Структура гуматов в водных растворах и их биологическая активность

Полный текст

ВВЕДЕНИЕ

Представления о форме существования гуминовых веществ (ГВ) [1] в растворах были уточнены в 90-х годах ХХ века, когда было показано [2], что в водных растворах ГВ находятся в виде частиц-молекул размером 2−10 нм, которые при увеличении концентрации взаимодействуют, формируя надмолекулярные образования (НМО) размером 100−200 нм [3−5]. Эту структурную иерархию обеспечивает дифильность поверхности частиц-молекул ГВ, показанная в работе [6].

Есть мнение [7], что биологическая активность ГВ связана с их молекулярной массой: фракция менее 3500 Да, расчетный размер частиц которых не превосходит 3−4 нм, способна частично поглощаться клетками растений. При этом фракция более 3500 Да не поглощается клетками растения и взаимодействует только с клеточной стенкой. Пример такого взаимодействия – снижение гидравлической проводимости корневой системы при внесении ГВ под корень [8].

Учитывая, что размер пор в клетках растений исчисляется единицами нанометров [8], частицы-молекулы ГВ сопоставимого размера имеют больше шансов на проникновение в клетки.

Аналогичная ситуация должна наблюдаться в отношении микроорганизмов: чем меньше размер частиц ГВ, тем выше их шанс проникнуть в клетки [9−10]. В работе [11] было показано, что при добавлении ГВ в питательную среду в концентрациях ниже барьерной скорость развития некоторых микроорганизмов увеличивалась на 3 порядка.

Поскольку структура ГВ может быть разной – частицы-молекулы и НМО – то концентрация их растворов определяет вид существования. Это подтверждается данными литературы [3, 12, 13]: при концентрациях ГВ выше 30−50 мг л⁻¹ частицы-молекулы перестают существовать в свободном раздельно-частичном виде и находятся только в составе НМО. Можно предположить, что переход между этими формами ГВ должен изменять физико-химические свойства и биологическую активность их растворов.

Цель работы – проверка влияния формы существования ГВ в растворах на свойства этих растворов и их биологическую активность.

ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

В работе использовали водные растворы гумата калия (ООО “Агротехнологии”, Россия), полученного из бурого угля.

Электронно-микроскопическое исследования растворов гуматов проводили при помощи растрового электронного микроскопа (РЭМ) при ускоряющем напряжении 2−5 кВ. На предметные столики наносили растворы, высушивали их, после чего напыляли золото.

Размеры частиц в суспензиях определяли при помощи лазерного дифрактометра.

рН растворов определяли в трехкратной повторности. Доверительный интервал при 95% доверительной вероятности не превышал 10% от измеряемой величины.

Механохимическую активацию растворов проводили с помощью измельчителя биологических тканей при скорости 20000 об. мин⁻¹ в течение 5 мин каждый раз перед обработкой растворами растений.

Биологическую активность растворов ГВ до и после достижения барьерной концентрации оценивали по скорости роста культур дрожжей базидиомицетового аффинитета, представленные видами Saitozyma podzolica − КБП Y-4614 и Solicoccozyma terricola − КБП Y-1265. Штаммы взяты из коллекции кафедры биологии почв факультета почвоведения МГУ имени М.В.Ломоносова. Штамм Saitozyma podzolica выделен из темно-серой лесной почвы (Калужская область, Россия). Solicoccozyma terricola выделен из аллювиальной почвы (Северная Осетия, Россия).

Для культивирования дрожжей использовали жидкие питательные среды следующего состава: глюкоза (10 г л⁻¹), дрожжевой экстракт (10 г л⁻¹), пептон (10 г л⁻¹). Жидкие питательные среды готовили на водных растворах гуматов концентрацией 1 и 100 мг л⁻¹. Схема опыта включала в себя следующие варианты:

Способность дрожжевых культур к росту оценивали по мутности суспензии с помощью денситометра [14], определяя оптическую плотность через определенные промежутки времени (12–24 ч). Перед измерением оптической плотности культуры перемешивали при помощи вихревого смесителя в течение 5 с. Время культивирования составляло 5 сут. Для каждого штамма строили графики зависимости оптической плотности от времени. Растворы гуматов с концентрацией 1 и 100 мг л⁻¹ имеют разную оптическую плотность. Для получения корректных данных из значений оптической плотности опытного образца, т. е. раствора гумата, содержащего микроорганизмы, вычитали значения оптической плотности раствора гумата. В результате получали величину оптической плотности, которая соответствовала росту микроорганизмов в среде. Измерения выполняли в 3-кратной повторности. По полученным данным были рассчитаны средние значения и ошибка среднего.

Также биологическую активность растворов ГВ разных концентраций оценивали по скорости роста побегов огурцов (Cucumis sativus L.) среднеспелого сорта Кристина F1. Семена огурцов проращивали в установке Аэросад до появления проростков длиной 1−0.5 см. После этого проросшие семена высевали по 5 штук в литровый вегетационный сосуд с грунтом, содержащим питательные элементы: азот−фосфор−калий (NPK) 300, 500 и 600 мг кг⁻¹ соответственно. Для каждого варианта опыта использовали отдельный сосуд. Растения выращивали под фитолампами, создавая 18-тичасовую длину светового дня. После появления семядольных листьев огурцы ежедневно опрыскивали растворами ГВ. Срезку побегов огурцов и их взвешивание проводили после появления настоящих листьев. Проводили сравнение прироста вегетативной массы побегов огурцов, выраженное в процентах по отношению к контролю – растениям, обработанным дистиллированной водой. Все варианты опыта проводили в пятикратной повторности. Доверительный интервал при 95% доверительной вероятности не превышал 20% от измеряемой величины.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

На первом этапе работы при помощи лазерного дифрактометра изучили размер частиц гуматов в растворе. При концентрации 1000 мг л⁻¹ величина наблюдаемых образований доходила до микронных размеров и соответствовала размеру НМО.

Снижение концентрации ниже 30 мг л⁻¹, согласно данным растровой электронной микроскопии, уменьшало средний размер частиц в растворах гуматов. Распад надмолекулярных образований, сопровождавшийся снижением их размера, происходил в течение нескольких недель.

На следующем этапе было изучено влияние концентрации гумата на рН растворов (рис. 1). В области концентрации гумата около 50 мг л⁻¹ наблюдался скачок рН с 6.7 до 9.5. Это значение концентрации близко к диапазону, в котором растворы гуматов меняют структуру [12, 13]: частицы-молекулы перестают существовать в раздельно-частичной, то есть свободной форме, и образуют НМО. Механизм этого процесса, вероятно, основан на самосборке ГВ [3].

С позиции структурной организации ГВ скачок рН можно объяснить тем, что кислотные гидрофильные группы заключены между гидрофобными участками ГВ, которые защищают их от диссоциации. Реализация подобного механизма показана при добавлении в почву меченого спирта (2-деканола) индивидуально и в составе смеси с гуминовыми веществами [15].

Вследствие защиты гидрофобными участками способность к диссоциации кислотных групп восстанавливается только при распаде НМО. Мы предположили, что частицы-молекулы отделяются от крупных образований, и новые участки поверхности ГВ взаимодействуют с раствором.

Для проверки этого предположения растворы гуматов, в которых ГВ существуют в виде НМО, обработали на высокоскоростной мешалке (20000 об мин⁻¹) в течение 5 мин. Контроль – необработанный раствор. Результаты экспериментов показали, что при перемешивании рН снижался быстрее (рис. 1).

 

Рис. 1. Влияние концентрации гумата С на рН раствора.

 

Еще одно подтверждение существования барьерной концентрации у изучаемых гуматов было основано на изучении пленок ГВ, формирующихся на поверхности воды из-за дифильности ГВ [16]. Эти конденсированные пленки могут быть жидкообразными и твердообразными. Их вид зависит от энергии взаимодействия частиц ПАВ между собой: чем больше частицы, тем сильнее когезия между ними и толще пленка.

В ходе проведенных экспериментов было обнаружено, что частицы-молекулы образовывали жидкообразные пленки, а НМО – твердообразные пленки. Это позволило предложить полуколичественный метод определения барьерной концентрации между формами ГВ в растворах. Для обнаружения перехода конденсированной пленки в твердое состояние на нее наносили порошок талька. Если пленка твердообразная, то при осторожном сдувании порошок остается неподвижным. Если пленка жидкообразная, то порошок передвигается по поверхности, что хорошо видно даже без микроскопа.

Кроме концентрации гумата на тип образующихся на поверхности раствора пленок влияет длительность концентрирования частиц гумата на поверхности воды. Мы использовали время в качестве фиксируемого параметра и построили график зависимости твердения пленки в часах от логарифма концентрации гумата (рис. 2). Растворы гумата разных концентраций для приближения к равновесию обрабатывали на высокоскоростной мешалке и наливали в чашки Петри. Затем на них наносили порошок талька с частицами микронных размеров и помещали в эксикатор. Через каждые 30 мин на поверхность жидкости воздействовали слабой струей воздуха, отмечая наличие перемещения частиц талька друг относительно друга. Все опыты проводили в трехкратной повторности. Это коррелирует с результатами, полученными при изучении рН растворов гуматов.

 

Рис. 2. Влияние концентрации гуминовых веществ на прочность пленок, образующихся на поверхности воды.

 

После экспериментального подтверждения существования барьерной концентрации растворов гуматов были проведены испытания по изучению влияния структуры растворов гуматов на развитие микроорганизмов и проростков огурца.

Для некоторых изученных видов микроорганизмов при добавлении в питательные среды механоактивированного гумата в концентрациях ниже барьерной наблюдали стимуляцию их развития (рис. 3, 4).

 

Рис. 3. Влияние добавления гуматов в питательную среду на рост Solicoccozyma terricola.

 

Рис. 4. Влияние добавления гуматов в питательную среду на рост Saitozyma podzolica.

 

Хорошо известно, что многие базидиомицетовые дрожжи, в том числе и представители исследованных видов и родов, могут хорошо усваивать фенольные вещества [17]. Однако при исследовании веществ фенольной природы необходимо учитывать и возможный токсический эффект, а не только размер молекул и концентрацию. Например, дрожжевые грибы неохотно потребляют фенол, а протокатеховую кислоту и гидроксибензойные кислоты в тех же концентрациях усваивают гораздо лучше [17]. Многие почвенные бактерии, в том числе ассоциированные с почвенной мезофауной, неспособны к росту на питательной среде при добавлении гуматов в концентрации 200 мг л⁻¹ [18].

Фолиарная обработка проростков огурца механоактивированными растворами гуматов улучшила прирост вегетативной массы при концентрации ГВ ниже барьерной (табл. 1). Причем не перемешанные растворы ГВ даже низких концентраций практически не оказывали на растения значимого влияния.

 

Таблица 1. Влияние механоактивации растворов гуматов на прирост вегетативной массы огурцов

Концентрация гумата в растворе, мг л⁻¹	Наличие механохимической активации	Прирост Вегетативной массы, %
1	Нет	5
20	Нет	5
100	Нет	5
1	Да	23
3	Да	37
5	Да	40
10	Да	47
20	Да	20
100	Да	5

 

Результаты проведенных опытов дополнили представления о биологической активности растворов ГВ за счет информации о формах существования ГВ – частиц-молекул и НМО. Последние, в отличие от частиц-молекул, не могут проникнуть через клеточные стенки растений и микроорганизмов, что приводит к снижению эффективности применения растворов гуматов для стимуляции растений и микроорганизмов.

ВЫВОДЫ

1. Изменение рН растворов гуматов при изменении их концентрации отражает процессы самосборки частиц-молекул в надмолекулярные образования.
2. На основе определения концентрации твердения пленок ГВ на границе раствор–воздух впервые предложен полуколичественный метод определения концентрации, соответствующей переходу между существованием ГВ в растворах в виде частиц-молекул и НМО. Установлено, что переход происходит в диапазоне концентраций ГВ 20–50 мг л⁻¹.
3. При изучении биологической активности механоактивированных гуматов установлено, что при их добавлении в питательные среды в концентрациях ниже барьерной наблюдается стимуляция развития некоторых видов микроорганизмов.
4. Показано, что фолиарная обработка проростков огурца механоактивированными растворами ГВ при концентрациях ниже 50 мг л⁻¹ стимулирует ускоренный прирост вегетативной массы растений.

ИСТОЧНИК ФИНАНСИРОВАНИЯ

Работа выполнена при финансовой поддержке работы РНФ (проект № 22-14-00107).

КОНФЛИКТ ИНТЕРЕСОВ

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Об авторах

Г. Н. Федотов

Факультет почвоведения МГУ имени М.В.Ломоносова

Автор, ответственный за переписку.
Email: gennadiy.fedotov@gmail.com
Россия, 119992 Москва

С. А. Шоба

Факультет почвоведения МГУ имени М.В.Ломоносова

Email: gennadiy.fedotov@gmail.com

член-корреспондент РАН

Россия, 119992 Москва

И. В. Горепекин

Факультет почвоведения МГУ имени М.В.Ломоносова

Email: gennadiy.fedotov@gmail.com
Россия, 119992 Москва

Т. А. Грачева

Факультет почвоведения МГУ имени М.В.Ломоносова

Email: gennadiy.fedotov@gmail.com
Россия, 119992 Москва

А. В. Качалкин

Факультет почвоведения МГУ имени М.В.Ломоносова; Институт биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина Федерального исследовательского центра “Пущинский научный центр биологических исследований Российской академии наук”

Email: gennadiy.fedotov@gmail.com
Россия, 119992 Москва; 142290 Пущино

У. А. Конкина

Факультет почвоведения МГУ имени М.В.Ломоносова

Email: gennadiy.fedotov@gmail.com
Россия, 119992 Москва

Д. А. Ушкова

Факультет почвоведения МГУ имени М.В.Ломоносова

Email: gennadiy.fedotov@gmail.com
Россия, 119992 Москва

Список литературы

Дополнительные файлы