The RRE-REV module has no effect on the packaging efficiency of cas9 and Gag proteins into nanomedic virus-like particles

封面

如何引用文章

全文:

开放存取 开放存取
受限制的访问 ##reader.subscriptionAccessGranted##
受限制的访问 订阅存取

详细

Delivery of ribonucleoprotein complexes of Cas9 nuclease and guide RNA into target cells with virus-like particles (VLP) is one of the novel methods of genome editing, suitable for gene therapy of human diseases in the future. Efficiency of genome editing with VLPs depends on the packaging of Cas9 into VLPs, that is mediated by viral Gag protein. To increase the packaging of Cas9 into NanoMEDIC system VLPs plasmid constructs for expression of Cas9 and Gag were modified by the addition of HIV RRE (Rev response element), that is expected to increase the nuclear export of RRE-containing transcripts to cytosol via accessory protein Rev, as described for Vpr-Cas9-based VLP system. Here we found that Cas9 and Gag protein levels in the cell lysates are increased upon cotransfection of either Rev-expressing plasmid or empty control plasmid. Moreover, this effect does not depend on the presence of RRE in the transcript. On the top of that, we showed that AP21967-induced dimerization of FRB and FKBP12, but not the modification of plasmids with RRE and/or cotransfection of Rev-expressing plasmid, plays the major role in packaging of Cas9 into NanoMEDIC system VLPs. These data suggest that it is impractical to use the RRE-Rev module to enhance the packing of Cas9 nuclease into VLPs.

关键词

全文:

受限制的访问

作者简介

N. Kruglova

Institute of Gene Biology Russian Academy of Sciences

Email: mshepelev@mail.ru
俄罗斯联邦, Moscow

D. Komkov

Institute of Gene Biology Russian Academy of Sciences; Ben-Gurion University of the Negev

Email: mshepelev@mail.ru

Center for Precision Genome Editing and Genetic Technologies for Biomedicine, Department of Physiology and Cell Biology, Faculty of Health Sciences

俄罗斯联邦, Moscow; Israel, Be’erSheva

D. Mazurov

Institute of Gene Biology Russian Academy of Sciences; University of Minnesota

Email: mshepelev@mail.ru

Center for Precision Genome Editing and Genetic Technologies for Biomedicine, Division of Infectious Diseases and International Medicine, Department of Medicine

俄罗斯联邦, Moscow; USA, Minneapolis

M. Shepelev

Institute of Gene Biology Russian Academy of Sciences

编辑信件的主要联系方式.
Email: mshepelev@mail.ru
俄罗斯联邦, Moscow

参考

  1. Doudna J.A. // Nature. 2020. V. 578. № 7794. P. 229–236.
  2. Lino C.A., Harper J.C., Carney J.P., Timlin J.A. // Drug Deliv. 2018. V. 25. № 1. P. 1234–1257.
  3. Mazurov D., Ramadan L., Kruglova N. // Viruses. 2023. V. 15. № 3. P. 690.
  4. Banskota S., Raguram A., Suh S., Du S.W., Davis J.R., Choi E.H., Wang X., Nielsen S.C., Newby G.A., Randolph P.B., et al. // Cell. 2022. V. 185. № 2. P. 250-265.e16.
  5. Gee P., Lung M.S.Y., Okuzaki Y., Sasakawa N., Iguchi T., Makita Y., Hozumi H., Miura Y., Yang L.F., Iwasaki M., et al. // Nat Commun. 2020. V. 11. № 1. P. 1334.
  6. Mangeot P.E., Risson V., Fusil F., Marnef A., Laurent E., Blin J., Mournetas V., Massouridès E., Sohier T.J.M., Corbin A., et al. // Nat Commun. 2019. V. 10. № 1. P. 45.
  7. Hamilton J.R., Tsuchida C.A., Nguyen D.N., Shy B.R., McGarrigle E.R., Sandoval Espinoza C.R., Carr D., Blaeschke F., Marson A., Doudna J.A. // Cell Rep. 2021. V. 35. № 9. P. 109207.
  8. Montagna C., Petris G., Casini A., Maule G., Franceschini G.M., Zanella I., Conti L., Arnoldi F., Burrone O.R., Zentilin L., et al. // Mol Ther Nucleic Acids. 2018. V. 12. P. 453–462.
  9. Fernandes J., Jayaraman B., Frankel A. // RNA Biol. 2012. V. 9. № 1. P. 6–11.
  10. Pocock G. M., Becker J.T., Swanson C.M., Ahlquist P., Sherer N.M. // PLoS Pathog. 2016. V. 12. № 4. P. e1005565.
  11. Indikova I., Indik S. // Nucleic Acids Res. 2020. V. 48. № 14. P. 8178–8187.
  12. Mazurov D., Ilinskaya A., Heidecker G., Lloyd P., Derse D. // PLoS Pathog. 2010. V. 6. № 2. P. e1000788.
  13. Dull T., Zufferey R., Kelly M., Mandel R.J., Nguyen M., Trono D., Naldini L. // J Virol. 1998. V. 72. № 11. P. 8463–8471.
  14. Stewart S.A., Dykxhoorn D.M., Palliser D., Mizuno H., Yu E.Y., An D.S., Sabatini D.M., Chen I.S.Y., Hahn W.C., Sharp P.A., et al. // RNA. 2003. V. 9. № 4. P. 493–501.
  15. Han X., Liu Z., Ma Y., Zhang K., Qin L. // Adv Biosyst. 2017. V. 1. № 1–2. P. e1600007.
  16. Hu Q., Suzuki K., Hirschler-Laszkiewicz I., Rothblum L.I. // Biotechniques. 2002. V. 33. № 1. P. 74, 76, 78 passim.
  17. Stepanenko A.A., Heng H.H. // Mutat Res Rev Mutat Res. 2017. V. 773. P. 91–103.

补充文件

附件文件
动作
1. JATS XML
下载
2. Fig. 1. Schemes of plasmid constructs for obtaining VLP of the NanoMEDIC system. Plasmids pHLS-EF1α-FRB-SpCas9-A and pHLS-EF1α-FKBP12-Gag(HIV) were modified by adding an HIV-1 virus RRE element (RRE) between the coding sequence (FRB-Cas9 or FKBP12-Gag) and the polyadenylation signal (pA ). EF1α is the promoter of the human EEF1A1 gene.

下载 (92KB)
索引源数据
3. Fig. 2. Effect of Rev protein expression on the level of FRB-Cas9 and FKPB12-Gag production. Lysates of HEK293T cells transfected with FRB-Cas9 and FKPB12-Gag expression plasmids with or without RRE elements (RRE+) together with Rev protein expression plasmid (Rev+) or control plasmid pBluescriptSKII(-) (Rev-), were analyzed using Western blotting with antibodies to the HA epitope (FRB-Cas9), HIV p27 protein (FKBP12-Gag) and α-tubulin to control the total protein level in cell lysates. Results from one of two representative experiments are shown.

下载 (64KB)
索引源数据
4. Fig. 3. Assessment of the specificity of the effect of Rev protein expression on the level of FRB-Cas9 production. Lysates of HEK293T cells transfected with plasmids for the expression of FRB-Cas9 with or without RRE elements (RRE-) together with plasmids (a) for the expression of Rev and Eyfp proteins or control plasmids pBluescriptSKII(-) (pBl) and pCMV-pA (CMV) , or (b) for the expression of the Rev protein, its truncated form (Rev∆B), a plasmid with a deletion of the N-terminal part of the Rev cDNA (Rev∆BP) and a control plasmid (pBl) were analyzed using Western blotting with antibodies to HA- epitope (FRB-Cas9) and α-tubulin to control the total protein level in cell lysates. Results from one of two representative experiments are shown.

下载 (95KB)
索引源数据
5. Fig. 4. Influence of RRE elements on the packaging of Cas9 nuclease in the VLP of the NanoMEDIC system. VLPs were produced as described in the text using FRB-Cas9 and FKPB12-Gag expression plasmids with or without RRE elements in the presence of Rev protein (Rev+) or without Rev protein (Rev-). To induce dimerization of FRB and FKBP12, cells were treated with AP21967 at a concentration of 300 nM (AP+) or DMSO (AP-). 48 hours after transfection, lysates of VLPs and producer cells were obtained and analyzed using Western blotting with antibodies to the HA epitope (FRB-Cas9), HIV p17 protein (FKBP12-Gag) and α-tubulin to control the total protein level in cell lysates. Results from one of two representative experiments are shown.

下载 (79KB)
索引源数据

版权所有 © Russian Academy of Sciences, 2024

Согласие на обработку персональных данных с помощью сервиса «Яндекс.Метрика»

1. Я (далее – «Пользователь» или «Субъект персональных данных»), осуществляя использование сайта https://journals.rcsi.science/ (далее – «Сайт»), подтверждая свою полную дееспособность даю согласие на обработку персональных данных с использованием средств автоматизации Оператору - федеральному государственному бюджетному учреждению «Российский центр научной информации» (РЦНИ), далее – «Оператор», расположенному по адресу: 119991, г. Москва, Ленинский просп., д.32А, со следующими условиями.

2. Категории обрабатываемых данных: файлы «cookies» (куки-файлы). Файлы «cookie» – это небольшой текстовый файл, который веб-сервер может хранить в браузере Пользователя. Данные файлы веб-сервер загружает на устройство Пользователя при посещении им Сайта. При каждом следующем посещении Пользователем Сайта «cookie» файлы отправляются на Сайт Оператора. Данные файлы позволяют Сайту распознавать устройство Пользователя. Содержимое такого файла может как относиться, так и не относиться к персональным данным, в зависимости от того, содержит ли такой файл персональные данные или содержит обезличенные технические данные.

3. Цель обработки персональных данных: анализ пользовательской активности с помощью сервиса «Яндекс.Метрика».

4. Категории субъектов персональных данных: все Пользователи Сайта, которые дали согласие на обработку файлов «cookie».

5. Способы обработки: сбор, запись, систематизация, накопление, хранение, уточнение (обновление, изменение), извлечение, использование, передача (доступ, предоставление), блокирование, удаление, уничтожение персональных данных.

6. Срок обработки и хранения: до получения от Субъекта персональных данных требования о прекращении обработки/отзыва согласия.

7. Способ отзыва: заявление об отзыве в письменном виде путём его направления на адрес электронной почты Оператора: info@rcsi.science или путем письменного обращения по юридическому адресу: 119991, г. Москва, Ленинский просп., д.32А

8. Субъект персональных данных вправе запретить своему оборудованию прием этих данных или ограничить прием этих данных. При отказе от получения таких данных или при ограничении приема данных некоторые функции Сайта могут работать некорректно. Субъект персональных данных обязуется сам настроить свое оборудование таким способом, чтобы оно обеспечивало адекватный его желаниям режим работы и уровень защиты данных файлов «cookie», Оператор не предоставляет технологических и правовых консультаций на темы подобного характера.

9. Порядок уничтожения персональных данных при достижении цели их обработки или при наступлении иных законных оснований определяется Оператором в соответствии с законодательством Российской Федерации.

10. Я согласен/согласна квалифицировать в качестве своей простой электронной подписи под настоящим Согласием и под Политикой обработки персональных данных выполнение мною следующего действия на сайте: https://journals.rcsi.science/ нажатие мною на интерфейсе с текстом: «Сайт использует сервис «Яндекс.Метрика» (который использует файлы «cookie») на элемент с текстом «Принять и продолжить».