Разработка методов анализа однонуклеотидных полиморфизмов Plasmodium falciparum в генах PfCRT (А > C), PfMDR1 (A > T) и PfDHFR (G > A), определяющих резистентность к хинолиновой, диамино-пиримидиновой и сульфаниламидной группам противомалярийных препаратов

Обложка

Цитировать

Полный текст

Аннотация

Актуальность. Единичные нуклеотидные полиморфизмы K76T (A403627C), S1034C (A960989T) и S108N (G748410A) ассоциированы с лекарственной резистентностью возбудителей тропической малярии к мефлохину, хлорохину, пириметамину и их производным. Эти мутации связаны с изменением структуры генов PfCRT и PfMDR1 Plasmodium falciparum.

Цель исследования. Разработка способов идентификации единичных нуклеотидных полиморфизмов, пригодных для ранней диагностики лекарственно устойчивых форм тропической малярии.

Результаты. Для выявления полиморфизма K76T (A403627C) разработан метод на основе анализа длин рестрикционых фрагментов с использованием эндонуклеазы ApoI. При этом критерием устойчивости паразитов к хлорохину служило появление на электорфореграмме одного бэнда 145 bp. Его разделение на два фрагмента (98 и 47 bp) свидетельствовало о неизмененном генотипе возбудителей и сохранении их лекарственной чувствительности. При разработке системы для обнаружения S108N (G748410A) использовалась эндонуклеаза Bse1I. В этом случае признаком мутантного генотипа возбудителей служило появление на электофореграмме единичного бэнда 507 bp. О неизмененном генотипе и сохранении лекарственной чувствительности плазмодиев свидетельствовало появление двух фрагментов (323 и 184 bp). Для идентификации полиморфизма A > T в гене PfMDR1 в позиции 960989 предложено использовать технологию полимеразной цепной реакции с двумя аллель-специфичными праймерами, один из которых служит для выявления аллеля дикого типа, другой — для мутантного генотипа. Амплифицируемый фрагмент гена PfMDR1 содержит последовательности 1034-го кодона. В зависимости от генотипа Plasmodium falciparum. будут получены фрагменты 261 bp c одним из аллель-специфичных праймеров.

Заключение. Исходя из анализа полученных данных, были разработаны критерии для оценки лекарственной устойчивости P. falciparum. Гаплотипы K76T (бэнд 145 bp), S1034C (бэнд 262 bp с прямым праймером S1034C-F2) служат признаками относительной устойчивости возбудителей к хлорохину, мефлохину и их производным. Положительные результаты обследования на гаплотип S108N (бэнды 323 и 184 bp) следует рассматривать как признак снижения чувствительности к пириметамину. Разработанные методики могут применяться в клинической практике, а также в целях эпидемиолгического мониторинга.

Об авторах

Артем Русланович Арюков

Военно-медицинская академия

Автор, ответственный за переписку.
Email: arukov.artem@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0001-8774-5467

аспирант

Россия, Санкт-Петербург

Алексей Иванович Соловьев

Военно-медицинская академия

Email: solopiter@gmail.com
ORCID iD: 0000-0002-3731-1756

докт. мед. наук, профессор

Россия, Санкт-Петербург

Владимир Александрович Капацина

Клиническая инфекционная больница им. С.П. Боткина

Email: ingashi@mail.ru
ORCID iD: 0000-0002-8959-0873

заведующий отделением

Россия, Санкт-Петербург

Анна Алексеевна Крутикова

Военно-медицинская академия

Email: anntim2575@mail.ru
ORCID iD: 0000-0003-2561-145X

канд. биол. наук

Россия, Санкт-Петербург

Владимир Александрович Романенко

Военно-медицинская академия

Email: izvestiavmeda@mail.ru
Россия, Санкт-Петербург

Александр Николаевич Коваленко

Военно-медицинская академия

Email: ank561@mail.ru
ORCID iD: 0000-0002-2976-8051

докт. мед. наук, доцент

Россия, Санкт-Петербург

Аким Алексеевич Колесник

Военно-медицинская академия

Email: izvestiavmeda@mail.ru
ORCID iD: 0009-0001-5809-9694
Россия, Санкт-Петербург

Артём Сергеевич Зинин

Военно-медицинская академия

Email: izvestiavmeda@mail.ru
ORCID iD: 0009-0000-4308-7554
Россия, Санкт-Петербург

Список литературы

  1. Mulenga M.C., Sitali L., Ciubotariu I.I., et al. Decreased prevalence of the Plasmodium falciparum PfCRT K76T and Pfmdr1 and N86Y mutations post-chloroquine treatment withdrawal in Katete District, Eastern Zambia // Malar. J. 2021. Vol. 20, N. 1. P. 329. doi: 10.1186/s12936-021-03859-z
  2. Hassen J., Alemayehu G.S., Dinka H., Golassa L. High prevalence of PfCRT 76T and Pfmdr1 N86 genotypes in malaria infected patients attending health facilities in East Shewa zone, Oromia Regional State, Ethiopia // Malar. J. 2022. Vol. 21, N. 1. P. 286. doi: 10.1186/s12936-022-04304-5
  3. Njiro B.J., Mutagonda R.F., Chamani A.T., et al. Molecular surveillance of chloroquine-resistant Plasmodium falciparum in sub-Saharan African countries after withdrawal of chloroquine for treatment of uncomplicated malaria: A systematic review // J. Infect. Public Health. 2022. Vol. 15, N. 5. P. 550–557. doi: 10.1016/j.jiph.2022.03.015
  4. Yobi D.M., Kayiba N.K., Mvumbi D.M., et al. Assessment of Plasmodium falciparum anti-malarial drug resistance markers in pfk13-propeller, PfCRT and Pfmdr1 genes in isolates from treatment failure patients in Democratic Republic of Congo, 2018–2019 // Malar. J. 2021. Vol. 20, N. 1. P. 144. doi: 10.1186/s12936-021-03636-y
  5. Shrivastava S.K., Gupta R.K., Mahanta J., Dubey M.L. Correlation of molecular markers, Pfmdr1-N86Y and PfCRT-K76T, with in vitro chloroquine resistant Plasmodium falciparum, isolated in the malaria endemic states of Assam and Arunachal Pradesh, Northeast India // PLoS One. 2014. Vol. 9, N. 8. P. e103848. doi: 10.1371/journal.pone.0103848
  6. Wang X., Zhang X., Chen H., et al. Molecular determinants of sulfadoxine-pyrimethamine resistance in Plasmodium falciparum isolates from Central Africa between 2016 and 2021: wide geographic spread of highly mutated Pfdhfr and Pfdhps alleles // Microbiol. Spectr. 2022. Vol. 10, N. 5. P. e0200522. doi: 10.1128/spectrum.02005-22
  7. Amir A., Cheong F.W., De Silva J.R., Lau Y.L. Diagnostic tools in childhood malaria // Parasit. Vectors. 2018. Vol. 11, N. 1. P. 53. doi: 10.1186/s13071-018-2617-y
  8. Jiang T., Huang Y., Cheng W., et al. Multiple single-nucleotide polymorphism detection for antimalarial pyrimethamine resistance via allele-specific PCR coupled with gold nanoparticle-based lateral flow biosensor // Antimicrob. Agents Chemother. 2021. Vol. 65, N. 3. P. e01063–20. doi: 10.1128/aac.01063-20
  9. Sharma D., Lather M., Dykes C.L., et al. Disagreement in genotyping results of drug resistance alleles of the Plasmodium falciparum dihydrofolate reductase (Pfdhfr) gene by allele-specific PCR (ASPCR) assays and Sanger sequencing // Parasitol. Res. 2016. Vol. 115, N. 1. P. 323–328. doi: 10.1007/s00436-015-4750-2
  10. Jiang T., Cheng W., Yao Y., et al. Molecular surveillance of anti-malarial resistance Pfdhfr and Pfdhps polymorphisms in African and Southeast Asia Plasmodium falciparum imported parasites to Wuhan, China // Malar. J. 2020. Vol. 19, N. 1. P. 434. doi: 10.1186/s12936-020-03509-w
  11. Dalimi A., Mosawi S.H., Fotouhi-Ardakani R., Dalirghafari A. Evaluation of Drug Resistant Genotypes to Fansidar and Chloroquine by Studying Mutation in Pfdhfr and Pfmdr1 Genes in Plasmodium falciparum Isolates from Laghman Province, Afghanistan // Iran J. Parasitol. 2022. Vol. 17, N. 1. P. 18–27. doi: 10.18502/ijpa.v17i1.9012
  12. Cheng W., Song X., Zhu H., et al. A rapid and specific genotyping platform for Plasmodium falciparum chloroquine resistance via allele-specific PCR with a lateral flow assay // Microbiol. Spectr. 2022. Vol. 10, N. 2. P. e0271921. doi: 10.1128/spectrum.02719-21
  13. Sambrook J., Russell D.W. Purification of nucleic acids by extraction with phenol: chloroform // Cold Spring Harbor Protocols. 2006. Vol. 2006, N. 1. P. pdb. prot4455. doi: 10.1101/pdb.prot4455
  14. Lakshmanan V., Bray P.G., Verdier-Pinard D., et al. A critical role for PfCRT K76T in Plasmodium falciparum verapamil-reversible chloroquine resistance // EMBO J. 2005. Vol. 24, N. 13. P. 2294–2305. doi: 10.1038/sj.emboj.7600681
  15. Anderson T.J., Nair S., Qin H., et al. Are transporter genes other than the chloroquine resistance locus (PfCRT) and multidrug resistance gene (pfmdr) associated with antimalarial drug resistance? // Antimicrob. Agents Chemother. 2005. Vol. 49, N. 6. P. 2180–2188. doi: 10.1128/aac.49.6.2180-2188.2005
  16. Wernsdorfer W.H., Noedl H. Molecular markers for drug resistance in malaria: use in treatment, diagnosis and epidemiology // Curr. Opin. Infect. Dis. 2003. Vol. 16, N. 6. P. 553–558. doi: 10.1097/01.qco.0000104295.87920.fd

Дополнительные файлы

Доп. файлы
Действие
1. JATS XML
Скачать
2. Рис. 1. Места разреза ApoI и MluCI ампликона 145 bp (https://nc3.neb.com/NEBcutter/prj/PFCRT_K76T)

Скачать (19KB)
Метаданные
3. Рис. 2. Амплифицированный фрагмент гена. Сайт рестрикции эндонуклеазы ApoI находится в позиции 76-го кодона гена PfCRT. Места разреза фрагмента ДНК, обусловленные этим сайтом рестрикции, обозначены стрелками. Кодон 76-го фрагмента гена PfCRT выделен подчеркиванием

Скачать (47KB)
Метаданные
4. Рис. 3. Участок гена PfCRT, содержащий 76-й кодон и сайт рестрикции AcsI (ApoI). Точка 1 — 76-й триплет гена PfCRT, кодирую- щий лизин (дикий аллель) или треонин (мутантный аллель) в структуре транспортного белка внутренней мембраны P. falciparum. Точка 2 — место действия эндонуклеазы AcsI (ApoI) в гене PfCRT. Точка 3 — второй нуклеотид 76-го кодона (в данном случае аденин). Точка 4 — сайт рестрикции эндонуклеазы AcsI (ApoI)

Скачать (22KB)
Метаданные
5. Рис. 4. Электрофореграмма результатов PCR по выявлению мутации (A > C) в гене PfCRT (эндонуклеаза ApoI) (1 — маркер длин фрагментов; 2–5 — отрицательный контроль; 6–8 — дикий генотип плазмодия (A); 9 — дикий и мутантный генотипы (A > C)

Скачать (53KB)
Метаданные
6. Рис. 5. Амплифицируемый фрагмент гена PfMDR1. Праймеры, точковая мутация и 1034-й кодон выделены курсивом, жирным шрифтом и подчеркиванием соответственно

Скачать (131KB)
Метаданные
7. Рис. 6. Электрофореграммы продуктов 1-го этапа аллель-специфичной ПЦР (1, 20 — маркер длин фрагментов; 2–5 — отрица- тельный контроль; 5–7 и 9 — дикий генотип плазмодия (A); 13, 15, 17–19 — мутантный генотип (T)

Скачать (41KB)
Метаданные
8. Рис. 7. Результаты PCR-RFLP для выявления S108N в гене PfDHFR с использованием фермента Bse1I (21, 40 — маркер длин фрагментов; 22–24 — отрицательный контроль; 25, 27, 31, 33, 37 — дикий генотип плазмодия (G); 26, 32 — мутантный генотип (A))

Скачать (142KB)
Метаданные
9. Рис. 8. PCR-RFLP расщепления фрагмента 76 с помощью ApoI

Скачать (20KB)
Метаданные
10. Рис. 9. Схемы электрофореза продуктов ПЦР с аллель-специфичными праймерами

Скачать (45KB)
Метаданные
11. Рис. 10. Cтруктура PCR–RFLP и расщепление амплифицированного фрагмента с помощью Bse1I. 108S — кодон AGC (серин) не со- ответствует сайту рестрикции, сохраняется одиночный фрагмент 507 bp неизмененный генотип, признак отсутствия резистентности P. falciparum; 108N — кодон AAC (аспаргин), произошла рестрикция, появились фрагменты 323 и 184 bp, признак резистентности P. falciparum; 108S/G — серин/аспаргин (бенды 507, 323 и 184 bp, персистирование обычных штаммов P. falciparum, а также лекарственно устойчивых)

Скачать (33KB)
Метаданные

© Эко-Вектор, 2024

Creative Commons License
Эта статья доступна по лицензии Creative Commons Attribution-NonCommercial-NoDerivatives 4.0 International License.

Согласие на обработку персональных данных с помощью сервиса «Яндекс.Метрика»

1. Я (далее – «Пользователь» или «Субъект персональных данных»), осуществляя использование сайта https://journals.rcsi.science/ (далее – «Сайт»), подтверждая свою полную дееспособность даю согласие на обработку персональных данных с использованием средств автоматизации Оператору - федеральному государственному бюджетному учреждению «Российский центр научной информации» (РЦНИ), далее – «Оператор», расположенному по адресу: 119991, г. Москва, Ленинский просп., д.32А, со следующими условиями.

2. Категории обрабатываемых данных: файлы «cookies» (куки-файлы). Файлы «cookie» – это небольшой текстовый файл, который веб-сервер может хранить в браузере Пользователя. Данные файлы веб-сервер загружает на устройство Пользователя при посещении им Сайта. При каждом следующем посещении Пользователем Сайта «cookie» файлы отправляются на Сайт Оператора. Данные файлы позволяют Сайту распознавать устройство Пользователя. Содержимое такого файла может как относиться, так и не относиться к персональным данным, в зависимости от того, содержит ли такой файл персональные данные или содержит обезличенные технические данные.

3. Цель обработки персональных данных: анализ пользовательской активности с помощью сервиса «Яндекс.Метрика».

4. Категории субъектов персональных данных: все Пользователи Сайта, которые дали согласие на обработку файлов «cookie».

5. Способы обработки: сбор, запись, систематизация, накопление, хранение, уточнение (обновление, изменение), извлечение, использование, передача (доступ, предоставление), блокирование, удаление, уничтожение персональных данных.

6. Срок обработки и хранения: до получения от Субъекта персональных данных требования о прекращении обработки/отзыва согласия.

7. Способ отзыва: заявление об отзыве в письменном виде путём его направления на адрес электронной почты Оператора: info@rcsi.science или путем письменного обращения по юридическому адресу: 119991, г. Москва, Ленинский просп., д.32А

8. Субъект персональных данных вправе запретить своему оборудованию прием этих данных или ограничить прием этих данных. При отказе от получения таких данных или при ограничении приема данных некоторые функции Сайта могут работать некорректно. Субъект персональных данных обязуется сам настроить свое оборудование таким способом, чтобы оно обеспечивало адекватный его желаниям режим работы и уровень защиты данных файлов «cookie», Оператор не предоставляет технологических и правовых консультаций на темы подобного характера.

9. Порядок уничтожения персональных данных при достижении цели их обработки или при наступлении иных законных оснований определяется Оператором в соответствии с законодательством Российской Федерации.

10. Я согласен/согласна квалифицировать в качестве своей простой электронной подписи под настоящим Согласием и под Политикой обработки персональных данных выполнение мною следующего действия на сайте: https://journals.rcsi.science/ нажатие мною на интерфейсе с текстом: «Сайт использует сервис «Яндекс.Метрика» (который использует файлы «cookie») на элемент с текстом «Принять и продолжить».