Синтез, свойства и антибактериальная активность цинкзамещенного гидроксиапатита

Полный текст

ВВЕДЕНИЕ

Гидроксиапатит кальция (Ca₁₀(PO₄)₆(OH)₂, ГА) благодаря структурному сходству с минеральным компонентом кости является биоактивным материалом и рассматривается как подходящий для использования в имплантологии [1–5]. ГА является превалирующим неорганическим компонентом костной ткани и эмали зубов человека (60-70% в костной ткани). Он обладает высокой биосовместимостью, отсутствием иммуногенности, канцерогенности и медленным разрушением [6–8]. Кроме того, ГА способен к стимуляции костеобразования [9].

После имплантации в организм материалов на основе как биогенного, так и синтезированного ГА могут возникнуть воспалительные процессы, вызванные грамположительными бактериями Staphylococcus aureus (S. aureus) [10]. Поскольку сам ГА не обладает обеззараживающими свойствами, целесообразно его применение с бактерицидными агентами. Так как использование антибиотиков не всегда оправдано, в последние годы внимание исследователей привлекают неорганические антимикробные агенты из-за их стабильности и безопасности [11]. По большей части это неорганические антимикробные агенты [12] — ионы меди [13], серебра [14, 15] и цинка [16, 17], которые способны замещать ионы кальция в кристаллической решетке. Замещающие ионы могут провоцировать изменения параметров кристаллической решетки, симметрии кристаллов, морфологии, растворимости, биологических характеристик [18, 19]. Введение в состав ГА катионов металлов придает керамическим материалам бактерицидные свойства и улучшает пролиферацию остеобластов [9, 20, 21].

Ион Zn²⁺ в отличие от вышеперечисленных ионов является важным компонентом, способствующим метаболической активности в организме человека и поддерживающим здоровье костей. Деление клеток, рост клеток и заживление ран являются важными функциями Zn²⁺. Большинство исследований [22, 23], проведенных с цинксодержащими ГА, указывают на концентрацию цинка в диапазоне от 0.1 до 4%. Наилучшие результаты биосовместимости и остеокондукции достигаются при концентрации Zn²⁺ ~1–2% [24]. При более высоких концентрациях Zn²⁺ (свыше 2%) в ZnГА эффективность в отношении бактерий эмали (S. mutans, Lactobacillaceae и Streptococcus sobrinus) сохраняется, в то время как биосовместимость нарушается.

Цель работы – проведение комплексного химического исследования ГА Ca₁₀(PO₄)₆(OH)₂ и ZnГА Ca_9.9Zn_0.1(PO₄)₆(OH)₂ с целью установления структуры, а также изучение растворимости образцов в физиологическом растворе, способности формирования кальций-фосфатного слоя на их поверхности в модельной среде биологической жидкости и антибактериальной активности.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Материалы и методы. Ca(NO₃)₂·4H₂O («х.ч.», ГОСТ 4142-77), Zn(NO₃)₂·6H₂O («х.ч», ГОСТ 5106-77), NaCl («ч.д.а.», ГОСТ 4233-77), стандарт-титр Трилон Б (0.1 Н, ТУ 2642-002-62931140-2014), NaCl («х.ч.» ГОСТ 4233), HCl («х.ч.», 1 моль/л, ГОСТ 3118), CaCl₂ («х.ч.», ТУ 6-09-4711-81), Na₂SO₄ («х.ч.», ГОСТ 4166), трис(гидроксиметил)аминометан (ТРИС) (HOCH₂)₃CNH₂ («х.ч.», ТУ 6-09-4292-76) – «ЛенРеактив» (Санкт-Петербург, Россия), (NH₄)₂HPO₄ («ч.д.а.», ГОСТ 3772-74), NH₄OH 25% («ос.ч.»), NaHCO₃ («х.ч.», ГОСТ 4201), KCl («х.ч.», ГОСТ 4234), K₂HPO₄‧3H₂O («ч.д.а.» ГОСТ 2493), MgCl₂‧6H₂O («ч.д.а». ГОСТ 4209),– «Ареолаб» (Москва, Россия), Эриохром черный Т («ч.д.а.», ТУ 6-09-1760-87).

Рентгенофазовый анализ для определения фазового состава образцов ГА и ZnГА проводился на рентгеновском дифрактометре Shimadzu XRD-7000 X-RAY Diffractometer. Образцы исследовались в диапазоне углов 2θ от 20° до 60° с шагом сканирования 0.01° и временем экспозиции 2 с на CuK_α-излучении, измерения проводились при комнатной температуре. Функция разрешения рентгеновского дифрактометра Shimadzu XRD-7000 определялась в специальном дифракционном эксперименте на порошке Si (стандартный эталонный порошок Silicon powder, 99%, 325 mesh фирмы Shimadzu Corporation). Оценка размера и микронапряжений исследуемых порошков ГА осуществлялась по методу Вильямсона-Холла, в соответствии с которым FWHM зависит от θ согласно уравнению

$FWHM\cdot \cos \theta =\frac{\lambda }{D}+4\epsilon \cdot \sin \theta ,$ (1)

где FWHM – ширина на полувысоте интегральных пиков, рад; λ = 1.5406 – длина волны CuK_α-излучения, Å; D – искомый размер ОКР, нм; ε – безразмерное значение микронапряжения; θ – брэгговский угол, рад.

Функциональные группы, присутствующие в образце ZnГА, определяли с помощью инфракрасной спектроскопии с преобразованием Фурье (FTIR) с использованием спектрофотометра VERTEX 70 (BRUKER, Германия) в среднем инфракрасном диапазоне 400–4000 см^-1.

Анализ морфологии поверхности порошков и дисков ГА и ZnГА проводился с использованием сканирующего электронного микроскопа сверхвысокого разрешения JEOL JSM-7500F (Япония). Содержание элементов в образцах ГА и ZnГА определяли с использованием энергодисперсионной приставки Inca X-sight. Для проведения энергодисперсионного анализа синтезированные образцы прессовали в виде дисков под давлением 500 МПа.

Растворимость порошков ZnГА и ГА была оценена по суммарному содержанию ионов Ca²⁺ в физиологическом растворе (ω(NaCl) = 0.9 %), в котором выдерживался образец при 20±1 и 37±1°С в течение 7 суток. Объем раствора и массы образцов определяли согласно рекомендациям ГОСТ ISO 10993-5-2023. Содержание Ca²⁺ в растворе определено методом трилонометрического титрования в присутствии эриохрома черного Т с аммиачным буфером, рН 9–10. Для отбора проб использовали шприцевой мембранный фильтр с размером пор 0.45 мкм.

Биологическую активность ГА оценивали по формированию кальций-фосфатного слоя (КФС) на поверхности образцов ГА в модельном SBF-растворе (SBF – Simulated Body Fluid), имитирующем плазму крови человека, по методике, предложенной Кокубо [25]. Исходный состав реагентов для SBF соответствует работе [26]. Каждый образец помещали в стерильную закрывающуюся пластиковую пробирку с раствором и выдерживали в термостате при 37±1°С в течение 28 суток с ежедневным обновлением раствора.

Анализ антибактериальной активности порошков ГА проводили методом серийных разведений (ГОСТ Р ИСО 20776-1 − 2022). Для анализа образцов были выбраны 4 штамма микроорганизмов: Escherichia coli, Acinetobacter calcoaceticus, Bacillus cereus, Staphylococcus aureus. Определение чувствительности бактерий к антимикробному воздействию образцов проводили в планшетах для иммуноферментного анализа на 96 лунок. В лунки вносился питательный мясо-пептонный бульон + 0.2 % глюкозы. Последовательным разбавлением формировался градиент концентраций исследуемых образцов. Опыт проводился в трех повторениях. Для посева из суточных бактериальных культур готовили бактериальные взвеси в 0.15 М NaСl с мутностью 1 по Мак-Фарланду (≈3.0х10⁸ КОЕ). Полученными взвесями контаминировались лунки с образцами и контрольными лунками. Инкубацию проводили при температуре 37°С в течение 24 ч.

Синтез ГА и ZnГА. Для получения образцов ГА готовили стехиометрически необходимое количество нитрата кальция(II) из расчета, что концентрация ионов кальция составляет 0.5 моль/л. В случае ZnГА готовили раствор, содержащий суммарно 0.5 моль/л нитратов кальция(II) и цинка(II). Затем при интенсивном перемешивании в обоих случаях прибавляли раствор гидрофосфата аммония с концентрацией 0.3 моль/л, после чего pH доводили до 10 концентрированным раствором аммиака (ρ = 0.91 г/мл). Процесс получения ZnГА приведен ниже:

9.9Ca(NO₃)₂ + 0.1Zn(NO₃)₂ + 6(NH₄)₂HPO₄ + + 8NH₄OH = Ca_9.9Zn_0.1(PO₄)₆(OH)₂ + + 20NH₄NO₃ + 6H₂O. (2)

Полученный осадок вместе с раствором подвергали обработке ультразвуком (UL TRANSONIC CLEANER TC-50, частота 40кГц, мощность 60 Вт) в течение 30 мин. Осадок отстаивали 48 ч, после чего его отделяли от маточного раствора фильтрованием, промывали горячей (60°С) водой на фильтре, высушивали 2 ч при 100°С, а затем в течение 1 ч при 250°С. После сушки образец отжигали в муфельной печи при 900°С в течение 2 ч.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Для описания механизма замещения ионов Ca²⁺ на Zn²⁺ необходимо рассмотреть структуру ГА [27]. Известны две кристаллические формы ГА: моноклинная в пр. гр. P2₁/b и гексагональная в пр. гр. P6₃/m (рис. 1а). Гексагональная фаза встречается чаще, поскольку моноклинная форма легко дестабилизируется присутствием примесей и посторонних веществ [28]. Гексагональная структура содержит два положения Ca1 и Ca2 и фосфатные ионы, пересеченные параллельными каналами, заполненными ионами OH^-. На рис. 1б, 1в можно увидеть, что Са2 расположены в шахматном порядке треугольной формы, тогда как Ca1 расположены в столбцах параллельно ОН^–-каналам [27, 29, 30]. Длины связей составляют: Ca1–P — 3.2 Å, Ca2–P — 3.0 Å, Ca1–H — 5.4 Å, Ca2–H — 2.8 Å.

 

Рис. 1. Решетка ГА с узлами Са (а), координационные полиэдры (б), вид структуры ГА по оси c (в), полученные с помощью программы VESTA 3.

 

На рис. 2 приведены данные рентгенофазового анализа синтезированных образцов ГА (а) и ZnГА (б) в диапазоне 20° < 2θ < 60°. Полученные образцы демонстрируют хорошо разрешенные дифракционные картины, соответствующие фазе ГА в гексагональной форме. Для уточнения параметров кристаллической решетки и влияния ионов Zn²⁺ на структуру ГА был проведен анализ образцов по методу Ритвельда. Это проверенный метод, обычно используемый для анализа кристаллической структуры [31, 32]. Уточнение выполнено на основании cif-файла ГА с гексагональной кристаллической решеткой и пр. гр. P6₃/m, полученного авторами [33]. Фон, масштаб, форма линии профиля, параметры кристаллической решетки уточнялись постепенно до получения наименьшего значения параметра соответствия (Goodness of Fit – GOF).

 

Рис. 2. Рентгеновские дифрактограммы синтезированных образцов ГА (а) и ZnГА (б) и аппроксимация методом Ритвельда: экспериментальные данные представлены красной сплошной линией, расчетный профиль – синяя сплошная линия, кривая разницы (экспериментальная минус рассчитанная) – сплошная красная линия .

 

Оценка размера кристаллитов (областей когерентного рассеяния) и микронапряжений исследуемых порошков ГА и ZnГА осуществлялась по методу Вильямсона–Холла [34, 35] (рис. 3).

 

Рис. 3. Зависимости уширения пиков (β) порошков ГА (а) и ZnГА (б) от угла отражения (θ) (ур-е 1), представленные в линеаризованных координатах в соответствии с методом Вильямсона – Холла.

 

Определенные значения кристаллографических параметров, размер кристаллитов, величина микронапряжений и параметра соответствия (Goodness of Fit) приведены в табл. 1.

 

Таблица 1. Параметры кристаллической решетки, размеры кристаллитов, величины микронапряжений и параметра соответствия (GOF)

Образец	а = b, Å	c, Å	D, нм	ε×104	GOF
ГА	9.4187 ±0.0006	6.8816 ±0.0005	85	1.25	1.69
ZnГА	9.4177 ±0.0006	6.8805 ±0.0005	55	1.75	1.71

 

Искажения параметров элементарной ячейки в образце ZnГА вызваны встраиванием модифицирующего иона в кристаллическую решетку ГА. Это явление связано с меньшим значением ионного радиуса цинка (0.74 Å) по отношению к кальцию (0.99 Å) [36]. Изменение параметров элементарной ячейки ГА в образце ZnГА на 0.001 Å является доказательством вхождения ионов Zn²⁺ в кристаллическую решетку ГА, что согласуется с данными [37–39].

На основании данных [2, 40, 41] для синтезированного образца ZnГА определены основные характеристические частоты колебаний групп PO₄^3- и OH^-. ИК-спектры образцов ГА и ZnГА приведены на рис. 4.

 

Рис. 4. ИК-спектры образцов ГА (красная линия), ZnГА (черная линия).

 

Полосы поглощения в ИК-спектрах соединений совпадают. Полосы поглощения функциональных групп ГА и ZnГА приведены в табл. 2.

 

Таблица 2. Полосы поглощения функциональных групп ГА и ZnГА в ИК-спектрах

Функциональная группа	Полоса поглощения, см–1	Литературные данные
ОН- структурная	3572, 631	[42]
PO43- изгиба ν4	600	[19, 43]
PO43- изгиба ν2	474	[44]
PO43- растяжения ν1	962	[45]
PO43- изгиба ν3	1024, 1087	[46, 47]

 

Растровая электронная микроскопия использовалась для оценки структуры, размеров частиц и изучения морфологии поверхности образцов на основе ГА и ZnГА в форме дисков. Микроструктура была исследована в режиме детектирования вторичных электронов. Преимущество использования режима регистрации вторичных электронов заключается в возможности исследования морфологии поверхности с зависимостью контрастности от рельефа [48].

На рис. 5а и 5б приведены микрофотографии ГА при увеличении в 2500 и 10000 раз соответственно. Синтезированный образец представляет собой агломераты микрометрового размера, состоящие из более мелких частиц размером 300-500 нм. Анализируя структуру образца ZnГА при увеличении в 2500 и 10000 раз (рис. 5в, 5г), можно сделать вывод, что агломераты образца состоят из спеченных частиц сферической формы с размером 200–400 нм.

 

Рис. 5. Микрофотографии образцов ГА (а, б) и ZnГА (в, г) при разных увеличениях.

 

На рис. 6 представлены область сканирования 30 × 20 мкм (а), ЭДА-спектр образца ZnГА (б), карты распределения элементов в образце ZnГА (в). Аналогичное исследование выполнено для ГА. Результаты энергодисперсионного микроанализа ZnГА приведены в табл. 3. По результатам ЭДА, для исследуемого образца ГА характерно наличие следующих элементов: Ca, P и O. В образце ZnГА присутствует сигнал Zn, который по отношению к пикам других элементов имеет низкую интенсивность, поскольку степень замещения кальция на цинк в ходе синтеза составляет порядка 1%. В результате анализа были рассчитаны соотношения Ca/P и (Ca+Zn)/P, равные 1.68 и 1.66 соответственно. Полученные кальций-фосфатные соотношения близки к значению в стехиометрическом ГА (1.67) [46, 49, 50].

 

Рис. 6. Область сканирования образца (а), ЭДА-спектр образца ZnГА, карта распределения элементов в образце ZnГА (в–е).

 

Таблица 3. Элементный состав синтезированных образцов ГА

Элемент	C, ат.%
	ГА	ZnГА
O	65.42	71.20
P	12.88	10.81
Ca	21.70	17.81
Zn	-	0.18
Ca/P	1.68	-
(Ca+Zn)/P	-	1.66

 

Способность материала к резорбции можно определить с использованием величин растворимости. В табл. 4 приведены значения растворимости порошков ГА и ZnГА в физиологическом растворе при температурах 20±1 и 37±1°С.

 

Таблица 4. Растворимость порошков ГА и ZnГА в физиологическом растворе при рН 7, ω (NaCl) = 0.9%

Образец	Концентрация ионов Ca2+х103, моль/л
	20°С	37°С
ГА	1	1.5
ZnГА	2	3

 

Растворимость ZnГА при комнатной температуре и 37°С выше растворимости незамещенного ГА в 2 раза. Увеличение растворимости связано с уменьшением размера кристаллитов на 35% (табл. 1), а также с микронапряжениями, возникающими при встраивании ионов Zn²⁺ в структуру ГА в модифицированном образце [51, 52]. В свою очередь увеличение растворимости ZnГА положительно повлияет на резорбируемость материалов на его основе [53].

Способность вещества связываться с костями нередко оценивается при изучении способности апатита образовываться на поверхности материала в моделируемом растворе SBF, содержащем концентрацию ионов, почти равную концентрации ионов плазмы крови человека. Скорость формирования КФС на поверхности таблеток ZnГА, ГА оценена по уменьшению суммарной концентрации ионов кальция и магния (ΔС(Ca²⁺ + Mg²⁺), моль/л) в растворе SBF. На основании измеренной суммарной концентрации ионов Са²⁺ и Мg²⁺ в растворе построены кинетические кривые (ΔС(Са²⁺ + Мg²⁺), моль/л – τ, сут) их накопления на поверхностях подложек из раствора SBF (рис. 7). В ежедневно отбираемых пробах комплексонометрическим титрованием определяли суммарное содержание ионов Ca²⁺ и Mg²⁺ в связи с близкими значениями констант устойчивости комплексов кальция и магния с ЭДТА.

 

Рис.7. Кривые накопления ионов Са2+ и Мg2+ на поверхности таблеток ГА (красная линия), ZnГА (черная линия) из раствора SBF.

 

Согласно данным [54–56], выдерживание образцов ГА в растворе SBF приводит к адсорбции ионов Ca²⁺, Mg²⁺, HPO₄^2–, PO₄^3–, OH^– и образованию нового КФС.

Элементный состав и морфология поверхности дисков, выдержанных в растворе SBF, были оценены перед экспериментом (0 суток), на 14- и 28-е сутки. На рис. 8 можно увидеть, что после выдерживания образца ZnГА в растворе SBF на 14-е сутки происходит укрупнение частиц вследствие образования апатитового слоя. Размер зерен составляет около 300–400 нм. К 28-м суткам наличие КФС становится явным, размер зерен фосфатов кальция на поверхностном слое составляет 400–600 нм. По истечении 14 суток в спектре ЭДА можно увидеть характерный пик Mg²⁺, свидетельствующий о его сорбции из раствора.

 

Рис. 8. Микрофотографии поверхности образца ZnГА при увеличении в 10000 раз (а–в), показывающие динамику роста КФС, и ЭДА-спектры (г–е) образца ZnГА, выдержанного в растворе SBF в течение 0, 14, 28 суток.

 

Для анализа антибактериальной активности образцов были выбраны 4 штамма микроорганизмов. Два штамма грамотрицательных: Escherichia coli, Acinetobacter calcoaceticus (клеточная стенка состоит из двух мембран и монослоя пептидогликана), два штамма грамположительных: Bacillus cereus, Staphylococcus aureus (клеточная стенка состоит из одной мембраны и множественного слоя пептидогликана). Штаммы микроорганизмов выращивали на плотных питательных средах при 37°С в течение одних суток. Минимальная концентрация образца, которой достаточно для подавления жизнедеятельности бактерии (минимальная ингибирующая концентрация МИК), определялась по отсутствию прорастания бактерий в соответствующих лунках.

Используя метод разведений в бульоне (табл. 5), обнаружили, что образец ZnГА обладает слабыми антибактериальными свойствами [13, 57, 58]. Образец ГА активности не показал.

 

Таблица 5. Значения МИК для различных штаммов

Образец	МИК, мкг/мл
	Bacillus cereus	S. aureus	Ac. calcoaceticus	E. coli
ZnГА	4000	4000	5000	4000
ГА	-	-	-	-

 

Образец ZnГА эффективен при концентрации 4000 мкг/мл к Bacillus cereus, S. aureus, E. coli. По отношению к Ac. calcoaceticus эффективность проявляется при концентрации 5000 мкг/мл.

В статье [59] приводится близкое значение МИК препаратa Цефтриаксон, которое равно 0.12 мг/мл по отношению к E.coli и от 4 до 64 мг/мл для St. aureus. Материал на основе ZnГА можно рассматривать как биоматериал, предназначенный для костной имплантации и обладающий локальным антибактериальным эффектом.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Синтезированы ГА Ca₁₀(PO₄)₆(OH)₂ и Ca_9.9Zn_0.1(PO₄)₆(OH)₂. Снижение параметров кристаллической решетки ZnГА относительно незамещенного образца ГА на 0.001 Å указывает на замещение ионов Zn²⁺ в кристаллической решетке ГА. Полученный порошок ZnГА имеет равномерное распределение элементов по поверхности, а соотношение (Ca+Zn)/P составило 1.66. ZnГА показал более высокие значения растворимости по сравнению с ГА в физиологическом растворе. При выдерживании ГА в растворе SBF происходит образование КФС на поверхности. Исследование антибактериальной активности показали, что ГА не обладает антибактериальными свойствами, а ZnГА имеет слабую антибактериальную активность по отношению к грамотрицательным (Escherichia coli, Acinetobacter calcoaceticus) и к грамположительным микроорганизмам (Bacillus cereus, Staphylococcus aureus), поэтому материал на основе ZnГА в перспективе может применяться как биоактивный с антибактериальными свойствами для костной имплантации.

БЛАГОДАРНОСТЬ

Работа выполнена на оборудовании НОЦ ЦКП “Диагностика структуры и свойств наноматериалов” и ИЛ УНПК “Аналит” ФГБОУ ВО “Кубанский государственный университет”.

ФИНАНСИРОВАНИЕ РАБОТЫ

Работа выполнена при поддержке Министерства науки и образования РФ (проект государственного задания FZEN-2023-0006).

КОНФЛИКТ ИНТЕРЕСОВ

Авторы заявляют, что у них нет конфликта интересов.

Об авторах

М. В. Папежук

Кубанский государственный университет

Автор, ответственный за переписку.
Email: marina-marina322@mail.ru
Россия, 350040 Краснодар, ул. Ставропольская, 149

С. Н. Иванин

Кубанский государственный университет

Email: marina-marina322@mail.ru
Россия, 350040 Краснодар, ул. Ставропольская, 149

В. А. Волынкин

Кубанский государственный университет

Email: marina-marina322@mail.ru
Россия, 350040 Краснодар, ул. Ставропольская, 149

П. П. Якупов

Санкт-Петербургский государственный университет

Email: marina-marina322@mail.ru
Россия, 199034 Санкт-Петербург, Университетская наб., 7-9

Л. В. Васильева

Кубанский государственный университет

Email: marina-marina322@mail.ru
Россия, 350040 Краснодар, ул. Ставропольская, 149

Список литературы

Дополнительные файлы