Эффективное редактирование локуса CXCR4 с помощью рибонуклеопротеиновых комплексов Cas9, стабилизированных полиглутаминовой кислотой

Обложка

Цитировать

Полный текст

Открытый доступ Открытый доступ
Доступ закрыт Доступ предоставлен
Доступ закрыт Только для подписчиков

Аннотация

Редактирование генов с помощью системы CRISPR/Cas9 открывает новые возможности в лечении заболеваний человека. По этой причине актуальной является разработка подходов для повышения эффективности геномного редактирования. В данной работе для повышения уровня редактирования локуса CXCR4, мишени для генотерапии ВИЧ-инфекции, белок Cas9 модифицировали, вводя дополнительные сигналы NLS, а рибонуклеопротеиновые комплексы Cas9 и гидовой РНК стабилизировали с помощью поли-L-глутаминовой кислоты. В совокупности это позволило в 1.8 раза повысить уровень нокаута CXCR4 в Т-клеточной линии CEM/R5 и в 2 раза повысить уровень нокина пептидного ингибитора слияния ВИЧ-1 МТ-С34 в первичных CD4+ Т-лимфоцитах.

Полный текст

Доступ закрыт

Об авторах

Д. С. Голубев

Центр высокоточного редактирования и генетических технологий для биомедицины

Автор, ответственный за переписку.
Email: natalya.a.kruglova@yandex.ru

Институт биологии гена Российской академии наук

Россия, Москва

Д. С. Комков

Центр высокоточного редактирования и генетических технологий для биомедицины; Ben-Gurion University of the Negev

Email: natalya.a.kruglova@yandex.ru

Институт биологии гена Российской академии наук, Department of Physiology and Cell Biology, Faculty of Health Sciences

Россия, Москва; Be’erSheva, Israel

М. В. Шепелев

Центр высокоточного редактирования и генетических технологий для биомедицины

Email: natalya.a.kruglova@yandex.ru

Институт биологии гена Российской академии наук

Россия, Москва

Д. В. Мазуров

Центр высокоточного редактирования и генетических технологий для биомедицины; University of Minnesota

Email: natalya.a.kruglova@yandex.ru

Институт биологии гена Российской академии наук, Division of Infectious Diseases and International Medicine, Department of Medicine

Россия, Москва; Minneapolis, USA

Н. А. Круглова

Центр высокоточного редактирования и генетических технологий для биомедицины

Email: natalya.a.kruglova@yandex.ru

Институт биологии гена Российской академии наук

Россия, Москва

Список литературы

  1. Pavlovic K., Tristán-Manzano M., Maldonado-Pérez N., et al. Using Gene Editing Approaches to Fine-Tune the Immune System // Front. Immunol. Frontiers Media SA, 2020. V. 11.
  2. Shams F., Bayat H., Mohammadian O., et al. Advance trends in targeting homology-directed repair for accurate gene editing: An inclusive review of small molecules and modified CRISPR-Cas9 systems // BioImpacts. 2022. V. 12. № 4. P. 371–391.
  3. Smirnikhina S. A., Zaynitdinova M. I., Sergeeva V. A., et al. Improving Homology-Directed Repair in Genome Editing Experiments by Influencing the Cell Cycle // Int. J. Mol. Sci. 2022. V. 23. № 11. P. 5992.
  4. Cornu T. I., Mussolino C., Müller M. C., et al. HIV Gene Therapy: An Update // Hum. Gene Ther. Hum Gene Ther. 2021. V. 32. № 1–2. P. 52–65.
  5. Maslennikova A., Mazurov D. Application of CRISPR/Cas Genomic Editing Tools for HIV Therapy: Toward Precise Modifications and Multilevel Protection // Front. Cell. Infect. Microbiol. Frontiers Media S. A. 2022. V. 12. P. 880030.
  6. Hou P., Chen S., Wang S., et al. Genome editing of CXCR4 by CRISPR/cas9 confers cells resistant to HIV-1 infection // Sci. Rep. 2015. V. 5. P. 15577.
  7. Wang Q., Chen S., Xiao Q., et al. Genome modification of CXCR4 by Staphylococcus aureus Cas9 renders cells resistance to HIV-1 infection. // Retrovirology. 2017. V. 14. № 1. P. 51.
  8. Maslennikova A., Kruglova N., Kalinichenko S., et al. Engineering T-Cell Resistance to HIV-1 Infection via Knock-In of Peptides from the Heptad Repeat 2 Domain of gp41 // MBio. American Society for Microbiology. 2022. V. 13. № 1.
  9. Kim S., Kim D., Cho S. W., et al. Highly efficient RNA-guided genome editing in human cells via delivery of purified Cas9 ribonucleoproteins // Genome Res. 2014. V. 24. № 6. P. 1012–1019.
  10. Maggio I., Zittersteijn H. A., Wang Q., et al. Integrating gene delivery and gene-editing technologies by adenoviral vector transfer of optimized CRISPR-Cas9 components // Gene Ther. 2020. V. 27. № 5. P. 209–225.
  11. Nguyen D. N., Roth T. L., Li P. J., et al. Polymer-stabilized Cas9 nanoparticles and modified repair templates increase genome editing efficiency // Nat. Biotechnol. 2020. V. 38. № 1. P. 44–49.
  12. Cong L., Ran F. A., Cox D., et al. Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems // Science. 2013. V. 339. № 6121. P. 819–823.
  13. Shui S., Wang S., Liu J. Systematic Investigation of the Effects of Multiple SV40 Nuclear Localization Signal Fusion on the Genome Editing Activity of Purified SpCas9 // Bioengineering. 2022. V. 9. № 2. P. 83.
  14. Staahl B. T., Benekareddy M., Coulon-Bainier C., et al. Efficient genome editing in the mouse brain by local delivery of engineered Cas9 ribonucleoprotein complexes // Nat. Biotechnol. 2017. V. 35. № 5. P. 431–434.
  15. Buckley C. D., Amft N., Bradfield P. F., et al. Persistent Induction of the Chemokine Receptor CXCR4 by TGF-β1 on Synovial T Cells Contributes to Their Accumulation Within the Rheumatoid Synovium // J. Immunol. 2000. V. 165. № 6. P. 3423–3429.
  16. Shy B. R., Vykunta V. S., Ha A., et al. High-yield genome engineering in primary cells using a hybrid ssDNA repair template and small-molecule cocktails // Nat. Biotechnol. 2023. V. 41. № 4. P. 521–531.
  17. Kath J., Du W., Pruene A., et al. Pharmacological interventions enhance virus-free generation of TRAC-replaced CAR T cells // Mol. Ther. Methods Clin. Dev. 2022. V. 25. P. 311–330.
  18. Mohr M., Damas N., Gudmand-Høyer J., et al. The CRISPR-Cas12a Platform for Accurate Genome Editing, Gene Disruption, and Efficient Transgene Integration in Human Immune Cells // ACS Synth. Biol. 2023. V. 12. № 2. P. 375–389.
  19. Oh S. A., Senger K., Madireddi S., et al. High-efficiency nonviral CRISPR/Cas9-mediated gene editing of human T cells using plasmid donor DNA // J. Exp. Med. 2022. V. 219. № 5.
  20. Makkerh J. P.S., Dingwall C., Laskey R. A. Comparative mutagenesis of nuclear localization signals reveals the importance of neutral and acidic amino acids // Curr. Biol. 1996. V. 6. № 8. P. 1025–1027.

Дополнительные файлы

Доп. файлы
Действие
1. JATS XML
Скачать
2. Рис. 1. (а) Схемы плазмидных конструкций для экспрессии Cas9 с различным числом NLS в клетках E.coli. Пока- заны аминокислотные последовательности NLS вируса SV40, NLS из белка нуклеоплазмина и последовательность второго оснóвного мотива из NLS нуклеоплазмина (PAAKKKK) [20]. (б) Электрофореграмма лизатов клеток E.coli BL21 (DE3), трансформированных одной из четырех конструкций для продукции Cas9, до и после индукции экс- прессии с помощью IPTG. Белки разделяли в 7.5 % акриламидном геле и окрашивали красителем Кумасси R‑250. М – маркеры молекулярного веса белков.

Скачать (363KB)
Метаданные
3. Рис. 2. (а) Уровень нокаута CXCR4 в клетках CEM/R5, электропорированных RNP с Cas9–1xNLS или Cas9– 3xNLS. (б) Уровень нокаута CXCR4 в клетках CEM/R5, электропорированных комплексами RNP с добавлением PGA (+) или без добавления PGA (–). Экспрессию белка CXCR4 анализировали с помощью проточной цитометрии проводили на 3 день после электропорации. (в) Уровень нокина пептида МТ-С34 в локус CXCR4 в CD4+ Т-лимфо- цитах, электропорированных RNP с Cas9-3xNLS вместе с донорной плазмидой pJet-X4ex2 в присутствии PGA (+) или без PGA (–).

Скачать (206KB)
Метаданные

© Российская академия наук, 2024

Согласие на обработку персональных данных с помощью сервиса «Яндекс.Метрика»

1. Я (далее – «Пользователь» или «Субъект персональных данных»), осуществляя использование сайта https://journals.rcsi.science/ (далее – «Сайт»), подтверждая свою полную дееспособность даю согласие на обработку персональных данных с использованием средств автоматизации Оператору - федеральному государственному бюджетному учреждению «Российский центр научной информации» (РЦНИ), далее – «Оператор», расположенному по адресу: 119991, г. Москва, Ленинский просп., д.32А, со следующими условиями.

2. Категории обрабатываемых данных: файлы «cookies» (куки-файлы). Файлы «cookie» – это небольшой текстовый файл, который веб-сервер может хранить в браузере Пользователя. Данные файлы веб-сервер загружает на устройство Пользователя при посещении им Сайта. При каждом следующем посещении Пользователем Сайта «cookie» файлы отправляются на Сайт Оператора. Данные файлы позволяют Сайту распознавать устройство Пользователя. Содержимое такого файла может как относиться, так и не относиться к персональным данным, в зависимости от того, содержит ли такой файл персональные данные или содержит обезличенные технические данные.

3. Цель обработки персональных данных: анализ пользовательской активности с помощью сервиса «Яндекс.Метрика».

4. Категории субъектов персональных данных: все Пользователи Сайта, которые дали согласие на обработку файлов «cookie».

5. Способы обработки: сбор, запись, систематизация, накопление, хранение, уточнение (обновление, изменение), извлечение, использование, передача (доступ, предоставление), блокирование, удаление, уничтожение персональных данных.

6. Срок обработки и хранения: до получения от Субъекта персональных данных требования о прекращении обработки/отзыва согласия.

7. Способ отзыва: заявление об отзыве в письменном виде путём его направления на адрес электронной почты Оператора: info@rcsi.science или путем письменного обращения по юридическому адресу: 119991, г. Москва, Ленинский просп., д.32А

8. Субъект персональных данных вправе запретить своему оборудованию прием этих данных или ограничить прием этих данных. При отказе от получения таких данных или при ограничении приема данных некоторые функции Сайта могут работать некорректно. Субъект персональных данных обязуется сам настроить свое оборудование таким способом, чтобы оно обеспечивало адекватный его желаниям режим работы и уровень защиты данных файлов «cookie», Оператор не предоставляет технологических и правовых консультаций на темы подобного характера.

9. Порядок уничтожения персональных данных при достижении цели их обработки или при наступлении иных законных оснований определяется Оператором в соответствии с законодательством Российской Федерации.

10. Я согласен/согласна квалифицировать в качестве своей простой электронной подписи под настоящим Согласием и под Политикой обработки персональных данных выполнение мною следующего действия на сайте: https://journals.rcsi.science/ нажатие мною на интерфейсе с текстом: «Сайт использует сервис «Яндекс.Метрика» (который использует файлы «cookie») на элемент с текстом «Принять и продолжить».