Processes of Thermal Aggregation and Autolysis of Cysteine Protease Molecules – Bromelain, Ficin, and Papain

Cover Page

Cite item

Full Text

Open Access Open Access
Restricted Access Access granted
Restricted Access Subscription Access

Abstract

Among plant proteases, cysteine papain-like endopeptidases such as ficin, bromelain and papain occupy an important place due to their high proteolytic activity in the physiological pH range of the medium. The processes of thermal aggregation and autolysis of protease molecules can have a significant influence on their activity and, consequently, on the prospects of practical application. To date, the mechanisms of aggregation of protein molecules are still insufficiently studied, and it is still impossible to predict unambiguously their aggregation stability on the basis of amino acid sequence. In this connection, the aim of this work was to study the processes of thermal aggregation and autolysis of molecules of some cysteine proteases. It was found that despite similar structural and functional properties of ficin, bromelain and papain, their thermal aggregation processes proceed with different intensity. In particular, ficin and bromelain are approximately comparable in terms of their aggregation stability, whereas papain is significantly less susceptible to aggregation processes when exposed to elevated temperatures. It is suggested that the presence and configuration of internal structures of the molecule, such as cavities, tunnels, and pores, as well as the charge properties of its surface have a significant influence on the stability of these cysteine proteases to aggregation processes.

About the authors

M. G Holyavka

Voronezh State University; Sevastopol State University

Email: holyavka@rambler.ru
Voronezh, Russia; Sevastopol, Russia

V. A Koroleva

Voronezh State University; Voronezh State Medical University named after N.N. Burdenko

Voronezh, Russia; Voronezh, Russia

V. G Artyukhov

Voronezh State University

Voronezh, Russia

References

  1. Bilal M., Qamar S. A., Carballares D., Berenguer-Murcia A., and Fernandez-Lafuente R. Proteases immobilized on nanomaterials for biocatalytic, environmental and biomedical applications: Advantages and drawbacks. Biotechnol. Adv., 70, 108304 (2024). doi: 10.1016/j.biotechadv.2023.108304
  2. Mamo J. and Assefa F. The role of microbial aspartic protease enzyme in food and beverage industries. J. Food Qual., 2018, 1–15 (2018). doi: 10.1155/2018/7957269
  3. Morellon-Sterling R., El-Siar H., Tavano O. L., Berenguer-Murcia A., and Fernandez-Lafuente R. Ficin: a protease extract with relevance in biotechnology and biocatalysis. Int. J. Biol. Macromol., 162, 394–404 (2020). doi: 10.1016/j.ijbiomac.2020.06.144
  4. Tavano O. L., Berenguer-Murcia A., Secundo F., and Fernandez-Lafuente R. Biotechnological applications of proteases in food technology. Compr. Rev. Food Sci. Food Saf., 17 (2), 412–436 (2018). doi: 10.1111/1541-4337.12326
  5. Razzaq A., Shamsi S., Ali A., Ali Q., Sajjad M., Malik A., and Ashraf M. Microbial proteases applications. Front. Bioeng. Biotechnol., 7, 110 (2019). doi: 10.3389/fbioe.2019.00110
  6. Manjuprasanna V. N., Rudresha G. V., Urs A. P., Milan Gowda M. D., Rajaiah R., and Vishwanath B. S. Drupin, a cysteine protease from Ficus drupacea latex accelerates excision wound healing in mice. Int. J. Biol. Macromol., 165, 691–700 (2020). doi: 10.1016/j.ijbiomac.2020.09.215
  7. Castaneda-Valbuena D., Berenguer-Murcia A., Fernandez-Lafuente R., Morellon-Sterling R., and Tacias-Pascacio V. G. Biological activities of peptides obtained by pepsin hydrolysis of fishery products. Process Biochem., 120, 53–63 (2022). doi: 10.1016/j.procbio.2022.05.029
  8. Gorguc A., Gencdağ E., and Yılmaz F. M. Bioactive peptides derived from plant origin by-products: biological activities and techno-functional utilizations in food developments – a review. Food Res. Int., 136, 109504 (2020). doi: 10.1016/j.foodres.2020.109504
  9. Karami Z. and Akbari-Adergani B. Bioactive food derived peptides: A review on correlation between structure of bioactive peptides and their functional properties. J. Food Sci. Technol., 56, 535–547 (2019). doi: 10.1007/s13197-018-3549-4
  10. Nwachukwu I. D. and Aluko R. E. Structural and functional properties of food protein-derived antioxidant peptides. J. Food Biochem., 43 (1), e12761 (2019). doi: 10.1111/jfbc.12761
  11. Tacias-Pascacio V. G., Morellon-Sterling R., Castaneda-Valbuena D., Berenguer-Murcia, A., Kamli M. R., Tavano O., and Fernandez-Lafuente R. Immobilization of papain: a review. Int. J. Biol. Macromol., 188, 94–113 (2021). doi: 10.1016/j.ijbiomac.2021.08.016
  12. Balbinott N. and Margis R. Review: Unraveling the origin of the structural and functional diversity of plant cystatins. Plant Sci., 321, 111342, (2022). doi: 10.1016/j.plantsci.2022.111342
  13. Singleton A. and Buttle D. J. Ficain. In: Handbook of Proteolytic Enzymes (3rd ed.), Ed. by N. D. Rawlings and G. Salvesen (Acad. Press, 2013), pp. 1877–1879.
  14. Baidamshina D. R., Trizna E. Y., Holyavka M. G., Bogachev M. I., Artyukhov V. G., Akhatova F. S., Rozhina E. V., Fakhrullin R. F., and Kayumov A. R. Targeting microbial biofilms using Ficin, a nonspecific plant protease. Sci. Rep., 7 (1), 46068 (2017). doi: 10.1038/srep46068
  15. Baidamshina D. R., Trizna E. Yu., Goncharova S. S., Sorokin A. V., Lavlinskaya M. S., Melnik A. P., Gafarova L. F., Kharitonova M. A., Ostolopovskaya O. V., Artyukhov V. G., Sokolova E. A., Holyavka M. G., Bogachev M. I., Kayumov A. R., and Zelenikhin P. V. The effect of ficin immobilized on carboxymethyl chitosan on biofilms of oral pathogens. Int. J. Mol. Sci., 24, 16090 (2023). doi: 10.3390/ijms242216090
  16. Koroleva V. A., Trizna E. Y., Pankova S. M., Agafonova M. N., Chirkova M. N., Vasileva O. S., Akhmetov N.,Shubina V. V., Porfiryev A. G., Semenova E. V., Sachenkov O. A., Bogachev M. I., Artyukhov V. G., Baltina T. V., Holyavka M. G., and Kayumov A. R. Anti-biofilm and wound-healing activity of chitosan-immobilized Ficin. Int. J. Biol. Macromol., 164, 4205–4217 (2020). doi: 10.1016/j.ijbiomac.2020.09.030
  17. Rosenberg L., Krieger Y., Bogdanov-Berezovski A., Silberstein E., Shoham Y., and Singer A. J. A novel rapid and selective enzymatic debridement agent for burn wound management: A multi-center RCT. Burns, 40 (3), 466–474 (2014). doi: 10.1016/j.burns.2013.08.013
  18. Sharaf A. and Muthayya P. Microbial profile of burn wounds managed with enzymatic debridement using bromelainbased agent, NexoBridR. Burns, 48, 1618–1625 (2021). doi: 10.1016/j.burns.2021.12.004
  19. Abbas S., Shanbhag T., and Kothare A. Applications of bromelain from pineapple waste towards acne. Saudi J. Biol. Sci., 28, 1001–1009 (2020). doi: 10.1016/j.sjbs.2020.11.032
  20. Holyavka M. G., Goncharova S. S., Sorokin A. V., Lavlinskaya M. S., Redko Yu. A., Faizullin D. A., Baidamshina D. R., Zuev Y. F., Kondratyev M. S., Kayumov A. R., and Artyukhov V. G. Novel biocatalysts based on bromelain immobilized on functionalized chitosans and research on their structural features. Polymers, 14, 5110 (2022). doi: 10.3390/polym14235110
  21. Morse C. R., Wang H., Donahue D. M., Garrity J. M. and Allan J. S. Use of proteolytic enzymes in the treatment of proteinaceous esophageal food impaction. J. Emergency Med., 50, 183–186 (2016). doi: 10.1016/j.jemermed.2015.07.018
  22. Dietrich R. E. Oral proteolytic enzymes in the treatment of athletic injuries: a double-blind study. Pennsyl. Med. J., 68, 35–37 (1965).
  23. Veraldi S., Barbareschi M., Guanziroli E., Bettoli V., Minghetti S., Capitanio B., Sinagra J. L., Sedona P., and Schianchi R. Treatment of mild to moderate acne with a fixed combination of hydroxypinacolone retinoate, retinol glycospheres and papain glycospheres. G. Ital. Dermatol. Venereol., 150, 143–147 (2015).
  24. Bussadori S. K., de Godoy C. H. L., Alfaya T. A., Fernandes K. P. S., Mesquita-Ferrari R. A., and Motta L. J. Chemo-mechanical caries removal with Papacarie™: case series with 84 reports and 12 months of follow-up. J. Contemp. Dent. Pract., 15, 250–253 (2014). doi: 10.5005/jp-journals-10024-1523
  25. Juntavee J., Peerapattana A., Ratanathongkam N., Nualkaew N., Chatchiwiwattana S., and Treesuwan P. The antibacterial effects of apacaries gel on Streptococcus mutans: An in vitro study. Int. J. Clin. Pediatr. Dent., 7, 77–81 (2014). doi: 10.5005/jp-journals-10005-1241
  26. Venkataraghavan K., Kush A., Lakshminarayana C. S., Diwakar L., Ravikumar P., Patil S., and Karthik S. Chemomechanical caries removal: A review & study of an indigenously developed agent (Carie Care (TM) Gel) in children. J. Int. Oral Health, 5, 84–90 (2013).
  27. Baidamshina D. R., Koroleva V. A., Olshannikova S. S., Trizna E. Yu., Bogachev M. I., Artyukhov V. G., Holyavka M. G., and Kayumov A. R. Biochemical properties and anti-biofilm activity of chitosan-immobilized papain. Marine Drugs, 19, 197 (2021). doi: 10.3390/md19040197
  28. Cstorer A. and Menard R. Catalytic mechanism in papain family of cysteine peptidases. Proteolytic Enzymes: Serine and Cysteine Peptidases. Methods Enzymol., 244, 486–500 (1994). doi: 10.1016/0076-6879(94)44035-2
  29. Koroleva V., Lavlinskaya M., Holyavka M., Penkov N., Zuev Y., and Artyukhov V. Thermal inactivation, denaturation and aggregation processes of papain-like proteases. Chemistry & biodiversity, e202401038 (2024). doi: 10.1002/cbdv.202401038
  30. Bekhit A. A., Hopkins D. L., Geesink G., Bekhit A. A., and Franks P. Exogenous proteases for meat tenderization. Crit. Rev. Food Sci. Nutr., 54, 1012–1031 (2014). doi: 10.1080/10408398.2011.623247
  31. Ashie I. N. A., Sorensen T. L., and Nielsen P. M. Effects of papain and a microbial enzyme on meat proteins and beef tenderness. J. Food Sci., 67 (6), 2138–2142 (2002). doi: 10.1111/j.1365-2621.2002.tb09516.x
  32. Kaur S., Vasiljevic T., and Huppertz T. Milk protein hydrolysis by actinidin – kinetic and thermodynamic characterization and comparison to bromelain and papain. Food, 12 (23), 4248 (2023). doi: 10.3390/foods12234248
  33. Ratanji K. D., Derrick J. P., Dearman R. J., and Kimber I. Immunogenicity of therapeutic proteins: influence of aggregation. J. Immunotoxicol., 11 (2), 99–109 (2014). doi: 10.3109/1547691X.2013.821564
  34. Arvinte T., Palais C., Green-Trexler E., Gregory S., Mach H., Narasimhan C., and Shameem M. Aggregation of biopharmaceuticals in human plasma and human serum: implications for drug research and development. mAbs., 5 (3), 491–500 (2013). doi: 10.4161/mabs.24245
  35. Ausserwoger H., Schneider M. M., Herling T. W., Arosio P., Invernizzi G., Knowles T. P. J., and Lorenzen N. Non-specificity as the sticky problem in therapeutic antibody development. Nat. Rev. Chem., 6 (12), 844–861 (2022). doi: 10.1038/s41570-022-00438-x
  36. Wang X., Das T. K., Singh S. K., and Kumar S. Potential aggregation prone regions in biotherapeutics: A survey of commercial monoclonal antibodies. mAbs., 1 (3), 254–267 (2009). doi: 10.4161/mabs.1.3.8035
  37. Tiller K. E., Li L., Kumar S., Julian M. C., Garde S., and Tessier P. M. Arginine mutations in antibody complementaritydetermining regions display context-dependent affinity/specificity trade-offs. J. Biol. Chem., 292 (40), 16638–16652 (2017). doi: 10.1074/jbc.M117.783837
  38. Kelly R. L., Le D., Zhao J., and Wittrup K. D. Reduction of nonspecificity motifs in synthetic antibody libraries. J. Mol. Biol., 430 (1), 119–130 (2018). doi: 10.1016/j.jmb.2017.11.008
  39. Birtalan S., Zhang Y., Fellouse F. A., Shao L., Schaefer G., and Sidhu S. S. The intrinsic contributions of tyrosine, serine, glycine and arginine to the affinity and specificity of antibodies. J. Mol. Biol., 377 (5), 1518–1528 (2008). doi: 10.1016/j.jmb.2008.01.093
  40. Rupakheti C. R., Roux B., Dehez F., and Chipot C. Modeling induction phenomena in amino acid cation–π interactions. Theor. Chem. Acc., 137, 174 (2018). doi: 10.1007/s00214-018-2376-z
  41. Rose G. D., Geselowitz A. R., Lesser G. J., Lee R. H., and Zehfus M. H. Hydrophobicity of amino acid residues in globular proteins. Science, 229 (4716), 834–838 (1985).
  42. Rosace A., Bennett A., Oeller M., Mortensen M. M., Sakhnini L., Lorenzen N., Poulsen C., and Sormanni P. Automated optimisation of solubility and conformational stability of antibodies and proteins. Nat. Commun., 14, 1937 (2023). doi: 10.1038/s41467-023-37668-6
  43. Mant C. T., Kovacs J. M., Kim H. M., Pollock D. D., and Hodges R. S. Intrinsic amino acid side-chain hydrophilicity/hydrophobicity coefficients determined by reversedphase high-performance liquid chromatography of model peptides: comparison with other hydrophilicity/hydrophobicity scales. Biopolymers, 92 (6), 573–595 (2009). doi: 10.1002/bip.21316
  44. Hebditch M., Carballo-Amador M. A., Charonis S., Curtis R., and Warwicker J. Protein-Sol: a web tool for predicting protein solubility from sequence. Bioinformatics, 33 (19), 3098–3100 (2017). doi: 10.1093/bioinformatics/btx345
  45. Kharat S. J. Density, viscosity and ultrasonic velocity studies of aqueous solutions of sodium acetate at different temperatures. J. Mol. Liquids, 140 (1–3), 10–14 (2008). doi: 10.1016/j.molliq.2007.12.006
  46. Bisht M., Jha I., and Venkatesu P. Comprehensive Evaluation of Biomolecular Interactions between Protein and Amino Acid Based-Ionic Liquids: A Comparable Study between [Bmim][Br] and [Bmim][Gly] Ionic Liquids. ChemistrySelect, 1 (13), 3510–3519 (2016). doi: 10.1002/slct.201600524
  47. Baker E. N., Boland M. J., Calder P. C., and Hardman M. J. The specificity of actinidin and its relationship to the structure of the enzyme. Biochim. Biophys. Acta, 616, 30–34 (1980). doi: 10.1016/0005-2744(80)90260-0
  48. Haesaerts S., Rodriguez Buitrago J. A., Loris R., Baeyens-Volant D., and Azarkan M. Crystallization and preliminary X-ray analysis of four cysteine proteases from Ficus carica latex. Acta Crystallogr. Sect. F Struct. Biol. Commun., 71, 459–465 (2015). doi: 10.1107/S2053230X15005014
  49. Сакибаев Ф. А., Холявка М. Г. и Артюхов В. Г. Особенности пространственных структур молекул растительных протеаз −бромелина, фицина и папаина. Вестн. ВГУ. Серия «Химия. Биология. Фармация», 3, 57–62 (2020).
  50. Pankova S. M., Sakibaev F. A., Holyavka M. G., and Artyukhov V. G. A possible role of charged amino-acid clusters on the surface of cysteine proteases for preserving activity when binding with polymers. Biophysics, 67 (1), 8–14 (2022). doi: 10.1134/S0006350922010146

Supplementary files

Supplementary Files
Action
1. JATS XML
Download

Copyright (c) 2025 Russian Academy of Sciences

Согласие на обработку персональных данных с помощью сервиса «Яндекс.Метрика»

1. Я (далее – «Пользователь» или «Субъект персональных данных»), осуществляя использование сайта https://journals.rcsi.science/ (далее – «Сайт»), подтверждая свою полную дееспособность даю согласие на обработку персональных данных с использованием средств автоматизации Оператору - федеральному государственному бюджетному учреждению «Российский центр научной информации» (РЦНИ), далее – «Оператор», расположенному по адресу: 119991, г. Москва, Ленинский просп., д.32А, со следующими условиями.

2. Категории обрабатываемых данных: файлы «cookies» (куки-файлы). Файлы «cookie» – это небольшой текстовый файл, который веб-сервер может хранить в браузере Пользователя. Данные файлы веб-сервер загружает на устройство Пользователя при посещении им Сайта. При каждом следующем посещении Пользователем Сайта «cookie» файлы отправляются на Сайт Оператора. Данные файлы позволяют Сайту распознавать устройство Пользователя. Содержимое такого файла может как относиться, так и не относиться к персональным данным, в зависимости от того, содержит ли такой файл персональные данные или содержит обезличенные технические данные.

3. Цель обработки персональных данных: анализ пользовательской активности с помощью сервиса «Яндекс.Метрика».

4. Категории субъектов персональных данных: все Пользователи Сайта, которые дали согласие на обработку файлов «cookie».

5. Способы обработки: сбор, запись, систематизация, накопление, хранение, уточнение (обновление, изменение), извлечение, использование, передача (доступ, предоставление), блокирование, удаление, уничтожение персональных данных.

6. Срок обработки и хранения: до получения от Субъекта персональных данных требования о прекращении обработки/отзыва согласия.

7. Способ отзыва: заявление об отзыве в письменном виде путём его направления на адрес электронной почты Оператора: info@rcsi.science или путем письменного обращения по юридическому адресу: 119991, г. Москва, Ленинский просп., д.32А

8. Субъект персональных данных вправе запретить своему оборудованию прием этих данных или ограничить прием этих данных. При отказе от получения таких данных или при ограничении приема данных некоторые функции Сайта могут работать некорректно. Субъект персональных данных обязуется сам настроить свое оборудование таким способом, чтобы оно обеспечивало адекватный его желаниям режим работы и уровень защиты данных файлов «cookie», Оператор не предоставляет технологических и правовых консультаций на темы подобного характера.

9. Порядок уничтожения персональных данных при достижении цели их обработки или при наступлении иных законных оснований определяется Оператором в соответствии с законодательством Российской Федерации.

10. Я согласен/согласна квалифицировать в качестве своей простой электронной подписи под настоящим Согласием и под Политикой обработки персональных данных выполнение мною следующего действия на сайте: https://journals.rcsi.science/ нажатие мною на интерфейсе с текстом: «Сайт использует сервис «Яндекс.Метрика» (который использует файлы «cookie») на элемент с текстом «Принять и продолжить».