Effect of heavy metals on mycorrhization roots of legume-¬rhizobia symbiosystems of Pisum sativum L.

Texto integral

Введение

В последнее время все большую актуальность приобретает проблема загрязнения почв сельскохозяйственных угодий солями тяжелых металлов (ТМ) [1, 2]. Причем, как правило, эти загрязнения характеризуются полиэлементным типом [3]. Связано это в первую очередь c нерациональным применением минеральных удобрений (в частности. фосфорных), а также осадков сточных вод, используемых в качестве нетрадиционных мелиорантов [4, 5].

Известно, что представители семейства Бобовых (Fabaceae) более чувствительны к воздействию ТМ, нежели, например, Мятликовые (Poaceae) или Капустные (Brassicaceae). При этом данные виды культивируются повсеместно и являются более экологически пластичными за счет способности к образованию множественного симбиоза с широким спектром почвенных микроорганизмов, в частности, с арбускулярными грибами, формирующими на их корневой системе везикулярно-арбускулярную микоризу (ВАМ) [6, 7]. Данный симбиоз взаимовыгоден обоим партнерам, поскольку микоризные грибы обеспечивают растения водой и минеральными веществами, в основном фосфором. Последний играет важную роль в энергетическом обмене и особенно в таком энергозатратном процессе как азотфиксация [8]. Совместная инокуляция арбускулярными грибами и ризобактериями (Plant Growth Promoting Rhizobacteria – PGPR) также оказывает положительное действие на растения, главным образом за счет ингибирования развития грибных фитопатогенов [9]. Растения взамен выделяют в ризосферу различные низкомолекулярные органические соединения (экзометаболиты), используемые микробами в качестве дополнительного источника доступного углерода [10].

За счет улучшения общих (неспецифических) ответных реакций растительного организма к воздействию стрессов, связанных с повышением проницаемости мембран корневой системы для поступления в нее воды и растворенных в ней минеральных элементов, эктомикоризная колонизация также влияет на толерантность растений к ТМ, в частности, к токсичным ионам Cd, Cu, Pb, Ni, Zn [11]. Механизм влияния арбускулярных грибов на снижение аккумуляции токсикантов в растениях связан с возможностью их детоксикация внутри клеточных гиф ВАМ с участием сернистых соединений (тиолов). Проявление данного эффекта, напрямую зависит от выбора инокулянтов, поскольку устойчивость микроорганизмов к ТМ видоспецифична и может быть гораздо более высокой, чем у растений. Выделено лишь несколько линий грибов, относительно устойчивых к ТМ и относящихся к роду Glomus.

Способность хелатирования и иммобилизации ионов ТМ описана и для многих типичных представителей PGPR-бактериальной микрофлоры: Agrobacterium, Arthrobacter, Azospirillum, Bacillus, Pseudomonas,Rhizobium, Serracia и др. [12, 13]. Воздействие арбускулярных грибов и ризобий на растение при совместной инокуляции будет сильно варьировать в зависимости от конечного выбора штаммов, формирующих микробный консорциум. Механизмы, лежащие в основе взаимного влияния микроорганизмов, остаются пока недостаточно детально изученными. Однако в большинстве случаев дополнительная инокуляция бобовых культур бактериальными штаммами проявляется в положительном аспекте, связанном с усилением процессов стимуляции роста и микоризации корневой системы растений, даже в отсутствие металл-индуцированного стресса.

Цель работы – оценка изменения формировании ВАМ на корнях бобово-ризобиальной симбиоситемы гороха посевного, выращенного на загрязненной ТМ почве при инокуляции микробным консорциумом.

Методика исследования

Объектами исследования послужили разные генотипы гороха (Pisum sativum L.), полученные из коллекции ФИЦ ВИГРР им. Н. И. Вавилова (табл. 1), а также 2 генотипа из коллекции ВНИИсельскохозяйственной микробиологии – дикая линия SGE и созданный на ее основе в результате мутагенеза этилметансульфонатом Cd-устойчивый генотип SGECDt [14].

 

Таблица 1. Образцы гороха посевного (Pisum sativum L.), оцененные по способности аккумулировать и транспортировать ТМ из побега в семена (коллекция Всероссийского института генетических ресурсов растений им. Н. И. Вавилова, г. Санкт-Петербург)

№ в каталоге ВИР	Название	Происхождение	Направление использования
1027	Без названия	Германия до ١٩٤٩ г.	Кормовое
1658	Вейбуля	Швеция	Кормовое
4788	Без названия	Монголия	Кормовое
5012	Ojo negro especial	Аргентина	Зерно-овощное
8093	Telephone	Мадагаскар	Овощное
8862	Агат	Белоруссия	Кормовое
9283	Николка	РФ, Тюменская область	Кормовое
9385	Борей	РФ, Кировская область	Кормовое
9540	ID29001914	Австралия	Кормовое

 

Растения выращивали в эмалированных сосудах, заполненных 2.0 кг залежной дерново-подзолистой почвы слабой степени окультуренности. Агрохимическая характеристика почвы: pH_KCl 4.63 ± 0.62, pH_H2O5.43 ± 0.32, содержание гумуса – 1.47 ± 0.01%, гидролитическая кислотность – 4.89 ± 0.02 мг-экв/100 г, сумма обменных оснований – 7.30 ± 0.70 мг-экв/100 г, подвижные K₂O – 87.7 ± 7.3 и P₂O₅ – 106 ± 5 мг/кг. На каждый сосуд приходилось по 5 семян, что примерно соответствовало норме высева 100 семян/ м². Одновременно с посевом каждый проросток инокулировали смесью микроорганизмов (РКСМ, Санкт-Петербург, РФ, http://www.arriam.ru/kollekciya-kul-tur1/): водными суспензиями клубеньковой бактерией Rhizobium leguminosarum bv. viciae штамм CIAM1079, ассоциативной бактерией Variovorax paradoxus штамм 5C-2 (10⁷ КОЕ/мл) и 1.0 г почвенно-корневой смеси из накопительной культуры гриба Glomus sp. 1Fo.

Удобрения вносили в почву в виде питательного раствора солей из расчета конечного содержания их в почве (мг/кг): NH₄NO₃ – 15, KNO₃ – 200, KH₂PO₄ – 200, MgSO₄ – 35, CaCl₂ – 25, H₃BO₃ – 3, MnSO₄ – 3, ZnSO₄ – 3, Na₂MoO₄ – 2. Дальнейшее внесение удобрений в виде подкормок в период вегетации в схеме опыта не было предусмотрено, т. к. это могло нарушить развитие и полезное действие АМГ.

ТМ вносили в почву в виде смеси солей (мг/кг почвы): Cd – 5, Co – 25, Cr – 60, Cu – 10, Fe – 10, Hg – 3, Mn – 1, Ni – 15, Pb – 100, Sr –50, Zn – 50. Контролем служили сосуды с неинокулированными растениями. В пределах каждого генотипа и варианта было 4 аналитических повторности. Влажность субстрата в опыте поддерживали на уровне 70% ППВ путем ежедневного полива под корень, согласно расчетным формулам в зависимости от фаз онтогенеза, основанным на весовом методе. Общая продолжительность опыта составила 75 сут, до фазы полной спелости бобов.

В фазе начала созревания растения вместе с корневой системой осторожно вынимали из почвы. Корневую систему отделяли, промывали в проточной воде, избыток поверхностной влаги удаляли фильтровальной бумагой и взвешивали. Корни отделяли и фиксировали в формалине. Гистохимический анализ и количественный учет ВАМ проводили с применением метода мацерации (кипячения при 95°C) и последующим окрашиванием в течение 3 мин в растворе 10%-ной уксусной кислоты с добавлением 5% черной туши (Sheaffer Pen, Shelton, Connecticut, USA) по методике Филипс–Хейман [15]. Микроскопирование зафиксированных корней проводили с помощью светового микроскопа Axio Lab.A1 (Carl Zeiss, Germany) по методу Травло [16]. Расчет частоты микоризации и относительного количества микоризных структур (арбускул и везикул) оценивали согласно методике Воробьева с соавт. [17].

Обработку экспериментальных данных проводили с помощью статистических программ Excel 2010 (Microsoft Corp., USA). Также проводили расчет индекса когнитивной значимости (CSI) [18], с помощью вычислительной нейронной сети EuclidNN [19], анализирующей показатели микоризации и биомассы корней растений в вариантах опыта. Своей величиной данный показатель количественно характеризует уровень симбиотической активности микоризы по отношению к растению.

Результаты и их обсуждение

У всех 11-ти изученных генотипов гороха, выращенных на загрязненной ТМ почве, инокуляция растений микробным консорциумом способствовала развитию ВАМ (табл. 2).

 

Таблица 2. Параметры развития микоризных структур у различных генотипов гороха, выращенных на загрязненной ТМ почве, при инокуляции комплексом микроорганизмов (%)

Вариант	Частота микоризной инфекции	Обилие в образце		Обилие в микоризированной части ١ см корня
		арбускул	везикул	арбускул	везикул
1027 – M	1.8 ± 0.6	0.3 ± 0.3	0.0	7.5 ± 2.5	0.0
1658 – M	4.2 ± 0.9	4.2 ± 1.0	0.0	18.3 ± 2.9	0.0
4788 – M	4.3 ± 1.5	3.1 ± 1.1	0.2 ± 0.2	30.8 ± 12.0	2.5 ± 2.5
5012 – M	2.3 ± 1.6	1.4 ± 0.9	0.2 ± 0.2	10.0 ± 7.1	0.0
8093 – M	4.8 ± 1.5	3.0 ± 1.4	2.0 ± 1.7	20.8 ± 10.8	12.5 ± 12.5
8862 – M	0.7 ± 0.3	0.5 ± 0.2	0.1 ± 0.1	2.5 ± 2.5	0.0
9283 – M	8.2 ± 1.6	4.3 ± 1.3	0.7 ± 0.4	28.7 ± 9.0	5.0 ± 2.9
9385 – M	1.7 ± 0.7	1.0 ± 0.3	0.0	7.5 ± 2.5	0.0
9540 – M	3.2 ± 0.8	2.4 ± 1.4	0.2 ± 0.2	20.0 ± 10.0	2.5 ± 2.5
SGE – M	5.2 ± 0.7	2.1 ± 0.8	0.0	30.0 ± 11.5	0.0
SGECDt – M	6.7 ± 1.4	4.3 ± 0.1	0.4 ± 0.4	30.0 ± 0.1	3.3 ± 3.3
1027 + М	27.5 ± 7.5	17.0 ± 6.0	0.0	24.8 ± 6.2	0.0
1658 + М	12.0 ± 1.2	6.8 ± 1.5	0.1 ± 0.1	36.2 ± 6.7	5.0 ± 2.9
4788 + М	16.0 ± 3.0	10.6 ± 2.6	1.3 ± 0.8	25.8 ± 7.9	15.0 ± 11.9
5012 + М	10.7 ± 4.7	7.3 ± 4.4	0.5 ± 0.2	19.1 ± 7.3	5.0 ± 2.9
8093 + М	17.0 ± 2.3	15.0 ± 3.2	1.5 ± 1.1	54.8 ± 6.6	10.8 ± 4.8
8862 + М	6.8 ± 2.8	4.9 ± 2.3	0.8 ± 0.8	30.3 ± 12.9	12.5 ± 12.5
9283 + М	13.0 ± 5.7	9.5 ± 5.3	0.3 ± 0.2	25.8 ± 9.1	5.0 ± 2.9
9385 + М	10.0 ± 4.3	7.8 ± 3.1	0.2 ± 0.2	32.7 ± 8.3	2.5 ± 2.5
9540 + М	37.0 ± 4.3	4.7 ± 4.2	0.2 ± 0.2	15.5 ± 12.4	2.5 ± 2.5
SGE + М	10.0 ± 5.9	7.8 ± 3.2	0.0	23.8 ± 8.7	0.0
SGECDt + M	20.3 ± 6.1	14.2 ± 4.3	1.0 ± 0.8	32.8 ± 3.9	6.7 ± 3.3

Примечания. 1. – M – контроль без инокуляции, + М – инокуляция смесью симбиотических микроорганизмов. 2. Указаны ошибки средних.

 

На корнях некоторых неинокулированных растений также была обнаружена ВАМ, вероятно образованная аборигенными штаммами, но интенсивность микоризации в этом случае была существенно меньше, чем при инокуляции.

Искусственная инокуляция растений микробным консорциумом, в составе которого присутствовал арбускулярный гриб Glomus sp. 1Fo, в среднем способствовала увеличению встречаемости ВАМ инфекции в образцах и обилия арбускул в образце примерно в 4 раза (рис. 1). При этом, обилие везикул в образце при инокуляции растений по сравнению с контрольным вариантом повысилось незначительно.

 

Рис. 1. Средние для всех выращенных на загрязненной ТМ дерново-подзолистой почве генотипов гороха величины параметров развития микоризных структур. Параметры микоризации корней: встречаемость микоризной инфекции (F), обилие арбускул в образце (М), обилие арбускул в микоризованных фрагментах (m), обилие везикул в образце (V) и обилие везикул в микоризованных фрагментах (v). Вертикальные отрезки обозначают ошибки средних.

 

Наиболее отзывчивыми к искуственной микоризации оказались генотипы 1027 и 9540, в которых частота микоризной инфекции в опытных вариантах возросла соответственно с 1.8 до 27.5% (рост на 25.7%), и с 3.2 до 37% (рост на 33.8%) в сравнении с контрольными.

Наименее отзывчивыми к искуственной микоризации оказались генотипы 9283 и SGE, в которых частота микоризной инфекции в опытных вариантах возросла с 8.2 до 13.0% (рост на 4.8%) и с 5.2 до 10.0% (рост на 4.8%) соответственно. Отметим, что доля обилия арбускул в инокулированных растениях возрастала во всех образцах, в особенности максимальное увеличение данного показателя наблюдали угенотипов гороха 1027 и 8093, где количество арбускул в образцах увеличилось с 0.3 до 17.0% и с 3.0 до 15.0%. Было показано, что в большинстве случаев микоризация различных генотипов гороха не повлияла на интенсивность роста растений на фоне загрязнения почв ТМ (рис. 2).

 

Рис. 2. Влияние инокуляции на накопление биомассы побегов (а), биомассы корней (б). □ – неинокулированные растения, ■ – инокулированные растения. Вертикальные отрезки обозначают ошибки средних. Генотипы расположены слева направо по увеличению их коллекционного номера.

 

Исключение составили растения генотипа 1658, где в инокулированных образцах в сравнении с контролем биомасса побегов увеличилась примерно на 25%, и генотип 9385, инокуляция которого увеличила биомассу корневой системы почти в 2 раза. Были отмечены также случаи, когда инокуляция растений приводила к снижению роста корневой системы. Например, для генотипов SGECDt, 9283 и 9540 биомасса корней в опытном варианте была приблизительно в 2 раза меньше, чем у контрольных растений.

Расчет CSI-индекса показал, что микориза проявляла наибольшую симбиотическую активность для генотипа 1658 (рис. 3).

 

Рис. 3. Показатели CSI-индекса в вариантах опыта, □ – неинокулированные растения, ■ – инокулированные растения.

 

При этом в отличие от показателей биомассы инокуляция микробным консорциумом для данного генотипа приводила к существенному снижению степени микоризации. Значимо рост консолидации CSIнаблюдался только в отношении генотипов 8093 и SGE.

Заключение

Таким образом, все изученные генотипы гороха продемонстрировали способность образовывать везикулярно-арбускулярную микоризу, однако в большинстве случаев инокуляция не повышала устойчивость растений к токсическому действию тяжелых металлов (ТМ), что выражалось в отсутствии достоверных прибавок биомассы корней и побегов. С одной стороны, это можно объяснить низкой способностью выбранного штамма арбускулярного гриба в составе микробного комплекса выступать в качестве унифицированного агента, способного к сорбции ТМ. С другой стороны, визуальные параметры морфометрии не являлись достоверным критерием оценки степени микоризации макросимбионта. Расчет показателей индексов CSI дал предпосылку создания программы нейросетевого моделирования экохимических процессов, лежащих в основе интегрального взаимодействия симбиотических партнеров в условиях множественного симбиоза и стрессового влияния факторов внешней среды.

Авторы признательны доктору биологических наук А. А. Белимову за предоставление семенного материала для проведения эксперимента.

Sobre autores

N. Vorobyov

All-¬Russia Research Institute for Agricultural Microbiology

Email: puhalskyyan@gmail.com
Rússia, 196608, Saint-¬Petersburg–Pushkin, Podbelskogo sh. 3

J. Puhalsky

All-¬Russia Research Institute for Agricultural Microbiology; Pushkin Leningrad State University

Autor responsável pela correspondência
Email: puhalskyyan@gmail.com
Rússia, 196608, Saint-¬Petersburg–Pushkin, Podbelskogo sh. 3; 196605, St. Petersburg–Pushkin, Petersburgskoye sh. 10

T. Azarova

All-¬Russia Research Institute for Agricultural Microbiology

Email: puhalskyyan@gmail.com
Rússia, 196608, Saint-¬Petersburg–Pushkin, Podbelskogo sh. 3

S. Loskutov

Pushkin Leningrad State University; V. M. Gorbatov Research Center for Food Systems

Email: puhalskyyan@gmail.com

All-Russian Scientific Research Institute of Food Additives

Rússia, 196605, St. Petersburg–Pushkin, Petersburgskoye sh. 10; 191014, St. Petersburg, Liteiny prosp. 55

Yu. Laktionov

All-¬Russia Research Institute for Agricultural Microbiology

Email: puhalskyyan@gmail.com
Rússia, 196608, Saint-¬Petersburg–Pushkin, Podbelskogo sh. 3

Yu. Kosulnikov

All-¬Russia Research Institute for Agricultural Microbiology

Email: puhalskyyan@gmail.com
Rússia, 196608, Saint-¬Petersburg–Pushkin, Podbelskogo sh. 3

A. Kovalchuk

All-¬Russia Research Institute for Agricultural Microbiology

Email: puhalskyyan@gmail.com
Rússia, 196608, Saint-¬Petersburg–Pushkin, Podbelskogo sh. 3

A. Kozhemyakov

All-¬Russia Research Institute for Agricultural Microbiology

Email: puhalskyyan@gmail.com
Rússia, 196608, Saint-¬Petersburg–Pushkin, Podbelskogo sh. 3

Bibliografia

Arquivos suplementares