Experimental and theoretical evaluation of fungicidal and bactericidal activity of 3-alkyl substituted 1H-phospholane oxides

全文:

Введение

Фосфорорганические соединения (ФОС) обладают широким спектром биологической активности, благодаря чему находят применение в медицине, в сельском хозяйстве в качестве пестицидов и т. п. Преимуществом фосфорсодержащих фунгицидов, по сравнению с хлорсодержащими, является профилактическое и лечащее действие, что позволяет использовать их для протравливания и опрыскивания растений во время вегетации. В настоящее время широко используют практически единственный фунгицид фосэтил алюминия (препараты Афуган, Альетт, Превикур Энерджи и др.), обладающий высокой системной активностью против мучнистой росы, снежной плесени, корневых гнилей (рис. 1), хотя он и является малоэффективным против фитофтороза, например, томата и картофеля. Считается, что вещество не влияет непосредственно на фитопатоген, а усиливает защитные реакции самого растения, ускоряя процесс образования фенольных соединений, токсичных для грибов [1].

В качестве фунгицидов для защиты зерновых и цитрусовых культур рекомендованы некоторые фосфорсодержащие инсектициды как системного (Ипробенфос, Фенитротион, Фозалон), так и контактного (Диталимфос) действия, применение которых в качестве инсектицидов ограничено вследствие их высокой токсичности.

Таким образом, при всех преимуществах применения ФОС существует ограниченное количество известных фунгицидов на их основе. Перспективными могут являться устойчивые к окислению соединения пятивалентного фосфора, в структуре которых присутствует группа P(O)H (рис. 1), аналогично структурному фрагменту фунгицида фосэтил алюминия. К ним относятся замещенные 1H-фосфолан оксиды, синтез которых был недавно нами разработан в одну препаративную стадию из доступных реагентов – α-олефинов, триэтил- алюминия и трихлорида фосфора, в мягких условиях, с высокими выходами, что делает этот метод перспективным для практического применения [2, 3]. На сегодняшний день известно ограниченное количество подобных соединений циклической структуры [4], и, как следствие, биологическая активность данного класса остается мало- изученной. Следует также отметить, что сообщалось о противораковых свойствах некоторых представителей подобных ФОС [5].

С целью оценки фунгицидной активности новых 3-замещенных 1H-фосфолан оксидов провели исследование фунгицидной и бактериальной активности модельного соединения 3-гексил-1H-фосфолан оксида с использованием грибов родов Septoria sp., Phytophthora sp., Puccinia sp. и Aspergillus sp. и бактерии Escherichia coli. Комплексный анализ полученных экспериментальных данных и докинга (метода молекулярного моделирования, позволяющего предсказать наиболее выгодную для образования устойчивого комплекса ориентацию и конформацию одной молекулы (лиганда) в сайте связывания другой (рецептора)) на выбранных мишенях ключевых белков каждого из тест-объектов позволил оценить потенциальную пестицидную активность класса фосфоланоксидов (рис. 2).

 

Рис. 1. Структура известных фосфорорганических фунгицидов.

 

Рис. 2. Объекты исследования.

 

Методика исследования

Грибной мицелий в эксперименте выращивали на мясопептонном агаре (МПА) в концентрации 37 г/л (30.8 г питательного агара и 0.8 л дистиллированной воды). После приготовления среду автоклавировали при 120°C в течение 20 мин. В качестве стандартных соединений в экспериментах с тест-штаммами грибов использовали коммерческий фунгицид “Агролекарь” (ООО “МосАгро”), содержащий 25% д. в. (пропиконазол) в рекомендованной производителем концентрации 0.07% (7 мл/10 л раствора), в экспериментах с бактерией Escherichia coli использовали препарат “Цефазолин” для внутривенного и внутримышечного введения (д. в. – цефазолин натрия в пересчете на цефазолин – 1.0 г) в концентрации 0.2% (1 г/4 мл воды для инъекций). Исследованное соединение 3-гексил-1H-фосфолан оксид 1б синтезировано согласно разработанной нами методике [2, 3].

Фитопатогенные грибы выделены из пораженных грибами листьев растений и продуктов: грибы рода Septoria sp. – из пораженных листьев терновника (Prúnus spinósa), Phytophthora sp. – из пораженных листьев томата (Solánum lycopérsicum), Puccinia sp. – из пораженных листьев смородины черной (Ríbes nígrum), Aspergillus sp. – с пораженной поверхности томатной пасты. Штамм бактерий Escherichia coli взят из коллекции ФГБОУ ВО УГНТУ (лаборатория кафедры “Прикладная экология”).

Изучение фунгицидной активности соединений проводили согласно методике [6] при использовании в качестве растворителя дистиллированной воды в разведении 200 мг/мл и 400 мг/мл. Опыты проводили “двойным слепым” методом, с применением луночно-диффузионного метода [7]. Среду для культивирования в объеме 20–25 мл вносили в чашки Петри (d = 90 мм). После застывания МПА и посева биоматериала по центру чашки Петри с помощью насадок делали лунки (d = 10 мм) на 2/3 толщины слоя агара и засеивали соответствующие штаммы грибов и бактерий. Исследованные и стандартные вещества вносили в лунки в объеме 0.1 мл. После инкубирования грибов и бактерий в термостате при 29 ± 0.5°C в течение 24 ч рассчитывали активность исследованных веществ согласно методике [6]. Зоны подавления роста грибов и бактерий измеряли в миллиметрах. Минимальную ингибирующую концентрацию (МИК) определяли методом серийных разведений [8]. Повторность опыта трехкратная.

 

Таблица 1. Протеины грибов и бактерий, выбранные в качестве мишеней для докинга

Царство	Биологический вид	Мишень	PDBID
Грибы	Aspergillus fumigatus	Цитохром P450 (CYP51B)	4UYM
	Aspergillus nidulans	Хитиндеацетилаза (AnCDA)	2Y8U
	Aspergillus niger	Хитиндеацетилаза (AngCDA)	7BLY
	Aspergillus parasiticus	Тиоэстераза (TE)	3ILS
	Phytophthora cryptogea	Β-Криптогейн (CRY)	1BXM
	Phytophthora infestans	L-треонин-3-дегидрогеназа (L-ThrDH)	6JYG
Бактерии	Escherichia coli	Пенициллинсвязывающий белок 5 (PBP 5)	1Z6F
		Орнитинтранскарбамилаза (OTC)	1DUV
		Цитидинтрифосфат-синтаза (CTP)	1S1M
		β-Лактамаза (AmpC)	1XGJ

 

В теоретической части поиск потенциальных белков-мишеней, имеющих отношение к бактерии Escherichia coli, проведен с использованием базы данных фармакофорных моделей PharmMapper [9]. В результате в рассмотрение были взяты протеины 1DUV, 1S1M и 1XGJ (табл. 1). Энзимы 2Y8U, 7BLY, 3ILS, 1BXM и 6JYG выбраны на основе литературных данных [10–13].

Протеины 4UYM и 1Z6F включены в исследование, поскольку цитохромы и пенициллинсвязывающие белки являются установленными мишенями для пропиконазола и цефазолина соответственно [14– 16]. Для докинга использовали программный пакет AutoDock 4 [17]. Дополнительный анализ и визуализацию результатов докинга проводили с применением программного обеспечения Discovery Studio Visualizer v21.1.0.20298 [18]. Кристаллографические структуры комплексов CYP51B/вориконазол, AnCDA/фосфат- ион, AngCDA/малонат-ион, CRY/аргостерол, L-ThrDH/ NAD (никотинамидадениндинуклеотид), PBP5/BO9 (N1-[(1R)-1-(дигидроксиборил)этил]-N2- [(трет-бутоксикарбонил)-D-гамма-глутамил]-N6- [(бензилокси)карбонил-L-лизинамид), OTC/PSQ (Nдельта-(N'-сульфодиаминофосфинил)-L-орни- тин), AmpC/HTC (3-(4-карбокси-2-гидроксифенилсульфамоил)тиофен-2-карбоновая кислота) и протеинов TE, CTP были получены из банка данных белков (идентификаторы PDB: 4UYM, 2Y8U, 7BLY, 1BXM, 6JYG, 1Z6F, 1DUV, 1XGJ, 3ILS, 1S1M) [19] и оптимизированы посредством удаления молекул воды. Рецепторная сетка, как правило, располагалась вокруг активного сайта сокристализованных лигандов. В случае белков TE и CTP активный сайт определен на основе литературных данных [11, 20].

Результаты и их обсуждение

Первоначально экпериментальная оценка фунгицидной и бактерицидной активности 3-гексил-1H-фосфолан оксида 1б была проведена при концентрации вещества 400 мг/мл (табл. 2).

Наблюдали значительное (в 2–3 раза) увеличение диаметра ингибирования для всех видов исследованных грибов по сравнению с препаратом сравнения, кроме Septoria sp., чья фунгицидная активность оказалась близка с действием препарата “Агролекарь”, взятом в рекомендованной производителем концентрации пропиконазола. При уменьшении концентрации вещества до 200 мг/мл фунгицидная активность в отношении всех видов исследованных грибов сохранялась. Для грибов Aspergillus sp. и Phytophthora sp. зафиксировано двукратное уменьшение зоны ингибирования.

С целью определения минимальной ингибирующей концентрации (МИК) 3-гексил-1H-фосфолан оксида 1б были проведены эксперименты при концентрациях 100 мг/мл вещества и меньше, которые показали полное отсутствие ингибирования (табл. 3).

Установлено, что исследованное соединение также обладало бактерицидной активностью по отношению к бактериям Escherichia coli, сравнимое с известным высокоактивным препаратом “Цефазолин”, при этом МИК составляло 200 мг/мл (табл. 2, 3). Таким образом, установлено, что исследованное вещество 1б обладало как фунгицидной, так и бактерицидной активностью.

 

Таблица 2. Фунгицидная и бактерицидная активность различных препаратов на объекты исследования

Объект исследования	Диаметр ингибирования роста тест-культур, см
	“Агролекарь”	3-гексил-1Н-фосфолан оксид (200 мг/мл)	3-гексил-1Н-фосфолан оксид (400 мг/мл)	“Цефазолин”
Aspergillus sp.	1	1.3	3.5	–
Septoria sp.	4	3.2	3.2	–
Phytophthora sp.	1.3	2.5	4.0	–
Puccinia sp.	2.1	4	4.6	–
Escherichia coli	–	5	5.3	7.1

 

Таблица 3. Минимальная ингибирующая концентрация 3-гексил-1Н-фосфолан оксида 1б, мг/мл

Разведение	Концентрация, мг/мл	Septoria sp.	Phytophthora sp.	Puccinia sp.	Aspergillus sp.	Escherichia coli
1 : 10	400	–	–*	–*	–*	–
1 : 100	200	–*	+	+	+	–*
1 : 103	100	+	+	+	+	+
1 : 104	50	+	+	+	+	+
1 : 105	25	+	+	+	+	+
1 : 106	12.5	+	+	+	+	+

Примечание. Прочерк – нет роста, + – видимый рост.

* МИК для соответствующих тест-штаммов.

 

С целью более глубокого понимания механизма действия синтезированного фосфолан оксида было проведено теоретическое моделирование взаимодействия возможных стереоизомеров соединений 1а–в с известными для данных грибов и бактерии мишенями (табл. 1). Установлено, что для 3-бутил-1H-фосфолан оксида 1а преимущественно реализуется “твист” конформация с экваториальным расположением заместителя в 3-м положении, что согласуется с литературными данными для аналогичных алюминий содержащих систем [21]. Таким образом, для каждого из фосфолан оксидов 1a–в были соптимизированы структуры 4-х диастереомеров (рис. 3), из которых RR-λ и SS-σ диастереомеры оказались наиболее энергетически выгодными и были выбраны в качестве лигандов для проведения докинга (табл. 4). В случае пропиконазола докинг проводили с участием наиболее термодинамически выгодного SR-стереоизомера.

Для некоторых протеинов существуют экспериментальные данные с сокристализованными лигандами (табл. 5), которые представлены в табл. 6 для сопоставления с теоретическими результатами докинга с участием соединений 1а–в.

 

Рис. 3. Диастереомеры 3-алкил-1Н-фосфолан оксидов.

 

Таблица 4. Относительные величины термодинамических параметров ([S] = Дж/(моль K); [H] = [G] = = кДж/ моль) стереоизомеров пропиконазола, фосфолан оксидов 1a–в в стандартных условиях

Соединение	Диастереомер	ΔH	ΔG	ΔS
Пропиконазол	RR	6.78	4.56	36.48
	RS	5.69	14.35	0.00
	SR	0.00	0.00	29.04
	SS	5.27	7.11	22.84
1a	RR-λ	0.00	0.00	3.39
	RS-σ	0.59	1.38	0.63
	SR-λ	0.59	1.17	1.34
	SS-σ	0.04	0.13	3.01
1б	RR-λ	0.00	0.00	1.76
	RS-σ	0.46	0.63	1.13
	SR-λ	0.63	1.13	0.00
	SS-σ	0.00	0.08	1.51
1в	RR-λ	0.00	0.00	2.72
	RS-σ	0.71	1.55	0.00
	SR-λ	0.54	0.54	2.76
	SS-σ	0.00	0.13	2.34

 

Таблица 5. Конформация с наименьшей энергией для каждого сокристаллизованного лиганда

Протеин	Лиганд	RMSD	FBE, ккал/моль	FIE, ккал/моль	Ki
CYP51B	Вориконазол	1.366	−8.29	−10.08	832.06 нM
AnCDA	Фосфат-ион	0.937	−2.00	−2.00	34.27 мM
AngCDA	Малонат-ион	12.239	−3.17	−3.76	4.79 мM
CRY	Эргостерол	1.443	−11.92	−13.41	1.83 нM
L-ThrDH	NAD	1.503	−2.54	−4.33	13.73 мM
PBP 5	BO9	2.717	−4.98	−11.24	224.24 мкM
OTC	PSQ	1.039	−11.49	−14.47	3.81 нM
AmpC	HTC	6.279	−7.45	−9.24	3.48 мкM

Примечание. FBE – свободная энергия связывания, FIE – конечная межмолекулярная энергия, Ki – константа ингибирования. То же в табл. 6.

 

Как следует из табл. 6, фунгицидная активность пропиноказола и 3-октил-1H-фосфолан оксида 1в сопоставима для каждого из потенциальных белков мишеней, поскольку их расчетные константы ингибирования Ki одного порядка, например, константы ингибирования Ki пропиноказола, вориконазола и соединения 1в для белка мишени CYP51B (Aspergillus fumigatus) составляют 10^–9 (нМ) размерность. Более того, как показал сравнительный анализ величин констант связывания и констант ингибирования, оценочная ингибирующая активность 1в даже больше по сравнению с пропиконазолом (132.17 нМ < 101.18 нМ (Ki) и –9.38 < 9.54 (FBE)). Согласно полученным результатам, гомологи 1а и 1б с меньшим количеством звеньев в алкильной цепи должны проявлять меньшую активность, например, для 1а SS конфигурации Ki = 22.66 мкМ. Наблюдаемое увеличение активности c увеличением длины цепи в ряду гомологов свидетельствовало о значительной роли алкильного фрагмента 1H-фосфолан оксида в связывании с активными сайтами данного белка. Для подтверждения полученных результатов, а также с целью детализации взаимодействий, реализующихся в системе молекула–протеин, визуализировали некоторые результаты докинга (рис. 4).

Действительно, алкильный заместитель участвует в образовании гидрофобных взаимодействий, причем если для 1а наблюдали один такой контакт, то для 1б соединения – уже четыре, и в случае 1в проявлялись 5 взаимодействий (розовый цвет пунктира). Концевая метильная группа в составе алкильного фрагмента ряда соединений 1а–в участвует также в π-σ взаимодействиях (фиолетовый цвет пунктира). Данные 2 типа взаимодействий преобладают в комплексе “пропиноказол–белок CYP51B”. В этом модельном комплексе реализуется также одна водородная связь, в то время как в 1H-фосфолан оксидах образуются 2 (1а) и 3 (1б, 1в) водородные связи, в которые вовлекаются атомы кислорода и водорода P(O)H функциональной группы. Атом фосфора 1H-фосфолан оксидов обеспечивает взаимодействия, обусловленные либо притяжением между противоположно заряженными центрами (см. синий пунктир в 1а), либо отталкиванием положительно заряженных центров, например, имеет место неблагоприятное взаимное отталкивание зарядов, локализованных на атоме фосфора и протонированном атоме азота боковой цепи аминокислотного остатка His374 (красный цвет пунктирных линий во всех 3-х соединениях (рис. 4). Таким образом, в случае введения 1б в сайт связывания протеина CYP51B образуется относительно меньше гидрофобных, но больше водородных связей с гемом протеина по сравнению с пропиконазолом. Очевидно, это обусловлено присутствием оксидной функции при атоме фосфора, что и определяет значительные параметры связывания, и, как следствие, потенциальную фунгицидную активность тестированных соединений. Анализ расчетных данных, полученных с участием тиоэстеразы (TE) вида Aspergillus parasiticus (табл. 1), также показал высокую ингибирующую активность 3-октил-1H-фосфолан оксида 1в (Кi = 673.33 нМ) по сравнению с пропиконазолом (Кi = 398.20 нМ) и, тем более, относительно гомолога 3-гексил-1H-фосфолан оксида 1б (Кi = 8.05 мкМ). Кроме того, фосфолан оксиды показали бóльшую прочность связывания по отношению к данной мишени по сравнению с соединенями, которые тестировали в работе [11]. Тенденция уменьшения величин Кi с уменьшением длины цепи, а также близкие параметры связывания между модельным и исследованными веществами сохранялись также для комплексов с белками AnCDA и AngCDA.

 

Таблица 6. Конформация с наименьшей энергией для пропиконазола, цефазолина, фосфолан оксидов 1a–в

Протеин	Лиганд	FBE, ккал/моль	FIE, ккал/моль	Ki
CYP51B	Пропиконазол SR	−9.38	−10.88	132.17 нМ
	1a RR-λ	−6.76	−7.65	11.15 мкМ
	1a SS-σ	−6.34	−7.23	22.66 мкМ
	1б RR-λ	−7.96	−8.86	1.46 мкМ
	1б SS-σ	−7.84	−8.74	1.78 мкМ
	1в RR-λ	−9.31	−10.20	150.62 нМ
	1в SS-σ	−9.54	−10.44	101.18 нМ
AnCDA	Пропиконазол	−7.01	−8.50	7.25 мкМ
	1a RR-λ	−5.47	−6.36	98.06 мкМ
	1a SS-σ	−5.39	−6.29	111.35 мкМ
	1б RR-λ	−6.20	−7.10	28.33 мкМ
	1б SS-σ	−6.09	−6.99	34.09 мкМ
	1в RR-λ	−7.03	−7.92	7.09 мкМ
	1в SS-σ	−6.88	−7.77	9.07 мкМ
AngCDA	Пропиконазол	−7.00	−8.49	7.44 мкМ
	1a RR-λ	−6.16	−7.05	30.61 мкМ
	1a SS-σ	−5.81	−6.70	55.29 мкМ
	1б RR-λ	−6.92	−7.81	8.52 мкМ
	1б SS-σ	−6.83	−7.73	9.84 мкМ
	1в RR-λ	−7.43	−8.32	3.60 мкМ
	1в SS-σ	−7.28	−8.17	4.63 мкМ
TE	Пропиконазол	−8.73	−10.22	398.20 нМ
	1a RR-λ	−5.82	−6.72	54.08 мкМ
	1a SS-σ	−6.00	−6.89	40.24 мкМ
	1б RR-λ	−6.95	−7.84	8.05 мкМ
	1б SS-σ	−7.20	−8.10	5.25 мкМ
	1в RR-λ	−8.42	−9.31	678.33 нМ
	1в SS-σ	−8.43	−9.33	657.16 нМ
CRY	Пропиконазол	−7.03	−8.52	7.03 мкМ
	1a RR-λ	−5.03	−5.92	206.83 мкМ
	1a SS-σ	−5.11	−6.00	180.63 мкМ
	1б RR-λ	−6.20	−7.09	28.64 мкМ
	1б SS-σ	−6.13	−7.02	32.29 мкМ
	1в RR-λ	−7.08	−7.98	6.41 мкМ
	1в SS-σ	−7.02	−7.91	7.18 мкМ
L-ThrDH	Пропиконазол	−8.30	−9.79	828.38 нМ
	1a RR-λ	−6.13	−7.03	31.90 мкМ
	1a SS-σ	−5.94	−6.83	44.28 мкМ
	1б RR-λ	−7.15	−8.04	5.74 мкМ
	1б SS-σ	−7.19	−8.09	5.35 мкМ
	1в RR-λ	−8.40	−9.29	700.62 нМ
	1в SS-σ	−8.19	−9.09	984.87 нМ
PBP 5	Цефазолин	−11.68	−14.06	2.76 нМ
	1a RR-λ	−5.37	−6.26	115.92 мкМ
	1a SS-σ	−5.81	−6.71	54.84 мкМ
	1б RR-λ	−6.44	−7.34	18.96 мкМ

Таблица 6. Окончание

Протеин	Лиганд	FBE, ккал/моль	FIE, ккал/моль	Ki
PBP 5	1б SS-σ	−6.92	−7.81	8.51 мкМ
	1в RR-λ	−7.57	−8.47	2.81 мкМ
	1в SS-σ	−8.06	−8.96	1.23 мкМ
OTC	Цефазолин	−11.13	−13.52	6.89 нМ
	1a RR-λ	−5.85	−6.75	51.11 мкМ
	1a SS-σ	−5.93	−6.83	44.99 мкМ
	1б RR-λ	−7.16	−8.06	5.61 мкМ
	1б SS-σ	−7.11	−8.01	6.11 мкМ
	1в RR-λ	−8.09	−8.99	1.17 мкМ
	1в SS-σ	−8.14	−9.04	1.07 мкМ
CTP	Цефазолин	−9.66	−12.04	83.66 нМ
	1a RR-λ	−5.05	−5.95	197.60 мкМ
	1a SS-σ	−5.62	−6.52	75.66 мкМ
	1б RR-λ	−6.11	−7.01	33.14 мкМ
	1б SS-σ	−6.64	−7.54	13.47 мкМ
	1в RR-λ	−6.43	−7.32	19.46 мкМ
	1в SS-σ	−6.50	−7.40	17.08 мкМ
AmpC	Цефазолин	−11.94	−14.33	1.77 нМ
	1a RR-λ	−4.80	−5.70	301.97 мкМ
	1a SS-σ	−4.96	−5.85	232.17 мкМ
	1б RR-λ	−5.48	−6.38	95.80 мкМ
	1б SS-σ	−5.77	−6.66	59.45 мкМ
	1в RR-λ	−6.45	−7.34	18.78 мкМ
	1в SS-σ	−6.71	−7.61	12.00 мкМ

 

Теоретические расчеты показали заметное влияние стереохимии на параметры Ki, FBE, например, ∆Ki(SS-RR) = 49.44 нM для 1в (рис. 4), что свидетельствовало об относительно большей активности стереоизомера с RR конфигурацией хиральных центров.

 

Рис. 4. Взаимодействие SR-пропиконазола и фосфолан оксидов RR-λ 1a, RR-λ 1б и RR-λ 1в c активным сайтом протеина CYP51B. Гидрофобные взаимодействия окрашены в светло-розовый цвет, водородные связи окрашены в зеленый цвет, π-σ взаимодействия окрашены в фиолетовый цвет, Ван-дер-Ваальсовы взаимодействия окрашены в мятно-зеленый цвет, неблагоприятные взаимодействия положительно заряженных центров окрашены в красный цвет, π-π взаимодействия окрашены в розовый цвет. Синим цветом отражено притяжение между противоположно заряженными центрами.

 

Рис. 5. Взаимодействие RS-пропиконазола и фосфолан оксидов RR-λ 1a, SS-σ 1a, RR-λ 1б, SS-σ 1б, RR-λ 1в и SS-σ 1в c активным сайтом протеина L-ThrDH. Гидрофобные взаимодействия окрашены в светло-розовый цвет, конвенциональные водородные связи окрашены в зеленый цвет, π-σ взаимодействия окрашены в фиолетовый цвет, Ван-дер-Ваальсовы взаимодействия окрашены в мятно-зеленый цвет, π-анион взаимодействия окрашены в оранжевый цвет, π-π взаимодействия окрашены в розовый цвет, π-донорная водородная связь окрашена в красный цвет, водородные связи с участием атома водорода, ковалентно связанного с атомом углерода, окрашены в синий цвет.

 

Рис. 6. Взаимодействие SR-пропиконазола, фосфолан оксидов RR-λ 1a, RR-λ 1б, SS-σ 1б и RR-λ 1в c активным сайтом протеина PBP 5. Гидрофобные взаимодействия окрашены в светло-розовый цвет, водородные связи окрашены в зеленый цвет, Ван-дер-Ваальсовы взаимодействия окрашены в мятно-зеленый цвет, благоприятные взаимодействия противоположно заряженных центров окрашены в оранжевый цвет, неблагоприятные взаимодействия положительно заряженных центров окрашены в красный цвет, неблагоприятные взаимодействия акцепторных центров окрашены в желтый цвет.

 

Интересные результаты получены в результате докинга с участием белков, относящихся к семейству Phytophthora (CRY, L-ThrDH), именно фосфолан оксид 1в должен проявлять фунгицидную активность по отношению к фитофторе, сравнимую с модельным фунгицидом. Белок L-ThrDH, например, должен активно связываться со всеми 1а–в гомологами циклических ФОС, т. к. Ki (1а–в, табл. 6) < Ki (комплекса с NAD, табл. 5), однако в случае 1в соединения константа ингибирования отличалась на порядки (табл. 6). Визуализация полученных данных объясняет результаты расчетов (рис. 5).

На рис. 5 однозначно прослежена тенденция к увеличению количества связей (гидрофобных и водородных) при переходе от 3-бутил-1H-фосфолан оксида 1а к 3-октил-1H-фосфолан оксиду 1в. Обращает на себя внимание также тот факт, что характер взаимодействий значительно отличается для стереомеров с SS- и RR-конфигурациями хиральных центров не только за счет стереохимии циклического каркаса, но и за счет изменения конформации алкильного заместителя, например, “скрученная” конформация в стереоизомерах 1в дает преимущества в связывании с активными сайтами протеина. Из рис. 5 следует, что атомы кислорода, водорода и фосфора в составе функциональной группы в серии 3-алкил-1H-фосфолан оксидов образуют разнообразные связи (конвенциональные водородные связи, Ван-дер-Ваальсовы взаимодействия, π-анионые взаимодействия, водородные связи с участием атома водорода, ковалентно связанного с атомом углерода) с аминокислотными остатками белка. Очевидно, что активное участие фосфорсодержащей группы в связывании должно определять высокую фунгицидную активность. Действительно, количественные параметры связывания в системе соединения 1а–в – CRY, в которой группа P(O)H практически инертна (рисунок не приведен), значительно уступают комплексу, описанному выше (рис. 5).

Оценку теоретической бактерицидной активности проводили по результатам докинга (табл. 5, 6) 1H-фосфолан оксидов 1а–в в активные сайты протеинов PBP 5, OTC и AmpC. На рис. 6 представлены некоторые результаты.

Показано, что с участием оксидной группы при гетероатоме реализуются 4 водородные связи, что по количеству сопоставимо с цефазолиновым комплексом, в котором 4 связи формируются за счет структурного разнообразия молекулы – 2-х карбонильных групп и 2-х атомов азота триазинового кольца. Атом фосфора, как следует из рис. 6, за счет положительного заряда вовлекается во взаимодействие с другими заряженными центрами в полости белка. Следует отметить, что множественные гидрофобные связи присутствуют только для 1в соединения, что ожидаемо по сравнению с предыдущими выводами. При сравнении прочности связывания с активным сайтом белка PBP 5 фосфолан оксиды уступили цефазолину, но превзошли ингибитор BO9. Таким образом, можно прогнозировать бактерицидную активность 3-алкилзамещенных 1H-фосфолан оксидов, что согласуется с экспериментальными данными.

Выводы

1. Выявлена фунгицидная активность 3-гексил-1Н-фосфолан оксида в отношении грибов рода Septoria sp., Phytophthora sp., Puccinia sp. и Aspergillus sp. Установлено, что минимальная ингибирующая концентрация для Phytophthora sp., Puccinia sp. и Aspergillus sp. составляет 400 мг/мл, для Septoria sp. – 200 мг/мл.
2. Установлено, что 3-гексил-1Н-фосфолан оксид проявляет антибактериальную активность в отношении бактерии Escherichia coli с минимальной ингибирующей концентрацией 200 мг/мл.
3. Проведен молекулярный докинг RR- и SS-3-R-1Н-фосфолан оксидов (R = бутил, гексил, октил) на мишенях CYP51B (цитохром P450), AnCDA (хитиндеацетилаза), TE (тиоэстераза), CRY (Β-криптогейн), L-ThrDH (L-треонин-3-дегидрогеназа), PBP 5 (пенициллинсвязывающий белок), OTC (орнитинтранскарбамилаза), CTP (цитидинтрифосфат-синтаза), AmpC (β-лактамаза) с учетом наиболее энергетически выгодной конформации. В результате молекулярного докинга с участием протеинов показано, что функциональная группа P(O)H 3-алкил-1Н-фосфолан оксидов взаимодействует (кроме CRY) с активными сайтами исследованных белков.
4. Анализ параметров связывания и карта взаимодействий вещество–протеин показали значительное влияние стереохимии 3-алкил-1Н-фосфолан оксидов на фунгицидную активность. Для каждого соединения из ряда изученных фосфолан оксидов предложен наиболее биологически активный стереоизомер.
5. Установлено, что алкильный заместитель в 1Н-фосфолан оксидах играет значительную роль в связывании с рецепторами белков за счет гидрофобных взаимодействий, поэтому в качестве потенциального соединения, фунгицидная активность которого может быть сопоставима с пропиконазолом, предложен 3-октил-1Н-фосфолан оксид.

作者简介

T. Tyumkina

Institute of Petrochemistry and Catalysis, Ufa Federal Research Center of the Russian Academy of Sciences

编辑信件的主要联系方式.
Email: ttvnmr@gmail.com
俄罗斯联邦, prosp. Oktyabrya 141, Ufa 450075

K. Bulatova

Ufa State Petroleum Technical University

Email: ttvnmr@gmail.com
俄罗斯联邦, ul. Kosmonavtov 1, Ufa 450062

D. Islamov

Institute of Petrochemistry and Catalysis, Ufa Federal Research Center of the Russian Academy of Sciences

Email: ttvnmr@gmail.com
俄罗斯联邦, prosp. Oktyabrya 141, Ufa 450075

A. Makhamatkhanova

Institute of Petrochemistry and Catalysis, Ufa Federal Research Center of the Russian Academy of Sciences

Email: ttvnmr@gmail.com
俄罗斯联邦, prosp. Oktyabrya 141, Ufa 450075

M. Mallyabaeva

Ufa State Petroleum Technical University

Email: ttvnmr@gmail.com
俄罗斯联邦, ul. Kosmonavtov 1, Ufa 450062

D. Sabirov

Institute of Petrochemistry and Catalysis, Ufa Federal Research Center of the Russian Academy of Sciences

Email: ttvnmr@gmail.com
俄罗斯联邦, prosp. Oktyabrya 141, Ufa 450075

参考

补充文件