Comparative morphological and genetic analysis of Corydalis bracteata sensu lato (Papaveraceae) populations from Southern Siberia

Full Text

Род хохлатка (Corydalis DC.), относящийся к семейству Papaveraceae, подсемейству Fumarioidae, является таксономически сложным и включает 546 видов (http://www.worldfloraonline.org). По данным «Конспекта флоры Азиатской России» (Malyshev, 2012), распространенным видом на этой территории является C. bracteata Pers., относящийся к секции Pes-gallinaceus Irmisch. Из родства С. bracteata с севера Красноярского края К.Ф. Ледебуром был описан вид Corydalis gracilis Ledeb. (Ledebour, 1842), а с территории Приенисейских Саян недавно было описано еще два вида – Сorydalis talpina Stepanov и Сorydalis bombylina Stepanov (Stepanov, 2015). В иностранной литературе C. bracteata входит в секцию Corydalis в связи с объединением секций Pes-gallinaceus Irmisch. и Raphanituber Khokhryakov (Zhang et al., 2008).

С. bracteata s.l. имеет неморальную природу, является весенним эфемероидом. Основной ареал вида охватывает Южную Сибирь с явным тяготением к западной ее части. Г.А. Пешкова (Peshkova, 1984) относит С. bracteata к монтанному элементу флоры, максимальную активность вид имеет в пределах черневого и подтаежного горных поясов, при этом тяготеет к мелколиственным и смешанным лесным сообществам. По предварительным данным, С. bracteata s.str. распространен преимущественно на юге Западной Сибири, а восточная граница может достигать р. Енисей. В остальных частях ареала С. bracteata замещается родственными видами. Один из них – Corydalis talpina – наиболее редкий, связанный с реликтовыми черневыми сообществами в нижних высотных поясах Приенисейских Саян (Stepanov, 2016). С. bracteata и С. talpina обладают морфологическим сходством, однако у особей С. talpina отмечено формирование дочернего клубенька в пазухе прикорневого листа. Для выявления таксономически значимых морфологических признаков с использованием методов современной статистики и изучения генетической дифференциации популяций желтоцветковой хохлатки нами были проведены настоящие исследования.

Цель исследований – сравнительный морфолого-генетический анализ популяций Сorydalis bracteata sensu lato, произрастающих в горах Южной Сибири.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Сбор материала проводился в мае – июне 2018–2022 гг. в пределах Красноярской лесостепи (Емельяновский р-н), северо-восточной части Западного Саяна (Ермаковский р-н) Красноярского края, в восточных отрогах Кузнецкого Алатау (Ширинский р-н, Республика Хакасия), в центральной части Кузнецкого Алатау (окр. г. Кемерово), а также в предгорьях Алтая (окр. г. Белокурихи, Алтайский край) (рис. 1). Объектами исследований служили 6 популяций желтоцветковой хохлатки (табл. 1).

 

Рис. 1. Расположение популяций Corydalis bracteata s. l. (нумерация в соответствии с табл. 1).

Fig. 1. Map of the location of Corydalis bracteata s. l. populations (the numbers correspond to Table 1).

 

Таблица 1. Характеристика местообитаний Corydalis bracteata s.l.

Table 1. Description of habitats of Corydalis bracteata s.l.

№ популяции Population number	Фитоценоз; местоположение Phytocoenosis; location	Состав древостоя Stand composition	Доминирующие виды травяного яруса Dominants of the grass cover
Красноярская лесостепь (Красноярский край) / Krasnoyarsk forest-steppe (Krasnoyarsk Territory)
CВ1	Сосново-березовый лес, разнотравный; Емельяновский р-н, окр. д. Крутая Pine-birch forb forest; Emelyanovsky district, Krutaya village N56.259061˚, E92.452176˚	6Б2Е2С Betula pendula – 60% Picea obovata – 20% Pinus sylvestris – 20%	Corydalis bracteata (15%) Carex macroura (15%) Calamagrostis arundinacea (15%) Adoxa moschatellina (10%) Equisetum pratense (10%)
Западный Саян (Красноярский край) / Western Sayan (Krasnoyarsk Territory)
СВ2	Черневой осинник папоротниково-разнотравный; Ермаковский р-н, окр. пос. Танзыбей Chern aspen forest with fern and forb cover; Yermakovsky District, Tanzybey village N53.136475˚, E92.915468˚	8Ос2П Populus tremula – 80% Abies sibirica – 20%;	Anemone altaica (40%) Matteuccia struthiopteris (40%) Corydalis bracteata (20%) Corydalis subjenisseensis (10%)
CВ3	Березово-лиственичный лес разнотравно-осочковый; Ермаковский р-н, природный парк “Ергаки”, кордон Таловка Birch-larch forest, with forb and sedge cover; Yermakovsky District, Natural Park “Ergaki”, Talovka ranger station N52.341828˚, E93.164233˚	6Л4Б Larix sibirica – 60% Betula pendula – 40%	Carex macroura (50%) Corydalis bracteata (10%) Anemone jenisseensis (5%)
Кузнецкий Алатау (Республика Хакасия) / Kuznetsk Alatau (Republic of Khakassia)
CВ4	Смешанный лес разнотравно-осочковый; Ширинский р-н, окр. пос. Коммунар Mixed forest with forb and sedge cover; Shirinsky district, Kommunar village N54.347447˚, E89.293087˚	4Е3Б3Л Picea obovata – 40% Betula pendula – 30% Larix sibirica – 30%	Carex macroura (60%) Corydalis bracteata (20%) Calamagrostis langsdorffii (15%)
Кузнецкий Алатау (Кемеровская область) / Kuznetsk Alatau (Kemerovo Region)
CВ5	Пихтово-осиновый лес крупнотравный, окр. г. Кемерово; 55.470358˚ с.ш., 86.235021˚ в.д. Fir-aspen forest, with tall herbs, Kemerovo district, Kemerovo; N55.470358˚, E86.235021˚	7Ос3П Populus tremula – 70% Abies sibirica – 30%	Corydalis bracteata (20%) Anemone altaica (10%) Erythronium sibiricum (10%)
Алтай (Алтайский край) / Altai (Altai Territory)
CВ6	Смешанный лес разнотравно-орляковый; Смоленский район, окр. г. Белокурихи Mixed forest with forbs and bracken; Smolensky district, Belokurikha N51.916393˚, E84.960607˚	4Б3С3Ос Betula pendula – 40% Pinus sylvestris – 30% Populus tremula – 30%	Pteridium pinetorum (70%) Carex macroura (40%) Corydalis bracteata (30%) Aegopodium podagraria (20%)

 

Измерения морфометрических параметров для оценки внутри- и межпопуляционной изменчивости проводились на 30 генеративных особях в каждой популяции. Для репрезентативности выборки использовался метод случайного отбора: по выбранной наугад линии, не повторяющей каких-либо определенных условий, отбиралось каждое седьмое растение (Shmidt, 1984). Большая часть оцениваемых нами морфометрических признаков приводится в качестве диагностических для определения видов во “Флоре Сибири” (Flora…, 1994). Измерены следующие параметры: длина цветоноса (х1); длина стебля (x2); количество цветков (х3); длина прикорневой чешуи (x4); длина (х5), ширина (х6), количество зубчиков (x7) нижнего прицветника; длина отгиба (х8), длина шпорца (x9) венчика нижнего цветка; длина (x10), ширина (х11) клубенька в пазухе прикорневой чешуи. Также вычислялись относительные признаки: отношение длины цветоноса к длине стебля (х1/х2); форма нижнего прицветника (х5/х6); отношение длины венчика к длине шпорца (х8/х9); длина венчика (х8+х9); размер клубенька в пазухе прикорневой чешуи (х10*х11).

Тестирование данных на нормальность распределения признаков проводили с помощью метода Шапиро – Уилка (Shapiro, 1968). При математической обработке данных рассчитывали пределы варьирования признака, среднее арифметическое и его ошибку, среднее квадратичное отклонение, коэффициент вариации. Для установления достоверных различий между средними значениями измеренных признаков использовали тест Тьюки, позволяющий проводить попарные сравнения между средними значениями каждой группы, реализуемые в пакете stats для RStudio версии 3.6.2. (Miller, 1981; Chambers, 1992; Yandell, 1997). Для изучения сопряженной изменчивости и выявления диагностического комплекса ключевых индикаторных признаков в общей морфологической структуре растений был использован метод главных компонент (Principal component analysis, PCA), реализованный в базовом пакете stats, с последующей визуализацией с помощью пакета factoextra версия 1.0.7 для R (Kassambara, Mundt, 2020). Собственные значения значимых факторов превышали единицу согласно критерию Кайзера (Kaiser, 1960), а совместный вклад в общую дисперсию составлял более 80%.

Образцами для генетического анализа служили выделенные ДНК 5–10 экземпляров из каждой популяции. Экстракцию тотальной ДНК производили с помощью коммерческого набора DiamondDNA (ООО «Научно-производственная фирма “Алтайбиотех”», Барнаул). Для изучения генетической изменчивости использовался ISSR-PCR (Inter Simple Sequence Repeats) метод. Амплификацию проводили в 20 мкл реакционной смеси с помощью набора для проведения ПЦР с HS-Taq (+MgCl₂) (ООО “Биолабмикс”, Новосибирск) в следующем составе на один образец: 7 мкл ddH₂O; 4 мкл 5х ПЦР буфер (+MgCl₂); 4 мкл 10мМ праймера; 0.2 мкл HS-Taq DNA-полимеразы (5 ед. акт/мкл); 0.4 мкл 50х смеси dNTP; 2.4 мкл 50мМ MgCl₂; 2 мкл ДНК.

Программа амплификации: 95°C (5 мин); 13 циклов: 95°C (20 с), 55°C (45 с, понижение температуры на 0.7°C в каждом последующем цикле), 72°C (90 с); 25 циклов: 95°C (20 с), 44°C (30 с), 72°C (90 с); 72°C (7 мин). Предварительно на 2 образцах ДНК были выявлены праймеры, дающие воспроизводимый полиморфный результат (Mansour et al., 2009; Paterson et al., 2009). Разделение продуктов амплификации производилось в 1.3%-м агарозном геле в горизонтальной электрофорезной камере в TAE-буфере при 220 V с применением бромистого этидия. Визуализацию продуктов амплификации проводили в проходящем УФ-излучении с помощью системы гель-документирования Gel Doc XR (Bio-Rad, USA). Для определения длины амплифицированных фрагментов использовали ДНК-маркеры (ООО “Биолабмикс”, Новосибирск).

Электрофореграммы анализировали с помощью программы Quantity One 1-D Analysis Software. При этом учитывали только воспроизводимые в повторных экспериментах фрагменты. Обработку результатов анализа проводили с помощью программы Popgene version1.32 (Yeh et al., 1999) и определяли: процент полиморфных локусов (P), генетическое разнообразие Нея (I_о), информационный индекс Шеннона (H_e), генетические дистанции Нея (D), показатель подразделенности популяций (G_st). Дендрограмма сходства особей популяций строилась при помощи R-пакета pvclust (Suzuki, Shimodaira, 2006) невзвешенным парно-групповым методом (UPGMA – unweighted pair-group method using arithmeticaverage) при 5000 репликаций бутстрэпа.

Для оценки генетической структуры популяций на основе данных ISSR-PCR анализа был использован байесовский подход (MCMC: марковская цепь Монте-Карло), реализованный в программном обеспечении STRUCTURE версии 2.3.4. (Pritchard et al., 2000). Использовалось длительное выгорание (Burn-In) 100 000 и MCMC 500 000 циклов. При проведении нескольких прогонов результаты были равнозначными, что говорит о стабильности результатов. Количество возможных кластеров (K) проверялось от 2 до 10.

Для проведения филогенетического анализа секвенировали участки хлоропластной ДНК: ген matK с использованием праймеров 1R_KIM (5’-CGT-ACA-GTA-CTT-TTG-TGT-TTA-CGA-G-3’) и 3F_KIM (5’-CCC-AGT-CCA-TCT-GGA-AAT-CTT-GGT-TC-3’) (Kim, 2010) и межгенный участок rpoB-trnC с праймерами rpoBF (5’-ССT-TGA-TCA-ATG-AAC-CTA-CAA-AAT-C-3’) и trnCR (5’-ATT-TGC-AGT-CCT-CTG-CCT-TAC-3’) (Miikeda et al., 2006) производства ЗАО “Евроген” (г. Москва) в двух повторностях. Полимеразную цепную реакцию проводили в 50 мкл реакционной смеси с помощью набора для проведения ПЦР Биомастер HS-Taq ПЦР-Color 2x (ООО “Биолабмикс”, Новосибирск) в следующем составе на один образец: 25 мкл готовой РСR-смеси (ООО “Биолабмикс”, Новосибирск), 21 мкл ddH₂O, по 1 мкл 10мМ соответствующих праймеров (forward и revers), 2 мкл ДНК. Программа амплификации: 3 мин 95°C; 35 циклов: 20 с 95°C, 30 с 57°C, 30 с 72°C; 5 мин 72°C. Для секвенирования использовали набор реактивов BigDye Terminator v. 3.1 (Applied Biosystems, MD, USA). Определение нуклеотидных последовательностей Forward цепей ПЦР-продуктов проводили методом Сэнгера на секвенаторе ABI 3130xl Genetic Analyzer (Applied Biosystems, MD, USA) (ЦКП “Геномика” СО РАН, г. Новосибирск).

Выравнивание последовательностей проводили с использованием алгоритма MUSCLE (Edgar, 2004), реализованного в программе MEGA X (Kumar et al., 2018). Для филогенетического анализа использовался метод максимального правдоподобия (maximum likelihood, ML) со значением параметра бутстрэпа 1000. В анализ были включены по 6 последовательностей, впервые секвенированных для С. bracteata s.l. участков matK и rpoB-trnC. Из базы данных GenBank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore) были добавлены наиболее похожие соответствующие последовательности хохлаток секции Corydalis (Zhang et al., 2008; Xu et al., 2022). В качестве аутгруппы использовали вид Fumaria officinalis L. При поиске мутаций их положение определялось при выравнивании секвенированных нами образцов на соответствующую последовательность BK063235 Corydalis intermedia (L.) Mérat как принадлежащую к наиболее близкородственному виду из имеющихся в базе данных GenBank.

РЕЗУЛЬТАТЫ

Изученные популяции Corydalis bracteata s.l. произрастают в подтаежных смешанных сосново-березовых, березово-лиственничных лесах, черневых осинниках и пихтарниках (табл. 1).

Оценку межпопуляционной изменчивости признаков хохлаток производили по 11 морфометрическим признакам и 5 относительным параметрам (табл. 2). В результате изучения внутрипопуляционной изменчивости установлено, что большинство вегетативных признаков вида характеризуются высоким и очень высоким уровнями изменчивости согласно шкале С.А. Мамаева (Mamaev, 1972). Наименее изменчивыми являются признаки цветка: x8 (коэффициент вариации изменяется от 9 до 25%), x9 (Cv = 8–37%), x8+x9 (Cv = 7–26%). Высокая степень изменчивости характерна для длины цветоноса x1 (Cv = 38–65%) и сопряженных с ним параметров х1/х2 (Cv = 41–63%), (38–48%).

 

Таблица 2. Среднепопуляционные значения признаков Corydalis bracteata s.l.

Table 2. Average population values of Corydalis bracteata s.l.

	СВ1	СВ2	СВ3	СВ4	СВ5	СВ6
х1 – Длина цветоноса, см x1 – Peduncle length, cm	4.11 ± 0.96	3.57 ± 0.70	2.02 ± 0.39	5.69 ± 0.81	2.74 ± 0.37	1.70 ± 0.31
х2 – Длина стебля, см x2 – Stem length, cm	28.06 ± 1.32	27.07 ± 1.35	17.66 ± 1.05	19.89 ± 1.92	9.09 ± 0.40	12.23 ± 0.72
х3 – Количество цветков, ед. х3 – Number of flowers, pcs	4.57 ± 0.78	4.70 ± 0.72	4.59 ± 0.65	9.37 ± 1.52	9.74 ± 1.09	4.49 ± 0.60
x4 – Длина прикорневой чешуи, см x4 – Length of scale leaf, cm	1.53 ± 0.11	1.80 ± 0.17	1.69 ± 0.10	1.52 ± 0.13	1.65 ± 0.11	1.13 ± 0.09
х5 – Длина нижнего прицветника, мм х5 – Length of lowermost bract, mm	21.83 ± 1.74	22.04 ± 1.35	18.10 ± 1.30	18.69 ± 1.63	15.28 ± 0.77	11.09 ± 0.89
х6 – Ширина нижнего прицветника, мм x6 – Width of lowermost bract, mm	11.33 ± 0.87	12.35 ± 0.85	10.28 ± 1.06	12.23 ± 1.46	9.66 ± 0.72	6.86 ± 0.78
х7 – Количество зубчиков нижнего прицветника, ед. x7 – Number of lowermost bract teeth, pcs	5.50 ± 0.34	5.13 ± 0.19	6.21 ± 0.38	7.27 ± 0.91	5.66 ± 0.28	5.09 ± 0.32
х8 – Длина отгиба венчика нижнего цветка, см x8 – Length of corolla limb of lowermost flower, cm	1.92 ± 0.10	2.04 ± 0.07	1.70 ± 0.07	1.60 ± 0.08	1.23 ± 0.08	1.21 ± 0.07
х9 – Длина шпорца венчика нижнего цветка, см x9 – Length of spur of lowermost flower, cm	1.70 ± 0.06	1.71 ± 0.05	1.49 ± 0.08	1.51 ± 0.08	0.77 ± 0.08	1.19 ± 0.07
х10 – Длина клубенька, мм x10 – Tuber length, mm	5.39 ± 0.90	8.39 ± 1.55	–	–	–	–
х11 – Ширина клубенька, мм х11 – Tuber width, mm	4.25 ± 0.52	4.80 ± 0.64	–	–	–	–
х5/х6 – Отношение длины нижнего прицветника к его ширине х5/х6 – Length to width ratio in lowermost bract	1.98 ± 0.17	1.82 ± 0.15	1.82 ± 0.13	1.59 ± 0.12	1.66 ± 0.12	1.71 ± 0.16
х8/х9 – Отношение длины отгиба венчика нижнего цветка к длине шпорца х8/х9 – Limb length to spur length ratio in corolla of lowermost flower	1.13 ± 0.06	1.20 ± 0.04	1.15 ± 0.05	1.07 ± 0.05	1.75 ± 0.15	1.05 ± 0.08
х8+х9 – Длина цветка, см х8+х9 – Flower length, cm	3.62 ± 0.14	3.75 ± 0.10	3.18 ± 0.14	3.11 ± 0.14	2.00 ± 0.14	2.40 ± 0.10
х10*х11 – Размер клубенька х10*х11 – Tuber size	25.61 ± 6.80	43.91 ± 12.18	–	–	–	–

 

Максимальные размеры осевых органов (х1, х2) наблюдаются у особей красноярской популяции хохлатки CB1, длина цветоноса и стебля которых варьирует от 1.5 до 9.2 см и от 22.9 до 39.3 см соответственно. Также высокие показатели длины стебля характерны для западносаянской СВ2 (21.2–34.6 см), а длинные цветоносы отмечены для хакасской популяции СВ4 (1–9.9 см). Генеративные органы наилучшим образом развиты у особей популяций из Кузнецкого Алатау СВ4 и СВ5, где число цветков составляет 6–21 и 3–17 соответственно. Минимальная длина шпорца характерна для кемеровской СВ5 и алтайской CB6 популяций и составляет 4–15 мм. Самые крупные венчики наблюдаются у особей популяций СВ1 (2.6–4.1 см) и СВ2 (3.3–4.2 см). Миниатюрные прицветники характерны для СВ5 (длина 10–21 мм, ширина 6–17 мм) и СВ6 (длина 7–17 мм, ширина 3–16 мм).

Следует отметить, что все представители популяций СВ1 и СВ2 содержали дочерний (дополнительный) клубенек 3–17 мм длиной и 3–8 мм шириной в пазухе прикорневой чешуи, тогда как у особей популяций СВ3–СВ6 он отсутствовал.

Для выявления достоверных различий между исследуемыми признаками проведен тест Тьюки. В табл. 3 указано количество достоверных различий при попарном сравнении популяций. Так, красноярская популяция СВ1 и западносаянская СВ2 демонстрируют максимальные отличия от хакасской СВ4 и кемеровской СВ5. Морфологическим сходством обладают популяции СВ1 и СВ2, а также западносаянская СВ3 и хакасская СВ4.

 

Таблица 3. Количество достоверных различий морфометрических признаков между популяциями (тест Тьюки)

Table 3. The number of significant differences in morphometric characteristics between populations (Tukey’s test)

	CB1	CB2	CB3	CB4	CB5
CB2	3
CB3	9	10
CB4	12	12	4
CB5	13	12	8	9
CB6	11	11	8	11	9

 

Ввиду слабой информативности, связанной с низким уровнем внутри- и межпопуляционной изменчивости, из дальнейшего анализа были удалены следующие признаки: х4, х6, х5/х6, х8/х9. В результате изучения сопряженной изменчивости морфометрических признаков хохлаток с использованием PCA-метода выявлено, что первые три компоненты являются значимыми. Их собственные значения превышают 1, а суммарный вклад в общую дисперсию равен 84.07%. Первая главная компонента наиболее тесно связана сильной положительной связью с признаками осевых органов, размером цветка и клубенька в пазухе прикорневой чешуи (х2, х5, х8, х9, х8+х9, х10, х11, х10*х11). Вторая компонента описывает признаки количества цветков и параметры цветоноса (х1, х1/х2, х3), третья представляет признаки количества зубчиков прицветника (х7).

Ординация особей популяций в плоскостях первой и второй компонент обособляет популяции СВ1 и СВ2, имеющие длинные стебли и прицветники, крупные цветки, а главное – крупный вытянутый клубенек в пазухе прикорневого листа (рис. 2). Другие популяции не имеют клубенька и образуют вторую совокупность. Группа из 4 популяций также дифференцирована. Особи кемеровской (СВ5) и алтайской (СВ6) популяций, характеризующиеся короткими стеблями, мелкими цветками и прицветниками, несколько обособляются от популяций СВ3 и СВ4, занимающих промежуточное положение. Обращает на себя внимание распределение популяций относительно второй компоненты: СВ3 и СВ6 характеризуются короткими цветоносами, а СВ4 и СВ5 длинными цветоносами с большим количеством цветков. Также разделение наблюдается в плоскостях первой и третьей компонент: СВ1, СВ2, СВ5, СВ6 характеризуются малым, а СВ3, СВ4 – большим количеством зубчиков нижнего прицветника. Таким образом, мы видим четкое разделение популяций по морфологическим признакам на две группы. Первая представлена красноярской (СВ1) и западносаянской (СВ2) популяциями, которые характеризуются длинными стеблями, крупными прицветниками. Однако их главное отличие – крупный вытянутый клубенек в пазухе прикорневой чешуи. Аналогичные признаки характерны для недавно описанного вида C. talpinа – хохлатки кротовой.

 

Рис. 2. Ординация популяций в плоскостях 1 и 2 компонент (А) и 1 и 3 компонент (В).

Fig. 2. Ordination of populations in the planes of the 1^st and 2^nd components (A), and 1^st and 3^rd components (B).

 

Вторая группа популяций объединяет многоцветковые растения, не имеющие клубенька в пазухе прикорневой чешуи: западносаянскую СВ3, хакасскую СВ4, кемеровскую СВ5 и алтайскую СВ6. В табл. 4 приводим наиболее информативные морфологические признаки, разделяющие наши популяции на две группы.

 

Таблица 4. Значимые диагностические признаки хохлаток из родства Corydalis bracteata s.l.

Table 4. Significant diagnostic features of Corydalis affined to C. bracteata s.l.

Популяция Population	СВ1	СВ٢	СВ٣	СВ٤	СВ٥	СВ٦
Местоположение Location	Красноярская лесостепь (Красноярский край) Krasnoyarsk forest-steppe (Krasnoyarsk Territory)	Западный Саян (Красноярский край) Western Sayan (Krasnoyarsk Territory)	Западный Саян (Красноярский край) Western Sayan (Krasnoyarsk Territory)	Кузнецкий Алатау (Республика Хакасия) Kuznetsk Alatau (Republic of Khakassia)	Кузнецкий Алатау (Кемеровская область) Kuznetsk Alatau (Kemerovo Region)	Алтай (Алтайский край) Altai (Altai Territory)
Вид Species	C. talpina		C. bracteata
Стебель Stem	Длинные (21–39 см) Long (21–39 cm)		Средней длины (10–29 см) Medium length (10–29 cm)		Короткие (6–16 см) Short (6–16 cm)
Количество цветков Number of flowers	2–9			2–16 Длинные цветоносы относительно стеблей 2–16 Long peduncles relative to stems		2–9
Количество зубчиков прицветника Number of bract teeth	4–6		5–10		3–6
Длина прицветника, мм Bract length, mm	15–28		12–26		7–20
Клубенек Tuber	Вытянутый 2–9 мм дл. 3–6 мм шир. Elongated 2–9 mm long 3–6 mm wide	Вытянутый Длина 2–17 мм Ширина 2–7 мм Elongated Length 2–17 mm Width 2–7 mm	Нет None	Нет None	Нет None	Нет None
Длина шпорца, мм Spur length, mm	15–20		11–19		4–15

 

Генетический полиморфизм 6 популяций изучен с помощью ISSR-PCR метода. В анализе использованы ISSR-праймеры, дающие воспроизводимый полиморфный результат: HB12, HB14, ISSR17, ISSR23 (Zietkiewicz et al., 1994). Выявлено 89 фрагментов ДНК, суммарный полиморфизм которых составляет 100% (табл. 5).

 

Таблица 5. Полиморфизм межмикросателлитных фрагментов ДНК, амплифицированных ISSR-PCR методом

Table 5. Polymorphism of intermicrosatellite DNA fragments amplified by ISSR-PCR method

ISSR-праймер	Последовательность Sequence (5’ → 3’)	Общее число фрагментов Total number of fragments		Число полиморфных фрагментов ДНК (%) Number of polymorphic DNA fragments (%)
		Всего Total	Полиморфных Polymorphic	СВ١	СВ٢	СВ٣	СВ٤	СВ٥	СВ٦
HB12	(CAС)3GС)	19	19	11 (57%)	13 (68%)	13 (68%)	11 (57%)	8 (42%)	11 (57%)
HB14	(CTC)3GC)	22	22	13 (59%)	13 (59%)	11 (50%)	11 (50%)	8 (36%)	7 (31%)
ISSR23	(AC)8TA)	19	19	6 (32%)	11 (58%)	14 (74%)	11 (58%)	12 (63%)	13 (68%)
ISSR17	(GACA)4	29	29	19 (66%)	21 (72%)	17 (59%)	20 (69%)	14 (48%)	17 (59%)
Всего Total		89	89	49 (55%)	58 (65%)	55 (62%)	53 (60%)	42 (47%)	48 (54%)

 

Число амплифицированных фрагментов ДНК, в зависимости от праймера, варьировало от 19 (HB12 и ISSR23) до 29 (ISSR17). Генное разнообразие Нея (H_e) в суммарной выборке составило 0.3331, индекс Шеннона (I_o) – 0.4991. Уровень выявляемого внутрипопуляционного генетического разнообразия средний (47.19–65.17%). Показатели генетического полиморфизма максимальны для западносаянских популяций СВ2 (Р = 65.17%; H_e = 0.2337; I_o = 0.3495) и CB3 (Р = 61.80%; H_e = 0.2187; I_o = 0.3289). Минимальные значения отмечены для кемеровской CB5 (Р = 47.19%; H_e = 0.1888; I_o = 0.2769) и алтайской CB6 (Р = 53.93%; H_e = 0.1854; I_o = 0.2808) популяций. Коэффициент подразделенности популяций (G_st) составляет 0.3758. Таким образом, на долю межпопуляционного разнообразия приходится 37%, а изученные популяции демонстрируют очень высокую степень дифференциации согласно классификации С. Райта (Wright, 1978), что может указывать на присутствие в исследуемой выборке представителей разных видов.

Наибольшее значение генетических дистанций Нея (Nei, 1972) (D) наблюдается между популяциями CB2 и СВ5 и составляет 0.2799 (табл. 6). Минимальные генетические различия отмечены между популяциями СВ1 и СВ2 (D = 0.1428). Генетическую обособленность от других демонстрирует кемеровская популяция СВ5 (D = 0.2098–0.2799). Следует отметить, что алтайская популяция СВ6 обнаруживает генетическое сходство с западносаянской СВ3 (D = 0.1743).

 

Таблица 6. Генетические дистанции М. Нея (1972) на основе ISSR-PCR

Table 6. Nei’s genetic identity (1972) based on ISSR-PCR

	CB1	CB2	CB3	CB4	CB5
CB2	0.1428
CB3	0.2072	0.1944
CB4	0.2068	0.1879	0.1612
CB5	0.2243	0.2799	0.2314	0.2098
CB6	0.241	0.2696	0.1743	0.2431	0.2048

 

Дендрограмма сходства особей популяций, построенная на основе данных ISSR-PCR анализа, представлена на рис. 3. Особи разных популяций формируют обособленные группы. Генетическое сходство демонстрируют популяции CB1 и СВ2, имеющие дополнительный клубенек.

 

Рис. 3. Дендрограмма сходства образцов Corydalis bracteata s.l. на основе ISSR-PCR анализа.

Fig. 3. Dendrogram of similarity of Corydalis bracteata s.l. samples based on ISSR-PCR analysis.

 

Анализ структуры распределения генотипов особей в программе STRUCTURE показывает, что исследуемые образцы максимально можно разделить на пять генетических кластеров (рис. 4). Основываясь на диаграмме вероятностей отнесения каждого образца к пяти кластерам, можно достоверно объединить популяции CB1 и СВ2. Образование этой устойчивой группы свидетельствует о давнем относительно других популяций генетическом обособлении. Оставшиеся образцы дифференцируются в соответствии с принадлежностью к популяциям при К = 5.

 

Рис. 4. Апостериорная вероятность отнесения образцов Corydalis bracteata s.l. к генетическим кластерам на основе анализа ISSR-PCR.

Fig. 4. Posterior probability of assigning Corydalis bracteata s.l. samples to genetic clusters based on ISSR-PCR analysis.

 

Для филогенетического анализа нами было отобрано по одному образцу из исследуемых популяций. При анализе последовательностей на участке гена matK, длиной 761 п.н. обнаружена трансверсия в положении 532 – характерный для всех последовательностей хохлаток аденин заменился на цитозин у образцов, выделяемых нами в вид C. talpina (СB1 и CB2). Эта миссенс-мутация приводит к замене аминокислоты треонина на пролин в полипептиде матуразы K. У западносаянского образца из СВ3 обнаружены другие замены: трансверсия С на А в положении 551, приводящая к замене серина на тирозин и транзиция G на A в положении 813 (синонимичная мутация).

В межгенной области rpoB-trnC длиной 732 п.н. у особей популяций СВ1 и СВ2 найдена двойная замена АС на ТА (положения 643–644), а кемеровский образец СВ5 отличается от представителей других популяций однонуклеотидной заменой цитозина на тимин в положении 63.

При построении филогенетических деревьев на основе анализа последовательностей ДНК гена matK и спейсера rpoB-trnC выявлена сходная топология. На рис. 5 приведено консенсусное дерево, построенное на основе анализа этих двух участков хлоропластной ДНК. Представители сибирских популяций C. bracteata с высокой степенью вероятности формируют отдельную кладу, занимающую терминальное положение. Причем особи из популяций СB1 и CB2 наиболее обособлены. Сестринскую с ними кладу образуют европейские виды Corydalis intermedia и Corydalis solida (L.) Clairv., имеющие фиолетово-розовые цветки. Отдельные клады образуют азиатские (дальневосточные, китайские, корейские) виды хохлаток, отличающиеся друг от друга цветом и размерами венчика, формой плодов и строением нектарника. Согласно классификации М. Лидена, все приведенные виды хохлаток относятся к секции Corydalis (Liden, Zetterlund, 1997).

 

Рис. 5. Филогенетическое древо видов секции Corydalis, построенное на последовательностях гена matK и межгенного спейсера rpoB-trnC хлоропластной ДНК методом максимального правдоподобия (ML). Цифрами обозначены значения бутстрэпа. Длина ветвей пропорциональна количеству замен.

Fig. 5. Phylogenetic tree of the species of the Corydalis section, built based on sequences of the matK gene and the intergenic spacer rpoB-trnC of chloroplast DNA by the maximum likelihood (ML) method. The numbers indicate bootstrap values. The length of the branches is proportional to the number of substitutions.

 

Следует отметить, что последовательности видов, формирующих обособленные клады, имеют от 0 до 16 вариабельных сайтов для участка matK и от 0 до 13 – для rpoB-trnC. Таким образом, между отдельными и хорошо различающимися видами, такими как Corydalis remota Fisch. и Corydalis humilis B.U. Oh et Y.S. Kim, могут отсутствовать различия в изучаемых последовательностях ДНК.

ОБСУЖДЕНИЕ

В ходе морфологического анализа Corydalis bracteata s.l. на территории Южной Сибири было выявлено разделение изученных популяций на две группы. Особи красноярской (CB1) и западносаянской (CB2) популяций характеризуются длинными стеблями, крупными прицветниками и цветками. Однако основным отличием, сближающим представителей данных популяций с недавно описанным видом C. talpinа (хохлаткой кротовой), является наличие крупного вытянутого клубенька в пазухе прикорневого листа. Подобное явление наблюдается и у других видов рода. Так, Т.А. Безделева (Bezdeleva, 2010) приводит две жизненные формы для вида C. remota: клубневой геофит без клубенька в пазухе прикорневого листа с коротким столоном и столонно-клубневой геофит с длинным ортотропным столоном и образующимся дочерним клубнем.

Однако результаты, полученные в ходе молекулярно-генетических исследований, также показывают различие красноярской и западносаянской популяций от остальной совокупности. В частности, при проведении ISSR-PCR анализа выявлено наличие в общей выборке особей, которые должны быть отнесены к разным видам, о чем свидетельствуют высокие значения коэффициента подразделенности популяций (G_st = 0.3758). Анализ последовательностей ДНК также обнаружил отличие в виде трех нуклеотидных замен у особей красноярской (CB1) и западносаянской (CB2) популяций не только по сравнению с представителями изучаемых популяций, но и с другими клубневыми хохлатками, последовательности ДНК которых размещены в базе данных GenBank. Таким образом, проведенный морфологический и генетический анализы указывают на генетическую обособленность хохлаток из популяций CB1 и CB2, которые, как мы полагаем, следует относить к виду C. talpinа. Полученные нами в ходе филогенетического анализа дендрограммы не противоречат работам по филогении семейства Fumariaceae.

Следует отметить, что секвенирование участков хлоропластной ДНК (ген matK, спейсер rpoB-trnC) С. bracteata было проведено нами впервые. Наряду с данными последовательностями для филогении рода Corydalis другими авторами используются гены rbcL, trnG и межгенные спейсеры: trnL-trnF, psbA-trnH (Ren et al., 2019; Peng et al., 2023). Несмотря на то что участок ITS во многих исследованиях является эталонным маркером и зачастую используется для уточнения классификации семенных растений, для рода Corydalis он формирует противоречивую филогению ввиду своей мультикопийности (Jiang et al., 2018).

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В ходе морфологического анализа 6 популяций Corydalis bracteata s.l. выявлена высокая внутрипопуляционная изменчивость признаков длины цветоноса и количества цветков, а также низкая изменчивость генеративных признаков. Диагностическими признаками, позволяющими разделить хохлатки на группы, являются: количество цветков, количество зубчиков прицветника и его размеры, длина шпорца цветка, наличие клубенька в пазухе прикорневого листа.

В ходе ISSR-PCR анализа популяций хохлаток было показано высокое значение коэффициента подразделенности популяций (Gst = 0.3758). Уровень внутрипопуляционного генетического разнообразия – средний (47.19–65.17%). Показатели генетического полиморфизма максимальны для западносаянских популяций, минимальные значения отмечены для кемеровской и алтайской популяций.

Наибольшие значения генетических дистанций Нея (1972) наблюдаются между популяциями CB2 и СВ5, CB2 и СВ6 и составляют D = 0.2799 и D = 0.2696 соответственно. Эти результаты согласуются с морфологическим анализом популяций. Наибольшие морфологические различия также выявлены между этими парами популяций. Минимальные генетические и морфологические различия отмечены между красноярской СВ1 и западносаянской СВ2 популяциями (D = 0.1428), особи которых образуют дочерний клубенек.

В ходе анализа последовательностей хлоропластного гена матуразы К (matK) и межгенного спейсера rpoB-trnC обнаружены 3 нуклеотидные замены, отличающие особей из СВ1 и СВ2 от других популяций C. bracteata, причем одна из них приводит к замене аминокислоты. Перечисленные мутации отсутствуют как в последовательностях других видов, так и у особей близкородственных популяций. Также обнаружены две мутации в последовательности гена матуразы К у западносаянского образца СВ3 (синонимичная и миссенс-мутация), а кемеровский образец СВ5 отличается однонуклеотидной заменой в последовательности межгенного спейсера.

Филогенетические деревья, построенные на основе анализа участков matK и rpoB-trnC, обладают сходной топологией, а представители изучаемых нами популяций формируют хорошо обособленную кладу.

Таким образом, согласованные результаты морфологического и генетического анализов свидетельствуют о дифференциации популяций желтоцветковых хохлаток из Южной Сибири, изначально относимых к виду Corydalis bracteata и указывают на морфологическую и генетическую обособленность Corydalis talpinа.

About the authors

K. K. Ryabova

Siberian Federal University; Federal Research Center “Krasnoyarsk Science Center of the Siberian Branch of RAS”

Author for correspondence.
Email: ryabova.kseniya.k@mail.ru
Russian Federation, 660041, Krasnoyarsk, Svobodnyy Ave., 79; 660036, Krasnoyarsk, Akademgorodok Str., 50

I. Е. Yamskikh

Siberian Federal University

Email: iyamskikh@mail.ru
Russian Federation, 660041, Krasnoyarsk, Svobodnyy Ave., 79

N. V. Stepanov

Siberian Federal University

Email: stepanov-nik@mail.ru
Russian Federation, 660041, Krasnoyarsk, Svobodnyy Ave., 79

M. G. Kutsev

Siberian Federal University; Altai State University

Email: m_kucev@mail.ru
Russian Federation, 660041, Krasnoyarsk, Svobodnyy Ave., 79; 656049, Barnaul, Lenin Ave., 61

References

Supplementary files