цикадовых и играют роль гормогоний-индуцирующих факторов, механизм действия которых связан с активацией протеинкиназы С. Последствием этой реакции на морфологическом уровне является активное дихотомическое ветвление кончиков боковых корней и образование в них воздушных полостей, которые заселяют виды Nostoc. Из такой структуры впоследствии образуется характерный для многих цикадовых коралловидный корень (кораллоид), функция которого связана с усвоением атмосферного азота, что обусловлено деятельностью населяющих его цианобактерий. Как было показано для цикадовых из рода Dioon, помимо Nostoc sp., кораллоиды могут заселяться другими нитчатыми цианобактериями, в том числе из родов Calothrix, Microcoleus, Leptolyngbya, Chroococcus, Acaryochloris, Scytonema (Suárez-Moo et al., 2019).

Состав фосфолипидов C. rumphii отличался доминированием молекул с С18:1 жирной кислотой, в том числе ФХ 16:0_18:1, ФХ 18:1_18:3, ФХ 18:1/18:1, ФХ 18:0_18:1, ФЭ 16:0_18:1, ФЭ 18:1/18:1. Подобная тенденция в распределении жирных кислот в молекулах фосфолипидов была характерна для обоих ведущих классов – ФХ и ФЭ. Обычные для грибов и растений ФХ 18:2/18:2 и ФЭ 18:2/18:2 с линоленовой кислотой в sn-1 и sn-2 положениях (Nokhsorov et al., 2022; Kotlova et al., 2024), количество которых в профиле может достигать 50–70% и более (Kotlova et al., 2022), у C. rumphii оказались минорными (до 2%). Такой состав молекулярных форм фосфолипидов, составляющих основу экзо- и эндомембран, выглядит достаточно архаично и, по данному признаку, сближает C. rumphii с другим древним семенным растением – Ginkgo biloba. Анализ свободных жирных кислот и триглицеридов масла семян G. biloba также выявил необычно высокое содержание С18:1 (более 30% от суммы жирных кислот), которые были представлены олеиновой С18:1^Δ9 и транс-вакценовой С18:1^Δ11 кислотами и входили в состав различных молекулярных форм триглицеридов, в частности, таких как 18:2_18:1_18:1 и 18:2_18:1_16:0 (Xie et al., 2021). Как показал филогенетический анализ полных ядерных и пластидных геномов 15 видов растений, включая цикадовые и гинкго, данные растения образуют кладу, сестринскую по отношению ко всем остальным ныне живущим голосеменным (Liu et al., 2022). Высокая степень гомологии, сближающая эти таксоны, выявлена среди генов, кодирующих синтез ферментов, связанных с вторичным ростом ксилемы и флоэмы, образованием пыльцы и ряда репродуктивных структур, MADS-box фактором, контролирующим механизм определения пола растения, а также среди генов, отвечающих за синтез защитных соединений, например, терпеноидов (Liu et al., 2022). Согласно полученным нами данным, свидетельствующим о своеобразии липидома Cycas, гены фосфолипидного метаболизма и связанного с ним метаболизма триглицеридов у цикадовых и Ginkgo также могут иметь высокую степень гомологии.

Анализ фосфолипидома продемонстрировал свою перспективность для характеристики цикадовых на уровне таксонов высокого ранга – обнаружены архаичные признаки (высокий уровень молекулярных видов с С18:1, сравнительно высокое содержание молекулярных видов с нечетными С17:0 и С19:0 жирными кислотами), сближающие реликтовые виды Cycas с Ginkgo biloba и отличающие их от других ныне живущих семенных растений. Одновременно выявлены значительные межвидовые различия C. revoluta и C. rumphii, что, несомненно, делает фосфолипиды интересным объектом для таксономических и филогенетических исследований. Здесь важно подчеркнуть, что в отличие от триглицеридов, выводимых из метаболизма и депонируемых в клетке в виде липидных включений, при этом отличающихся особым молекулярным разнообразием, которое используется в хемотаксономическом анализе (Ohlrogge et al., 2018), фосфолипиды являются важным структурным и регуляторным компонентом мембран. От их состава зависят как физико-химические свойства мембран, так и активность связанных с ними рецепторов, ферментов, ионных каналов и др. Выявленные в молекулярном составе фосфолипидов различия могут указывать на наличие принципиальных особенностей в физиологии и метаболизме данных видов.

Помимо фосфолипидов нами был проведен анализ липидома двух основных классов гликолипидов – моно- (МГДГ) и дигалактозилдиацилглицеринов (ДГДГ). Данные классы липидов также являются основным компонентом мембран. Однако локализованы они большей частью в наружной и внутренней мембранах хлоропластов и мембранах тилакоидов. В составе МГДГ обнаружено 24 молекулярных формы липидов, в составе ДГДГ – 27 (рис. 2). Из них количественно преобладали 6–8 молекулярных форм, которые в сумме составляли 90% от всех выявленных форм липидов данных классов, остальные содержались лишь в следовых количествах. Доминирующими молекулярными формами, как и у большинства изученных семенных растений, являлись МГДГ 18:3_18:3, МГДГ 18:2_18:3, ДГДГ 16:0_18:2, ДГДГ 16:0_18:3, ДГДГ 18:3_18:3, ДГДГ 18:2_18:3. Таким образом, анализ гликолипидов двух видов Cycas не выявил каких-либо принципиальных отличий, свидетельствующих об особенностях липидного обмена фотосинтетического аппарата. Тем не менее, можно отметить, что как и при анализе фосфолипидома, в составе гликолипидов C. revoluta большую часть, по сравнению с С. rumphii, составляли молекулярные виды с С18:2 кислотами (МГДГ 18:2_18:2, ДГДГ 16:0_18:2, ДГДГ 18:2_18:3). Среди молекулярных видов гликолипидов C. rumphii преобладали молекулы с С18:3 (МГДГ 18:3_18:3, ДГДГ 16:0_18:3, ДГДГ 18:3_18:3). Высокая степень консервативности липидома хлоропластов, по-видимому, не позволяет использовать его для развернутых сравнительных таксономических исследований, однако также может продемонстрировать своеобразие изучаемых видов.

 

Рис. 2. Состав молекулярных форм гликолипидов Cycas revoluta (серые столбцы) и С. rumphii (белые столбцы). Эксперимент проведен в трех повторностях (n = 3), бары обозначают стандартное отклонение.

Fig. 2. Glycolipid profiling of Сycas revoluta (grey bars) and C. rumphii (white bars). The experiments were performed in triplicate (n = 3), and error bars indicate standard deviations.

 

Как следует из анализа литературы, C. revoluta и C. rumphii филогенетически далеки друг от друга. По данным M. Coiro с соавторами (2023), сопоставившими 321 вид современных и ископаемых цикадовых по морфологии листьев и молекулярным данным, включая 104 из 118 известных видов рода Cycas, цикадовые весьма гетерогенны по многим признакам, включая морфологию, анатомию, ареалы распространения, а также происхождение. Так, считается, что C. revoluta дивергировал в позднем миоцене около 12 млн лет назад, в то время как C. rumphii появился гораздо позже, по проведенным оценкам, в плиоцене около 4 млн лет назад. Данные виды отличаются формой и размером листьев, высотой и особенностями ветвления ствола, анатомией корня, а также способностью корневой системы образовывать эндосимбиоз с различными видами цианобактерий. C. revoluta распространен в субтропической зоне в Японии и Китае, C. rumphii – в тропической зоне Индонезии и Новой Гвинеи. Анализ липидома, проведенный в данной работе, дает основание заключить, что виды рода Cycas заметно различаются не только на уровне морфологии и экологии, но и на уровне метаболизма липидов.

БЛАГОДАРНОСТИ

Работа выполнена при финансовой поддержке РНФ (грант № 22-24-01152) на базе научного парка СПбГУ, РЦ “Методы анализа состава вещества”, шифр проекта 42.39.809.2017.

ACKNOWLEDGEMENTS

This project was funded by Russian Science Foundation (project No. 22-24-01152). Lipidomic profiling was performed on the equipment of the Research Resource center “Chemical Analysis and Materials” of St. Petersburg State University (research project 42.39.89.2017).

 

¹ Здесь и далее в сокращенном названии жирной кислоты, в данном случае С18:2, первое значение (С18) указывает на количество атомов углерода в ацильной цепи, второе (2) – на общее количество двойных связей. Положение двойных связей в настоящей работе не определялось.

² В сокращенном названии молекулярных форм липидов, содержащих две жирные кислоты в sn-1 и sn-2 положениях глицериновой части молекулы, знаком подчеркивания (например, ФХ 16:0_18:2) принято разделять жирные кислоты в случае, если их положение в молекуле не определено (Liebisch et al., 2020). Использование знака дроби (слэша) указывает на точное определение положения жирных кислот в молекуле липида. Так, запись ФХ 16:0/18:2 означает, что С16:0 находится в sn-1 положении молекулы ФХ, а С18:2 – в sn-2 положении.

About the authors

E. R. Kotlova

Komarov Botanical Institute RAS

Author for correspondence.
Email: kotlova@yandex.ru
Russian Federation, Prof. Popov Str., 2, Saint-Petersburg, 197022

S. V. Senik

Komarov Botanical Institute RAS

Email: kotlova@yandex.ru
Russian Federation, Prof. Popov Str., 2, Saint-Petersburg, 197022

I. V. Kozlova

Komarov Botanical Institute RAS

Email: kotlova@yandex.ru
Russian Federation, Prof. Popov Str., 2, Saint-Petersburg, 197022

E. B. Serebryakov

Saint-Petersburg State University

Email: kotlova@yandex.ru
Russian Federation, Universitetskaya Emb., 7/9, Saint-Petersburg, 199034

References

Supplementary files