Определение ГАМК-эргических нейронов и синаптических терминалей в головном мозге крысы с использованием иммуногистохимической реакции к двум изоформам глутаматдекарбоксилазы

Обложка

Цитировать

Полный текст

Открытый доступ Открытый доступ
Доступ закрыт Доступ предоставлен
Доступ закрыт Только для подписчиков

Аннотация

Обоснование. Принимая во внимание высокую актуальность изучения ГАМК-эргической системы головного мозга, а также информативность иммуногистохимических подходов в лабораторных исследованиях, представляется важным иметь в распоряжении метод, позволяющий выявлять клетки, синтезирующие ГАМК, их проекции и синапсы, для проведения морфофункционального анализа ГАМК-эргической системы как в норме, так и при моделировании экспериментальной патологии.

Цель — выявление ГАМК-эргических нейронов и синаптических терминалей в головном мозге крысы с использованием трех различных антител к глутаматдекарбоксилазе, а также определение оптимальных условий для постановки иммуногистохимической реакции.

Материалы и методы. Исследование выполняли на парафиновых срезах головного мозга пяти половозрелых крыс породы Вистар. Проводили иммуногистохимическую реакцию с помощью трех видов антител против глутаматдекарбоксилазы изоформ 67 (GAD67) и 65 (GAD65). Были также осуществлены дополнительные контрольные реакции на препаратах головного мозга мыши линии C57/Bl6 и кролика породы Шиншилла.

Результаты. Антитела позволили добиться высокого качества окраски ГАМК-эргических структур при малом уровне фона. Вместе с этим разные типы антител отличаются по эффективности при постановке иммуногистохимической реакции на срезах головного мозга лабораторных животных. При проведении дополнительных контрольных реакций выявлена необходимость адсорбции иммуноглобулинов вторичных реагентов с целью устранения неспецифической реакции при работе с головным мозгом крысы. Наблюдались различия в распределении GAD65 и GAD67 в структурах конечного мозга крысы. Отмечено, что по сравнению с иммуногистохимической реакцией на GAD65 окраска на GAD67 позволяет наиболее полно выявить ГАМК-эргические структуры. Продемонстрирована возможность определения морфологических характеристик ГАМК-эргических нейронов и синаптических терминалей, а также выполнения количественного анализа.

Выводы. Предложенный методический подход позволяет иммуноселективно выявлять ГАМК-эргические структуры центральной нервной системы различных лабораторных животных, что может оказаться полезным как для проведения фундаментальных исследований, так и для изучения заболеваний.

Об авторах

Валерия Алексеевна Разенкова

Институт экспериментальной медицины

Автор, ответственный за переписку.
Email: valeriya.raz@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0002-3997-2232
SPIN-код: 8877-8902
Scopus Author ID: 57219609984
ResearcherId: AAH-1333-2021

аспирант, младший научный сотрудник лаборатории функциональной морфологии центральной и периферической нервной системы Отдела общей и частной морфологии

Россия, Санкт-Петербург

Дмитрий Эдуардович Коржевский

Институт экспериментальной медицины

Email: DEK2@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0002-2456-8165
SPIN-код: 3252-3029
Scopus Author ID: 12770589000

д-р мед. наук, профессор РАН, заведующий лабораторией функциональной морфологии центральной и периферической нервной системы Отдела общей и частной морфологии

Россия, Санкт-Петербург

Список литературы

  1. Gerfen C.R., Economo M.N., Chandrashekar J. Long distance projections of cortical pyramidal neurons // J. Neurosci. Res. 2018. Vol. 96, No. 9. P. 1467–1475. doi: 10.1002/jnr.23978
  2. Xu Q., Cobos I., De La Cruz E. et al. Origins of cortical interneuron subtypes // J. Neurosci. 2004. Vol. 24, No. 11. P. 2612–2622. doi: 10.1523/JNEUROSCI.5667-03.2004
  3. Kubota Y. Untangling GABAergic wiring in the cortical microcircuit // Curr. Opin. Neurobiol. 2014. No. 26. P. 7–14. doi: 10.1016/j.conb.2013.10.003
  4. Kimoto S., Bazmi H.H., Lewis D.A. Lower expression of glutamic acid decarboxylase 67 in the prefrontal cortex in schizophrenia: contribution of altered regulation by Zif268 // Am. J. Psychiatry. 2014. Vol. 171, No. 9. P. 969–978. doi: 10.1176/appi.ajp.2014.14010004
  5. LeWitt P.A., Rezai A.R., Leehey M.A. et al. AAV2-GAD gene therapy for advanced Parkinson’s disease: a double-blind, sham-surgery controlled, randomised trial // Lancet Neurol. 2011. Vol. 10, No. 4. P. 309–319. doi: 10.1016/S1474-4422(11)70039-4
  6. McQuail J.A., Frazier C.J., Bizon J.L. Molecular aspects of age-related cognitive decline: the role of GABA signaling // Trends Mol. Med. 2015. Vol. 21, No. 7. P. 450–460. doi: 10.1016/j.molmed.2015.05.002
  7. Seney M.L., Tripp A., McCune S. et al. Laminar and cellular analyses of reduced somatostatin gene expression in the subgenual anterior cingulate cortex in major depression // Neurobiol. Dis. 2015. No. 73. P. 213–219. doi: 10.1016/j.nbd.2014.10.005
  8. Duman R.S., Sanacora G., Krystal J.H. Altered connectivity in depression: GABA and glutamate neurotransmitter deficits and reversal by novel treatments // Neuron. 2019. Vol. 102, No. 1. P. 75–90. doi: 10.1016/j.neuron.2019.03.013
  9. Силькис И.Г. Роль ацетилхолина и ГАМК-торможения в генерации судорожной активности в нейронных сетях, объединяющих новую кору, гиппокамп, базальные ганглии и таламус // Нейрохимия. 2020. Т. 37, № 2. С. 106–124. doi: 10.31857/S1027813320020120
  10. Теоретические основы и практическое применение методов иммуногистохимии / под ред. Д.Э. Коржевского. 2-е изд. Санкт-Петербург, 2014.
  11. Martin D.L., Liu H., Martin S.B., Wu S.J. Structural features and regulatory properties of the brain glutamate decarboxylases // Neurochem. Int. 2000. Vol. 37, No. 2–3. P. 111–119. doi: 10.1016/s0197-0186(00)00014-0
  12. Petroff O.A. GABA and glutamate in the human brain // Neuroscientist. 2002. Vol. 8, No. 6. P. 562–573. doi: 10.1177/1073858402238515
  13. Kaufman D.L., Houser C.R., Tobin A.J. Two forms of the gamma-aminobutyric acid synthetic enzyme glutamate decarboxylase have distinct intraneuronal distributions and cofactor interactions // J. Neurochem. 1991. Vol. 56, No. 2. P. 720–723. doi: 10.1111/j.1471-4159.1991.tb08211.x
  14. Pinal C.S., Tobin A.J. Uniqueness and redundancy in GABA production // Perspect. Dev. Neurobiol. 1998. Vol. 5, No. 2–3. P. 109–118.
  15. Saper C.B. A guide to the perplexed on the specificity of antibodies // J. Histochem. Cytochem. 2009. Vol. 57, No. 1. P. 1–5. doi: 10.1369/jhc.2008.952770
  16. Коржевский Д.Э., Отеллин В.А., Григорьев И.П. и др. Иммуноцитохимическое выявления нейрональной NO-синтазы в клетках головного мозга крысы // Морфология. 2007. Т. 2, № 4. С. 77–80.
  17. Weller M.G. Quality Issues of Research Antibodies // Anal. Chem. Insights. 2016. No. 11. P. 21–27. doi: 10.4137/ACI.S31614
  18. Bordeaux J., Welsh A., Agarwal S. et al. Antibody validation // Biotechniques. 2010. Vol. 48, No. 3. P. 197–209. doi: 10.2144/000113382
  19. Кирик О.В., Григорьев И.П., Сухорукова Е.Г. и др. Использование методов иммуногистохимии для определения границы между субвентрикулярной зоной и стриатумом // Морфология. 2012. Т. 141, № 1. P. 81–84.
  20. Fritschy J.M. Is my antibody-staining specific? How to deal with pitfalls of immunohistochemistry // Eur. J. Neurosci. 2008. Vol. 28, No. 12. P. 2365–2370. doi: 10.1111/j.1460-9568.2008.06552.x
  21. Ward J.M., Rehg J.E. Rodent immunohistochemistry: pitfalls and troubleshooting // Vet. Pathol. 2014. Vol. 51, No. 1. P. 88–101. doi: 10.1177/0300985813503571
  22. Gown A.M. Diagnostic immunohistochemistry: What can go wrong and how to prevent it // Arch. Pathol. Lab. Med. 2016. Vol. 140, No. 9. P. 893–898. doi: 10.5858/arpa.2016-0119-RA
  23. Korzhevskii D.E., Sukhorukova E.G., Kirik O.V., Grigorev I.P. Immunohistochemical demonstration of specific antigens in the human brain fixed in zinc-ethanol-formaldehyde // Eur. J. Histochem. 2015. Vol. 59, No. 3. P. 5–9. doi: 10.4081/ejh.2015.2530
  24. Greif K.F., Erlander M.G., Tillakaratne N.J., Tobin A.J. Postnatal expression of glutamate decarboxylases in developing rat cerebellum // Neurochem. Res. 1991. Vol. 16, No. 3. P. 235–242. doi: 10.1007/BF00966086
  25. Martin D.L., Rimvall K. Regulation of gamma-aminobutyric acid synthesis in the brain // J. Neurochem. 1993. Vol. 60, No. 2. P. 395–407. doi: 10.1111/j.1471-4159.1993.tb03165.x
  26. Muñoz-Manchado A.B., Bengtsson Gonzales C., Zeisel A. et al. Diversity of interneurons in the dorsal striatum revealed by single-cell RNA sequencing and PatchSeq // Cell. Rep. 2018. Vol. 24, No. 8. P. 2179–2190.e7. doi: 10.1016/j.celrep.2018.07.053
  27. Lim L., Mi D., Llorca A., Marín O. Development and functional diversification of cortical interneurons // Neuron. 2018. Vol. 100, No. 2. P. 294–313. doi: 10.1016/j.neuron.2018.10.009
  28. Petilla Interneuron Nomenclature Group; Ascoli G.A., Alonso-Nanclares L., Anderson S.A. et al. Petilla terminology: nomenclature of features of GABAergic interneurons of the cerebral cortex // Nat. Rev. Neurosci. 2008. Vol. 9, No. 7. P. 557–568. doi: 10.1038/nrn2402
  29. Feldmeyer D., Qi G., Emmenegger V., Staiger J.F. Inhibitory interneurons and their circuit motifs in the many layers of the barrel cortex // Neuroscience. 2018. Vol. 368. P. 132–151. doi: 10.1016/j.neuroscience.2017.05.027
  30. Tremblay R., Lee S., Rudy B. GABAergic interneurons in the neocortex: From cellular properties to circuits // Neuron. 2016. Vol. 91, No. 2. P. 260–292. doi: 10.1016/j.neuron.2016.06.033
  31. Зайцев А.В. Классификация и функции ГАМК-эргических интернейронов новой коры млекопитающих // Биологические мембраны. 2013. Т. 30, № 4. С. 253–270. doi: 10.7868/S0233475513040099
  32. Markram H., Toledo-Rodriguez M., Wang Y. et al. Interneurons of the neocortical inhibitory system // Nat. Rev. Neurosci. 2004. Vol. 5, No. 10. P. 793–807. doi: 10.1038/nrn1519
  33. Wang J., Tian Y., Zeng L.H., Xu H. Prefrontal disinhibition in social fear: A vital action of somatostatin interneurons // Front. Cell. Neurosci. 2020. Vol. 14. P. 611732. doi: 10.3389/fncel.2020.611732
  34. Guet-McCreight A., Skinner F.K., Topolnik L. Common principles in functional organization of VIP/calretinin cell-driven disinhibitory circuits across cortical areas // Front. Neural. Circuits. 2020. Vol. 14. P. 32. doi: 10.3389/fncir.2020.00032
  35. Bereshpolova Y., Hei X., Alonso J.M., Swadlow H.A. Three rules govern thalamocortical connectivity of fast-spike inhibitory interneurons in the visual cortex // Elife. 2020. Vol. 9. P. e60102. doi: 10.7554/eLife.60102
  36. Разенкова В.А., Коржевский Д.Э. ГАМК-эргические аксосоматические синапсы нейронов коры головного мозга крысы // Цитология. 2020. Т. 62, № 11. С. 815–821. doi: 10.31857/S0041377120110097
  37. Колос Е.А., Коржевский Д.Э. Неоднородность реакции на холинацетилтрансферазу в холинергических нейронах // Нейрохимия. – 2016. – Т. 33. – № 1. – C. 56–62.
  38. Andrews W.D., Barber M., Nemitz M. et al. Semaphorin3A-neuropilin1 signalling is involved in the generation of cortical interneurons // Brain. Struct. Funct. 2017. Vol. 222, No. 5. P. 2217–2233. doi: 10.1007/s00429-016-1337-3

Дополнительные файлы

Доп. файлы
Действие
1. JATS XML
Скачать
2. Рис. 1. ГАМК-эргические окончания на пирамидном нейроне коры большого мозга: a — головной мозг крысы; иммуногистохимическая реакция на GAD67 с использованием поликлональных кроличьих антител; b — головной мозг кролика; иммуногистохимическая реакция на GAD67 с использованием моноклональных мышиных антител. Об. ×100. Стрелки указывают на синаптические терминали ГАМК-эргических нейронов, звездочка — на пирамидные нейроны

Скачать (360KB)
Метаданные
3. Рис. 2. Глутаматдекарбоксилаза в структурах конечного мозга крысы. Фронтальные срезы на уровне –0,4 мм от Брегмы: a — распределение GAD67; b — распределение GAD65; c — схема структур конечного мозга. ДС — дорсальный стриатум (хвостатое ядро и скорлупа); БШ — бледный шар; Септ — септальная зона

Скачать (322KB)
Метаданные
4. Рис. 3. ГАМК-эргические нейроны в коре головного мозга крыс: a — звездчатый нейрон; b — веретеновидный нейрон; c — треугольный нейрон; d — овальный нейрон; e — круглый нейрон. Об. ×100

Скачать (373KB)
Метаданные
5. Рис. 4. Количественная оценка ГАМК-эргических интернейронов в стриатуме и коре головного мозга крыс: а — число ГАМК-эргических нейронов разных областей мозга; b — площадь ГАМК-эргических нейронов разных областей мозга. * статистически значимые различия показателей (p < 0,001)

Скачать (103KB)
Метаданные

© Разенкова В.А., Коржевский Д.Э., 2021

Creative Commons License
Эта статья доступна по лицензии Creative Commons Attribution-NonCommercial-NoDerivatives 4.0 International License.

Согласие на обработку персональных данных с помощью сервиса «Яндекс.Метрика»

1. Я (далее – «Пользователь» или «Субъект персональных данных»), осуществляя использование сайта https://journals.rcsi.science/ (далее – «Сайт»), подтверждая свою полную дееспособность даю согласие на обработку персональных данных с использованием средств автоматизации Оператору - федеральному государственному бюджетному учреждению «Российский центр научной информации» (РЦНИ), далее – «Оператор», расположенному по адресу: 119991, г. Москва, Ленинский просп., д.32А, со следующими условиями.

2. Категории обрабатываемых данных: файлы «cookies» (куки-файлы). Файлы «cookie» – это небольшой текстовый файл, который веб-сервер может хранить в браузере Пользователя. Данные файлы веб-сервер загружает на устройство Пользователя при посещении им Сайта. При каждом следующем посещении Пользователем Сайта «cookie» файлы отправляются на Сайт Оператора. Данные файлы позволяют Сайту распознавать устройство Пользователя. Содержимое такого файла может как относиться, так и не относиться к персональным данным, в зависимости от того, содержит ли такой файл персональные данные или содержит обезличенные технические данные.

3. Цель обработки персональных данных: анализ пользовательской активности с помощью сервиса «Яндекс.Метрика».

4. Категории субъектов персональных данных: все Пользователи Сайта, которые дали согласие на обработку файлов «cookie».

5. Способы обработки: сбор, запись, систематизация, накопление, хранение, уточнение (обновление, изменение), извлечение, использование, передача (доступ, предоставление), блокирование, удаление, уничтожение персональных данных.

6. Срок обработки и хранения: до получения от Субъекта персональных данных требования о прекращении обработки/отзыва согласия.

7. Способ отзыва: заявление об отзыве в письменном виде путём его направления на адрес электронной почты Оператора: info@rcsi.science или путем письменного обращения по юридическому адресу: 119991, г. Москва, Ленинский просп., д.32А

8. Субъект персональных данных вправе запретить своему оборудованию прием этих данных или ограничить прием этих данных. При отказе от получения таких данных или при ограничении приема данных некоторые функции Сайта могут работать некорректно. Субъект персональных данных обязуется сам настроить свое оборудование таким способом, чтобы оно обеспечивало адекватный его желаниям режим работы и уровень защиты данных файлов «cookie», Оператор не предоставляет технологических и правовых консультаций на темы подобного характера.

9. Порядок уничтожения персональных данных при достижении цели их обработки или при наступлении иных законных оснований определяется Оператором в соответствии с законодательством Российской Федерации.

10. Я согласен/согласна квалифицировать в качестве своей простой электронной подписи под настоящим Согласием и под Политикой обработки персональных данных выполнение мною следующего действия на сайте: https://journals.rcsi.science/ нажатие мною на интерфейсе с текстом: «Сайт использует сервис «Яндекс.Метрика» (который использует файлы «cookie») на элемент с текстом «Принять и продолжить».