Обнаружение трех видовых комплексов, близких по морфологии к Diacyclops galbinus, D. versutus и D. improcerus (Copepoda: Cyclopoida), из озера Байкал

Полный текст

1. Введение

Cyclopoida представляют одну из самых разнообразных групп ракообразных в озере Байкал, следуя по численности видов после амфипод, остракод и гарпактицид (Тимошкин, 2001). Самыми богатыми по видовому составу среди них являются роды Diacyclops Kiefer, 1927 и Acanthocyclops Kiefer, 1927. Оба рода таксономически сложные в связи с их близким родством и высоким разнообразием видов. Выделяют несколько морфологических групп среди Diacyclops, которые рассматриваются, как видовые комплексы (Pesce, 1994; Karanovic, Krajicek, 2012; Reid and Strayer, 1994). Diacyclops в озере Байкал представлен 17 видами, из которых 15 эндемики (Мазепова, 1978; Sheveleva et al., 2012; Flössner, 1984). Три вида Diacyclops из озера Байкал, из которых D. talievi (Mazepova, 1970) - эндемик, принадлежат bicuspidatus-группе. Два эндемичных вида, D. eulithoralis Arov, Alekseev, 1986 и D. biceri Boxshall et al., 1993, относят к virginianus-группе согласно Пеше (1994) или к группе 2 (languidoides) согласно Рейд (1994). Двенадцать эндемичных видов Diacyclops имеют 11-членистые антеннулы, формулу членистости плавательных (экзоподит/эндоподит): 2.2/3.2/3.3/3.3 и экзоподальную щетинку на базиподите антенне и принадлежат languidoides-группе. Diacyclops в озере обитают в течение круглого года на всех глубинах, начиная с зоны заплеска, но наиболее разнообразны они в литорали Байкала Эндемичные Diacyclops представлены интерстициальными, бентосными и связанными с губками видами (Тимошкин, 2001; Alekseev and Arov, 1986).

Подавляющая часть эндемичных видов Diacyclops была описана Г.Ф. Мазеповой в 1950-1960-е гг., открывшей эту разнообразную и высокоэндемичную группу (Мазапова, 1978). Придерживаясь таксономической системы Рылова (1948), автор отнесла все описанные виды к роду Acanthocyclops. В последующие годы было описано еще четыре вида Diacyclops и переописан один вид D. arenosus (Mazepova, 1950), обитающих в озере Байкал (Flössner, 1984; Boxshall et al., 1993; Sheveleva et al., 2010; Sheveleva and Mirabdullaev, 2017).

Эндемичные D. versutus (Mazepova, 1962), D. improcerus (Mazepova, 1950), D. konstantini (Mazepova, 1962) и субэндемичный D. galbinus (Mazepova, 1962), схожи по морфологии и являются симпатрическими видами. D. improcerus, D. konstantini и D. galbinus широко распространены, тогда как D. versutus редко встречается в байкальской литоральной зоне (Мазепова, 1978). D. galbinus и D. improcerus также обитают в интерстициали озера Байкал. D. galbinus был обнаружен за пределами Байкала в озере Шартлинское, расположенном в северо-западной части байкальской береговой линии (Sheveleva et al., 2013; Шабурова, 2010).

В описании D. improcerus, D. galbinus и D. versutus приводятся значительные вариации морфологических признаков. Таким образом, возникает вопрос, все ли особи, отнесенные к D. versutus, D. galbinus или D. improcerus принадлежат этим видам? Г.Ф. Мазепова объясняла значительную индивидуальную морфологическую вариабельность D. galbinus и D. improcerus продолжающимися у них процессами активного видообразования (Мазепова, 1978).

Первые результаты исследования Cyclopoida из озера Байкал выявили несогласованность молекулярных и морфологических данных для циклопов, по морфологии схожих с D. versutus, D. improcerus и D. galbinus. (Майор и др., 2017). Проанализированные особи циклопов по молекулярным данных вошли в филогруппы с неопределенным таксономическим статусом. Последующий анализ циклопов, относящихся к одной из этих филогрупп, обитающих в Южном Байкале, показал, что морфологически и генетически все исследованные особи близки между собой и, по-видимому, относятся к новому виду D. sp. (VIG2) (Mayor et al., 2019).

В этой работе мы продолжаем исследование Diacyclops из озера Байкал, близких по морфологии D. versutus, D. improcerus и D. galbinus и D. konstantini, используя морфологические и молекулярные методы.

2. Материалы и методы

2.1. Сбор материла и таксономическое определение

Циклопы были собраны в Южном, Центральном и Северном бассейнах озера Байкал в 2018 – 2023 гг. Прибрежные пробы отбирали сачком с размером ячеи сети 100 мкм. Более глубоководные пробы (2-30 м) отбирали с помощью аквалангиста. Несколько циклопов были любезно предоставлены Сухановой Л.В. и Лухневым А.Г. (ЛИН СО РАН). Циклопов фиксировали в 96% этаноле и хранили при - 20°C.

Таксономическое определение циклопов проводили, используя таксономический ключ Г.Ф. Мазеповой (1978). В исследовании использовали особей, морфологически сходных с D. versutus, D. improcerus, D. galbinus и D. konstantini. Характеристики отбора проб представлены в Таблице 1.

 

Таблица 1. Характеристики отбора проб, NCBI номера доступа для полученных нуклеотидных последовательностей

Номер особи	Пол	Дата отбора проб	Место отбора проб	Координаты	Глубина, м	Субстрат	Морфологические данные	Длина ITS1 (п.н.)	NCBI номер доступа
									COI мтDNA	12S рРНК	ITS1
BG5**	♀	28.05.2018	пос. Большое Голоустное	52°01.352’ N 105°23.514’ E	0,3-0,5	камни	+	318	MK207031	MT020872	MK207045
84**	♀	06.2008	залив Курма	53°10.114’ N 106°58.424’ E	0,3-0,5	камни	-	-	GU055755	-	-
BG2**	♀	28.05.2018	пос. Большое Голоустное	52°01.352’ N 105°23.514’ E	0,3-0,5	камни, песок	+	-	MK207029	-	-
BG4**	♀	28.05.2018	пос. Большое Голоустное	52°01.352’ N 105°23.514’ E	0,3-0,5	камни, песок	+	-	MK207030	-	-
D10**	♀	04.2018	пос. Листвянка	51°52.022’ N 104°49.567’ E	0,3-0,5	камни	+	-	MK207035	-	-
D12**	♀	04.2018	пос. Листвянка	51°52.022’ N 104°49.567’ E	0,3-0,5	камни	+	-	MK207037	-	MK207051
BK4**	♀	04.06.2018	пос. Большие Коты	51°54.114’ N 105°04.267’ E	0,3-0,5	камни, песок	-	318	MK207027	MT020873	MK207049
266*	♀	-	оз. Байкал	-	-	-	+	338	MT176788	MT020868	MT010631
270*	♀	-	оз. Байкал	-	-	-	+	338	MT176789	-	MT010632
366*	♀	17.06.2019	пос. Большие Коты	51°54.111’ N 105°04.061’ E	1,2	камень с лишайником	+	314	MT176791	-	MT010628
369*	♀	17.06.2019	пос. Большие Коты	51°54.111’ N 105°04.061’ E	1,2	камень с лишайников	-	314	MT176792	MT020870	MT010629
397*	♀	03.2014	пос. Большие Коты	-	-	-	+	-	MT176790	-	-

 

Номер особи	Пол	Дата отбора проб	Место отбора проб	Координаты	Глубина, м	Субстрат	Морфологические данные	Длина ITS1 (п.н.)	NCBI номер доступа
									COI мтDNA	12S рРНК	ITS1
D16	♀	19.05.2018	г. Слюдянка	51°40.017’ N 103°42.532’ E	0,3-0,5	камни	+	314	MK207039	MT020874	MT010630
BG14	♀	28.05.2018	пос. Большое Голоустное	52°01.352’ N 105°23.514’ E	0,3-0,5	камни, песок	+	-	MT176787	-	MK591137
BG15	♀	28.05.2018	пос. Большое Голоустное	52°01.352’ N 105°23.514’ E	0,3-0,5	камни, песок	+	320	MT176793	MT020871	MK207047
BK21	♀	04.06.2018	пос. Большие Коты	51°54.114’ N 105°04.267’ E	0,3-0,5	камни, песок	+	333	MK207028	-	MK207050
MM1	♀	23.12.2018	Малые Ольхонские Ворота	53°01.073’ N 106°54.008’ E	0,5	-	+	-	MT176794	MT020875	MK591138
MM2	♀	23.12.2018	Малые Ольхонские Ворота	53°01.073’ N 106°54.008’ E	0,5	-	+	-	MT176795	MT020876	-
MM3	♀	23.12.2018	Малые Ольхонские Ворота	53°01.073’ N 106°54.008’ E	0,5	-	+	-	MT176796	-	-
F2	♀	31.05.2021	пос. Большие Коты	51°54.128’ N 105°06.168’ E	6	камни	+	314	-	-	OR502812
F96	♀	05.06.2021	р. Немнянка	55°32.32’ N 109°48.57’ E	6	губка	+	-	-	-	OR502819
F107	♀	19.09.2022	мыс Катков	53°11.3512’ N 108°25.679’ E	10	камни	+	314	OR506695	-	OR502813
F112-1	♀	26.09.2022	мыс Арул	53°27.855’ N 107°33.192’ E	10	камни, песок	-	-	-	-	OR502820
F112-3	♀	26.09.2022	мыс Арул	53°27.855’ N 107°33.192’ E	10	камни, песок	+	-	-	-	OR502821
F112-5	♀	26.09.2022	мыс Арул	53°27.855’ N 107°33.192’ E	10	камни, песок	+	-	-	-	OR502822
F112-6	♀	26.09.2022	мыс Арул	53°27.855’ N 107°33.192’ E	10	камни, песок	+	-	-	-	OR502823
F112-7	♀	26.09.2022	мыс Арул	53°27.855’ N 107°33.192’ E	10	камни, песок	-	-	-	-	OR502814
F116-1	♀	17.09.2022	д. Ангасолка	51°43.6301’ N 103°46.486’ E	20	камни	+	-	-	-	OR502800
F116-2	♀	17.09.2022	д. Ангасолка	51°43.6301’ N 103°46.486’ E	20	песок	+	-	OR501221	-	OR502801
F120	♀	25.09.2022	мыс Нижний Кедровый	54°21.47’ N 108°30.4’ E	15	камни	+	330	-	-	OR502803
F130	♀	26.09.2022	мыс Арул	53°27.962’ N 107°33.999’E	30	-	+	300	-	-	OR502804
F135-1	♀	16.09.2022	Уланово	51°47.7913’ N 104°31.515’ E	30	песок	+	303	-	-	OR502805
F135-2	♀	16.09.2022	Уланово	51°47.7913’ N 104°31.515’ E	30	песок	+	325	-	-	OR502806
F136-1	♀	17.09.2022	д. Ангасолка	51°43.6301’ N 103°46.486’ E	5	песок	+	320	-	-	OR502807
F136-2	♀	17.09.2022	д. Ангасолка	51°43.6301’ N 103°46.486’ E	5	песок	+	-	-	-	OR502815
F144	♀	27.09.2022	Чертов Мост	51°56.133’ N 105°15.672’ E	15	камни, песок	+	-	PP280626	-	OR502808
F156-1	♀	16.09.2022	Уланово	51°47.7913’ N 104°31.515’ E	10	песок	+	-	OR506692	-	OR502809
F156-2	♀	16.09.2022	Уланово	51°47.7913’ N 104°31.515’ E	10	песок	+	328	OR506693	-	OR502810
F156-3	♀	16.09.2022	Уланово	51°47.7913’ N 104°31.515’ E	10	песок	+	-	OR506691	-	OR502817
F191-1	♀	27.04.2023	пос. Большие Коты	51°53.5859’ N 105°03.502’ E	1	камни, песок	-	333	-	-	OR502811
F191-3	♀	27.04.2023	пос. Большие Коты	51°53.5859’ N 105°03.502’ E	1	камни, песок	+	-	-	-	OR502802
F191-4	♀	27.04.2023	пос. Большие Коты	51°53.5859’ N 105°03.502’ E	1	камни, песок	+	-	-	-	-
F191-5	♂	27.04.2023	пос. Большие Коты	51°53.5859’ N 105°03.502’ E	1	камни, песок	+	-	OR506696	-	OR502818
F193	♀	27.04.2023	пос. Большие Коты	51°53.5859’ N 105°03.502’ E	1	камни, песок	+	-	-	-	-

Примечание:

«*» – циклопы, были любезно предоставлены Л.В. Сухановой и А.Г. Лухневым

«**» – данные для циклопов были опубликованы ранее (Mayor et al., 2019)

«+» – данные имеются

«-» – данные отсутствуют

 

2.2. Морфологический анализ

Морфологический анализ проводили с помощью стереомикроскопа МСП-1 (ЛОМО, Россия) и микроскопа Olympus CX 41 (Olympus, Япония). Особи вымачивали в воде, фотографировали и измеряли с помощью цифровой камеры Levenhuk M 800 Plus, присоединенной к микроскопу Olympus CX 41 и программного обеспечения LevenhukLite (Levenhuk, Inc., США). Рисунки четвертой пары плавательных ног были выполнены с помощью микроскопа Olympus CX 41 и рисовальной насадки U-DA (Olympus, Япония). Рисунки морфологических признаков выполняли с помощью рисовальной насадки U-DA Olympus Drawing Attachment для Olympus CX41 (Olympus, Япония). Длину тела получали, суммируя длину цефалоторакса, торакальных и абдоминальных сегментов.

 

Сокращения морфологических обозначений:

Ti	внутренняя терминальная щетинка
Te	внешняя терминальная щетинка
Td	дорсальная щетинка
Tl	латеральная щетинка
Tmi	средняя внутренняя терминальная щетинка
Tme	средняя внешняя терминальная щетинка
Lf	длина каудальных ветвей
Wf	ширина каудальных ветвей
Enp3	третий эндподитный членик
P4, P5	четвертая, пятая пара плавательных ног
LP5	длинная дистального членика P5
IAS	внутренний апикальный шип третьего эндподита P4
EAS	внешний апикальный шип третьего эндподита P4
L	длина
W	ширина
A1	антеннула
A2	анетенна
Cphth	цефалоторакс
sp	шип
se	щетинка

 

Для конфокальной лазерной сканирующей микроскопии (КЛСМ) образцы самок циклопов окрашивали красным Конго в течение ночи и помещали на предметное стекло, следуя процедуре, описанной Михельсом и Бюнцовым (Michels and Büntzow, 2010). Материал сканировали с помощью лазерного конфокального микроскопа Carl Zeiss LSM 710 (Zeiss, Германия) с линзами Plan-Apochromat 20×/0,8 и 63×/1,40 Oil DIC M27; фильтры 570-670 нм; 561 нм, при 3,0 % мощности лазеров. Наиболее изменчивые морфологические показатели оценивали с помощью анализа соответствия и использовали для метода главных компонент. Все статистические анализы были выполнены с использованием Past 4.11 (Hammer et al., 2001).

2.3. Выделение ДНК, ПЦР и секвенирование

Общую ДНК выделяли из яйцевых мешков или соматической ткани следующим образом: особи циклопов, фиксированные этанолом, повторно регидратировали в деионизованной воде в течение 20 мин. Затем биологический материал инкубировали в 2-кратном буфере Encyclo для ПЦР (без Mg2+) (Evrogen, Россия), содержащем 0,1 мг/мл Протеиназы К, при 65°C в течение 1 часа. После этого проводили инкубацию при 94°C в течение 5 мин. для деактивации Протеиназы К. Полученный раствор, содержащий тотальную ДНК, хранили при температуре -20°C и использовали в 10-кратном разведении для ПЦР в качестве ДНК-матрицы.

ПЦР проводили с использованием универсальных праймеров, LCO-1490 и HCO-2198 для амплификации фрагмента COI (Folmer et al., 1994), KP2 (5’-AAAAAGCTTCCGTAGGTGAACCTGCG-3’) и 5,8С (5’-AGCTTGGTGCGTTCTTCATCGA-3’) для амплификации ITS1 (Phillips et al., 2000), и H13845-12S (5’-GTGCCAGCAGCTGCGTTA-3’) и L13337-12S (5’-YCTACTWTGYTACGACTTATCTC-3’) для амплификации 12S (Machida et al., 2002). Амплификацию проводили в термоциклере 100TM (Bio Rad, США) с использованием реагентов для ПЦР (Evrogen, Россия). Реакцию проводили в смеси объемом 20 мкл: 1x Encyclo буфер, 3,5 мМ магния, 0,5 мкМ каждого праймера, 0,2 мМ каждого dNTP, 0,5 единиц ДНК-полимеразы Encyclo и 2 мкл раствора, содержащего ДНК.

Программа амплификации включала этап нагревания смеси до 94°C в течение 4 мин., 35-40 циклов, состоящих из следующих этапов: 94°C в течение 15 сек., 48°C или 57°C (для фрагментов COI и ITS1, 12S соответственно) в течение 20 сек., 72 °C в течение 1 мин. Заключительную стадию элонгации проводили при 72°C в течение 4 мин. Для секвенирования ампликоны экстрагировали из агарозного геля с использованием протокола, описанного ранее (Майор и др., 2010). Нуклеотидные последовательности целевых фрагментов определяли с помощью набора для секвенирования ABI PRISM BigDye Terminator v. 3.1 в 8-капиллярных генетических анализаторах ABI 3500 (Thermo Fisher Scientific, США) и Нанофор 05 (Синтол, Россия).

2.4. Молекулярно-филогенетический анализ

Полученные последовательности были внесены в базу данных GenBank, и их номера доступа в NCBI приведены в Таблице 1. Выравнивание нуклеотидных последовательностей и расчет генетических расстояний были выполнены с использованием программы MegaX (Kumar et al., 2018). Полиморфизм ДНК оценивали с помощью программы DnaSP 5.10.01 (Rozas et al., 2003). Внутригеномный полиморфизм был обнаружен в некоторых последовательностях ITS1, и мы закодировали сайты с двойными пиками в соответствии с IUPAC. Для анализа наборов данных COI, 12S и ITS1 мы выбрали модели GTR + G, HKY+G и TN93 + G, соответственно, на основе информационного критерия Акайке и Байесовского информационного критерия, рассчитанных с помощью jModelTest 2.1.6 (Darriba et al., 2012). Деревья максимального правдоподобия были построены с использованием IQ-TREE2 (Minh et al., 2020). Поддержка узлов для ветвей оценивалась с помощью бутстрэп алгоритма, используя 1000 репликаций. Кроме того, мы включили в анализ последовательности видов Diacyclops и других циклопов, доступных в базе генетических данных. Их номера доступа в GenBank приведены на филогенетических деревьях. Деревья были визуализированы и отредактированы с использованием Interactive Tree Of Life (iTOL) версии 6.8.1 (https://itol.embl.de, доступ осуществлен 16 сентября 2023 г. и 3 октября 2023 г.)) (Letunic and Bork, 2021).

Для делимитации видов на основе набора данных COI, мы применяли методы определения границ видов, которые используют попарные генетические расстояния и филогенетические деревья. Мы использовали инструмент Assemble Species by Automatic Partitioning (ASAP) с p-дистанциями и настройками по умолчанию (https://bioinfo.mnhn.fr/abi/public/asap/ дата обращения: 3 октября 2023 года) (Puillandre et al., 2021). В анализе использовали также методы Poisson Tree Processes (PTP) и Bayesian Poisson Tree Processes (bPTP) (Zhang et al., 2013) с настройками по умолчанию и ML-деревом, полученным в ходе исследования. Кроме того, был использован Generalized Mixed Yule Coalescent (GMYC) метод с ультраметрическим деревом, полученным в программе Beast 2.5.2 (Bouckaert et al., 2014). Ссылки на источники для PTP и GMYC https://species.h-its.org/ptp/ и https://species.h-its.org/gmyc/, соответственно, дата обращения 20 октября 2023 года.

3. Результаты

3.1. Таксономическая идентификация

Сорок три особи взрослых самок и один самец Diacyclops были отобраны из озера Байкал с различных субстратов и глубин от уреза воды до 30 м (Таблица 1). Семь из них отнесены к D. sp. (VIG2). Для 38 особей получены фотографии и проведены измерения морфологических признаков, включая антеннулы, каудальные ветви и их щетинки, плавательные ноги 4 и 5 пары и длину тела. Определены морфометрические индексы используемые как в таксономии циклопов, так и приводимые Г.Ф. Мазеповой (1978) в описании байкальских Diacyclops. Большинство рачков были сфотографированы до выделения ДНК. Три экзоскелета были потеряны после экстракции ДНК, и для этих особей есть только молекулярные данные. Две из них принадлежат Diacyclops с наименьшей длиной тела в анализе.

Среди 10 особей, наиболее близких по морфологии D. improcerus, часть отличалась от данного вида более коротким цефалотораксом и более длинными антеннулами, другая часть отличалась вооружением Enp3P4, которое состояло из трех шипов и двух щетинок вместо двух шипов и трех щетинок. Из 10 особей схожих с D. galbinus, 6 особей отличались от этого вида более длинными каудальными ветвями, более короткой латеральной щетинкой относительно ширины каудальных ветвей и более длинной Te. Одна особь (MM1) отличалась более короткими апикальным шипом P5 и цефалотораксом. Две особи (BG14, F144) имели более короткий цефалоторакс (Таблица 2). Для одной особи (F112-7), близкой по строению EnpP4 к D. galbinus имеются только молекулярные данные. В исследование были включены 14 особей, близкие по морфологии на D. versutus. Но все они имеют более длинную латеральную щетинку относительно ширины каудальных ветвей. Две особи (F156-1, F156-3) отличались от D. versutus также более короткими каудальными ветвями и меньшей пропорцией дорсальной щетинки и Te. Особь F156-2 отличалась от D. versutus также меньшей пропорцией Ti и Te. Самец (F191-5) был схож по морфологии к самкам (F193, F191-1 – F191-4) и D. versutus в вооружении Enp3P4 и также был включен в анализ. Три особи были определены, как D. konstantini.

 

Таблица 2. Морфометрические параметры анализируемых циклопов

Вид, номер особи	Lf/Wf	Te/Ti	Tmi/Tme	Td/Te	Tl/Wf	Lenp3P4/ м Wenp3P4	IAS/EAS	LA1/Lcphth	Lcphth/длина 2-5 сегментов торакса	LspP5/LP5
D. versutus*	1,8-3,4 (2,5)	0,5-1,8 (1,2)	1,7-2,2 (1,8)	0,9-1,5 (1,2)	0,3-0,6 (0,5)	1,0-1,8 (1,4)	0,6-1,2 (1,0)	A1 короткие, едва достигают середины цефалоторакса	-	Длина шипа P5 значительно варьирует
D. galbinus*	2,9- 5,4 (3,7)	0,6- 1,8 (1,2)	1,3-1,9 (1,6)	0,8-1,2 (1,00)	1,4-2,0 (1,6)	1,6-3,0 (2,0)	1,1-1,8 (1,3)	A1 достигают заднего края цефалоторакса	2	Длина шипа P5 равна или немного меньше длины дистального сегмента P5
D. improcerus*	1,8- 4,1 (3,0)	1,0- 2,1 (1,6)	-	-	-	1,0-1,4 (1,2)	1,0-1,9 (1,35)	А1 короткие, обычно достигают середины цефалоторакса	1,6-2,3 (1,86)	Длина шипа P5 равна или немного меньше, больше длины дистального сегмента P5
MM3	2,63	1,67	1,93	1,00	1,17	1,43	1,29	0,78	0,90	0,68
MM2	2,35	1,39	1,81	-	1,14	1,54	0,83	-	1,15	-
BG14	1,86	1,71	1,82	1,04	0,93	1,21	1,18	0,92	0,84	1,13
BK21	2,50	1,49	2,20	-	1,16	1,28	1,17	0,73	0,98	0,77
F193	1,80	1,20	1,70	1,20	1,20	1,40	1,20	0,79	0,86	0,89
F191-3	2,37	1,57	1,64	1,05	1,18	1,43	1,22	0,77	1,59	1,54
F191-4	2,34	1,73	1,45	1,02	1,25	1,43	1,17	0,95	0,85	1,41
F156-3	1,40	1,69	1,83	-	0,72	1,38	1,05	0,77	0,98	0,81
F156-1	1,44	1,43	1,91	0,47	0,84	1,22	1,00	0,67	0,84	0,75
F120	2,60	1,60	1,90	0,94	1,33	1,46	1,12	0,71	0,98	0,71
F156-2	2,51	2,06	-	1,05	1,13	1,02	1,20	-	0,76	1,15
F96	3,08	1,68	1,73	0,91	1,22	1,57	1,20	0,73	0,77	1,01
F-130	2,70	1,56	1,54	1,10	0,94	1,15	1,32	0,66	2,10	0,80
D16	2,89	1,17	1,48	1,04	1,07	1,24	1,24	1,12	0,93	1,01
366	2,03	2,03	1,53	1,39	1,11	1,16	1,21	0,87	1,40	1,37
F112-5	3,41	1,72	1,59	1,25	1,01	1,27	1,26	0,81	1,16	0,70
F112-6	3,79	1,33	1,86	1,70	1,25	1,18	1,23	0,88	1,00	0,60
F112-3	3,25	1,80	-	1,62	0,87	1,08	1,15	0,79	1,18	0,80
F-107	3,57	-	-	-	0,97	1,14	1,41	-	0,99	1,00
F2	3,69	1,41	1,21	1,57	1,23	1,25	1,13	0,92	1,10	0,80
MM1	3,40	1,26	NA	0,95	1,62	2,16	1,26	0,98	1,14	0,52
BG15	3,45	1,82	1,68	1,00	1,36	1,99	1,19	0,94	1,26	0,51
F144	3,80	1,39	1,60	1,06	1,38	2,10	1,16	1,24	0,98	0,82
F116-1	5,82	0,94	1,53	-	1,83	1,90	1,23	1,23	0,98	0,60
F116-2	4,00	1,17	-	1,28	1,32	2,11	1,33	0,94	1,13	0,89
F136-1	3,76	1,96	1,71	0,81	1,36	2,23	1,33	-	1,20	0,81
F136-2	5,05	2,29	-	0,95	1,71	2,57	1,25	1,3	1,15	0,96
F135-1	3,78	1,75	-	-	1,00	2,50	1,25	1,2	1,56	0,75
F135-2	3,95	1,63	1,52	-	1,35	2,56	1,21	1,2	1,17	0,98

Примечание:

«*» – данные Г.Ф. Мазеповой (1978), в скобках даны средние значения

«-» – данные отсутствуют

 

3.2. Молекулярная филогения и делимитация видов

В ходе исследования молекулярные маркеры амплифицировали в одинаковых условиях для морфологически сходных особей, собранных в одном месте. Однако амплификация фрагментов ДНК различалась по специфичности и выходу продукта (Таблица 1) К примеру, из пяти особей (F193, F-191-1, F191-3, F191-4 и F191-5), собранных в одной пробе и близких по морфологии, только для трех особей были успешно амплифицированы молекулярные маркеры. В результате были определены 10, 35 и 21 нуклеотидных последовательностей для фрагментов генов 12S, ITS1 и COI соответственно (Таблица 1). Внутригеномный полиморфизм для ITS1 был отмечен для 10 особей. В шести нуклеотидных последовательностях двойные пики найдены в одном сайте (266, BG15, BK21, F116-1, F120 и F135-1), в трех нуклеотидных последовательностях (BG14, 369 и F130) – в двух сайтах, а у одной нуклеотидной последовательности (366) – в семи сайтах. Среди мутаций в сайтах с двойными пиками было 14 транзиций и 3 трансверсии. Позиции сайтов ITS1 с двойными пиками совпадали для разных образцов (BG14/366, BG14/BK21 и F116-1/266).

Три короткие ITS1 нуклеотидные последовательности (F96, F116-2 и F136-2) были депонированы в GenBank, но исключены из филогенетического анализа. Набор данных для филогенетического анализа составил 31 нуклеотидную последовательность с длиной общего выравнивания 461 п.н., 73 полиморфными сайтами и 69 парсимони-информативными сайтами. На филогенетическом древе по ITS1 (ML) нуклеотидные последовательности особей, близких по морфологии D. galbinus, D. improcerus и D. versutus сформировали три кластера: galbinus-группа, versutus-группа и improcerus-группа (Рис. 1). Каждый кластер содержит несколько генетических линий. В galbinus-группе выявлено четыре линии (I-IV), в versutus-группе – три линии (VI-VIII) и в improcerus-группе также три линии (IX-XI). Нуклеотидная последовательность F156-2 представляет отдельную линию (V), которая не входит ни в одну из трех групп.

 

Рис.1. (a) Карта-схема отбора проб (Таблица 1), цвет кругов совпадает с таковым на филогенетическом древе. (b) Филогенетическое древо, простроенное на основе ITS1 нуклеотидных последовательностей (ML, TN93 + G). Число в узле – значение бутстрэп поддержки. Римские цифры обозначают генетические линии. Круг рядом с нуклеотидной последовательностью отражает место сбора особи.

 

Нуклеотидные последовательности versutus-группы, F156-2 (V), D. konstantini, D. sp. (VIG2) и improcerus-группы сформировали отдельный большой кластер. Представители galbinus-группы генетически обособленны от данного кластера.

Набор данных по фрагменту COI с длиной общего выравнивания 693 п.н. и 57 парсимони-информативными сайтами, включал 22 нуклеотидные последовательности Diacyclops из озера Байкал, 11 нуклеотидных последовательностей трех видов bicuspidatus-группы из Польши и Кореи (D. bisetosus, D. crassicaudis и D. bicuspidatus) и 4 нуклеотидные последовательности D. sp. из Австралии. На COI филогенетическом древе нуклеотидные последовательности Diacyclops из озера Байкал формируют монофилетичную группу, которая генетически удалена от других представителей Diacyclops. Топологии древ по двум молекулярным маркером, COI и ITS1, согласуются. На COI древе также отдельно группируются последовательности versutus-, galbinus- и improcerus-групп, каждая из которых представлена несколькими генетическими линиями (Рис. 2)

 

Рис.2. (a) Карта-схема отбора проб (Таблица 1), цвет кругов совпадает с таковым на филогенетическом древе. (b) Филогенетическое древо, простроенное на основе COI нуклеотидных последовательностей (ML, GTR + G). Число в узле – значение бутстрэп поддержки. Римские цифры обозначают генетические линии. Прямоугольники рядом с деревом отражают «виды», идентифицированные методами ASAP, PTP, bPTP и GMYC. Круг рядом с нуклеотидной последовательностью отражает место сбора особи.

 

Две генетические линии versutus-group (VI, VIII) достоверно сестрински F156-2 (V) и D. konstantini и формируют вместе отдельный кластер. Нуклеотидные последовательности D. sp. (VIG), двух линий galbinus-группы (I, II) и двух линий improcerus-группы (IX, X) формируют три других отдельных кластера.

Методы делимитации видов ASAP и PTP при анализе набора данных COI для байкальских Diacyclops выделили 10 «видов». Результаты в целом согласуются с топологией древа по COI, однако представители I линии BG15 и 84, MM1 разделены на два «вида». Методы делимитации bPTP и GMYK идентифицировали в этом же наборе 11 «видов» и показали разные результаты при разделении versutus-группы. Метод bPTP выделил F156-1 (VI), F156-3 (VI) и VIII генетическую линию (MM2, MM3, BG14, F191-5, и BK21) как три отдельных вида. Метод GMYK выделил F156-1 (VI) и F156-3 (VI) как один «вид», но подразделил VIII генетическую линию на два «вида»: MM2/MM3 и BG14, F191-5, BK21.

В набор данных по 12S вошли 9 нуклеотидных последовательностей байкальских Diacyclops и 9 нуклеотидных последовательностей Diacyclops из Австралии, Японии и Украины. Общее выравнивание фрагмента дало 497 п.н., включая 186 полиморфных позиций и 162 парсимони-информативых позиций. На 12S, как и на COI древе, байкальские Diacyclops формируют монофилетичную группу. Эта группа вместе с нуклеотидными последовательностями bicuspidatus-группы, включающими D. bisetosus из Японии и D. bicuspidatus из Украины, входит в отдельный большой кластер (Рис. 3). Три эндемичных вида из Австралии, относящиеся к aticola-группе, D. scaloni, D. sobeprolatus и D. humphreysi, генетически удалены от этого кластера. Топологии древ по трем молекулярным маркерам согласуются для эндемичных байкальских Diacyclops. На древе по 12S представители I линии (BG15, MM1) galbinus-группы формируют дистантный кластер. Нуклеотидные последовательности D16 (X) и 369 (XI) improcerus-группы также формируют кластер, которому наиболее близки нуклеотидные последовательности D. sp. (VIG2).

 

Рис.3. Филогенетическое древо, построенное на основе 12S мтДНК (ML, HKY + G). Число в узле – значение бутстрэп поддержки. Римские цифры обозначают генетические линии.

 

3.3. Генетические дистанции

Полная длина первого транскрибируемого спейсера (ITS1) варьировала в диапазоне от 300 до 338 п.н. и была специфична для каждой генетической линии (Таблица 1), за исключением improcerus-группы, где длина ITS1 у линий XI и X была одинаковой - 314 п.н. Модель-скорректированные генетические дистанции (TN93+G) между ITS1 нуклеотидными последовательностями линий байкальских Diacyclops были близки таковым значениям p-дистанций и варьировали от 0,7% до 20,1% (Приложение, Таблица S1-S3). Максимальная генетическая дистанция между нуклеотидными последовательностями внутри линий составила 0,4%. Значения p-дистанций в наборе данных по COI между генетическими линиями байкальских Diacyclops варьировали от 9,1% до 20,9%. Самые большие генетические расстояния в пределах линий соответствовали 5,6% для I и 2% для II линий. По обоим молекулярным маркерам минимальные генетические дистанции между линиями показаны для versutus-группы. Они составили 0,7-1,6% для ITS1 и 9,1% для COI наборов данных. Генетические дистанции по ITS1 и COI среди линий galbinus-группы составили соответственно 3,5-4,0% и 17,7%. Среди линий improcerus-группы эти значения были схожи и составили 3,3-7,2% и 16,1% соответственно для ITS1 и COI данных. Максимальные генетические расстояния по ITS1 и COI были выявлены между линиями galbinus-группы и improcerus-группы и составили соответственно 12,2-20,1% и 20,1-20,9%. Генетические p-дистаници в наборе по12S между линиями байкальских Diacyclops варьировали от 11,8% до 23,1%. Наиболее близкие значения дистанций получены между X и XI линиями improcerus-группы. Наиболее дистантны между собой линии из разных групп: XI линия improcerus-группы и VIII линия versutus-группы (20,9%), VIII линия versutus-группы и I линия galbinus-группы (20,5%), X и XI линии improcerus-группы и I линия galbinus-группы (21,6% and 21,7 %).

3.4. Распространение генетических линий

Представители galbinus-, improcerus-, и versutus-групп распространены симпатрически (Рис. 1a). Особи D. konstantini, D. sp. (VIG2), VIII линии versutus-группы и XI линии improcerus-группы были собраны в районе пос. Большие Коты в разное время. Представители D. sp. (VIG2), VIII, I генетических линий были собраны в одной пробе в районе пос. Большое Голоустное (Таблица 1). Также в одной пробы мы находили представителей versutus-группы (F156-1, F156-3 - VI) и генетически близкой им V линии (F156-2); особей galbinus-группы (F112-7 - II) и improcerus-группы (XI) или представителей galbinus-группы (MM1 – I) и versutus-группы (MM2, MM3 - VIII).

В каждой группе мы обнаружили наиболее представленную генетическую линию, особи которой мы находили периодически в разных точках Байкала. Таковыми являются I линия galbinus-группы, XI линия improcerus-группы и VIII линия versutus-группы.

3.5. Морфометрический анализ

Метод главных компонент применяли к данным морфометрических индексов, полученных для 37 особей. Из них 9 особей принадлежали galbinus-группе, 12 особей - versutus-группе, 8 особей - improcerus-группе, 3 особи - D. konstantini и 5 особей D. sp. (VIG2) (BG2, BG4, BG5, D10, D12). Молекулярные данные были получены для большинства этих особей. По результатам анализа соответствий 8 морфометрических параметров, Tmi/Tme, Td/Te, Ti/Tmi, Ti/Tme, Ti/Td, LA1/Lcpht, Lтела и LseP5/LspP5, вместе объясняют 5% вариабельности первой оси (общая вариабельность - 25.6%) и были исключены из набор данных для дальнейшего анализа методом главных компонент (PCA). Более вариабельные параметры, такие как Lf/Wf, Te/Ti, Tl/Wf, Lenp3P4/Wenp3P4, IAS/EAS, расположение на каудальных ветвях Tl, IAS/Lenp3P4, IAS/Wenp3P4, Ti/Lf, Tl/Te, Ti/Td, Ti/Te, LP5/WP5, LspP5/LP5 и WP5/LspP5 были включены в анализ PCA. Первые две главных компоненты (PC1, PC2) объясняют 76,1% изменчивости морфометрических параметров. PC1 и PC2 объясняют 61,5% и 14,6% вариации. Первая главная компонента имеет сильную положительную корреляцию с пропорцией длины и ширины каудальных ветвей (Lf/Wf), менее сильную положительную корреляцию с пропорцией длины и ширины третьего эндоподита четвертой пары плавательных ног (Lenp3P4/Wenp3P4), пропорцией длины латеральной щетинки и ширины каудальных ветвей (Tl/Wf) и отрицательную корреляцию с пропорцией длин внешней и внутренней крайних апикальных щетинок (Te/Ti), а также с пропорцией длин внутреннего апикального шипа третьего эндоподита P4 и длины этого членика (IAS/Lenp3P4). Вторая главная компонента имеет сильную положительную корреляцию с пропорцией длины внутреннего апикального шипа третьего эндоподита P4 и ширины данного членика (IAS/Wenp3P4) и с пропорцией длины и ширины третьего эндоподита P4 (Lenp3P4/Wenp3P4), менее сильную положительную корреляцию с отношением длины и ширины дистального членика P5 (LP5/WP5) и отрицательную корреляцию с отношением длины апикального шипа P5 и длины дистального членика P5 (LspP5/LP5) (Рис. 4). Результаты PCA и молекулярной филогении согласуются в разделении генетически отдаленных видовых комплексов Diacyclops. Вдоль оси первой главной компоненты расположены D. konstantini и представители versutus-группы, тогда как представители galbinus- и improcerus-групп, с D. sp. (VIG2) расположены главным образом вдоль второй главной компоненты. Особи D. sp. (VIG2) наиболее близки к improcerus- и versutus-группам. Особи F130 (IX) improcerus-группы и F156-2 (V) перекрываются с особями versutus-группы. Особь F116-1 (I) galbinus-группы наиболее близка D. konstantini, чем к galbinus-группе. Метод главных компонент не позволяет ясно разделить все близкородственные генетические линии. Однако, особи F156-3 (VI) и F156-1 (VI) отличаются от других представителей versutus-группы наименьшей пропорцией длины и ширины каудальных ветвей и занимают крайнее положение вдоль PC1.

 

Рис.4. Результаты анализа главных компонент, примененного к байкальским Diacyclops на основе морфометрических индексов. Число означает номер особи. Зеленые стрелки показывают индексы и их вклад в первые две главные компоненты. Цвета овалов соответствуют цветам групп, отмеченных на филогенетических деревьях.

 

3.5. Морфологическое разнообразие versutus- и improcerus-групп

На рис. 5-7 приведены микрофотографии и рисунки P4 и антенны особей versutus- и improcerus-групп. Все проанализированные особи versutus-группы имеют вооружение третьего эндородита P4, состоящее из трех шипов и двух щетинок. Особи MM3 и BG14 генетически близки друг другу и относятся к VIII генетической линии. Они были идентифицированы как один «вид» методом ASAP и как два «вида» методом GMYC. Анализ микропризнаков показал, что эти особи отличаются в орнаментации каудальной стороны соединительной пластинки P4 (Рис. 5). У особей BG14 и F193 (VIII) данная пластинка без орнаментации, в то время, как у MM3 на ней имеются два ряда коротких шипов по центру и возле дистального края. У особи F156-3 (VI) соединительная пластинка P4 с каудальной стороны с двумя рядами коротких и длинных тонких шипов по центру и возле дистального края. Среди MM3 (VIII), F193 (VIII) и F156-3 (VI), последняя особь отличается самым большим числом щетинок и шипов на коксоподите P4. Особь F156-3 (VI) также отличается от F193 (VIII) числом щетинок на втором эндоподите антенны, который несет 9 щетинок в отличие от 8 гомологичных щетинок у F193. Базиподит A2 особи F156-3 (VI) несет два диагональных ряда шипов в центральной и проксимальной частях фронтальной поверхности, диагональный ряд шипов в проксимальнй части и ряд самых длинных шипов в средней части каудальной поверхности, два ряда длинных шипов вдоль боковых поверхностей и вооружен двумя короткими щетинками, одна из которых имеет сетулы и экзоподальной щетинкой с сетулами. Базиподит F193 (VIII) орнаментирован тремя рядами шипов на проксимальной и центральной частях каудальной поверхности и двумя рядами тонких шипов вдоль обеих боковых поверхностей и армирован двумя короткими щетинками, одна из которых несет сетулы, и голой экзоподальной щетинкой (Рис. 6)

 

Рис.5. КЛСМ микрофотографии (396, BG14) и рисунки каудальной поверхности P4, versutus-группы (VI, VIII), V генетической линии (F156-2) и D. konstantini (396). Арабские числа означают номер особи, римские числа – номер генетической линии. BG14 – P4, соединитиельная пластинка с каудальной стороны. Шкала: BG14, F156-2 = 20 µm; F156-3, MM3, F193, 396 = 10 µm.

 

Рис.6. КЛСМ микрофотографии и рисунки каудальной стороны антенны improcerus-группы (366, VIG2), V генетической линии (F156-2) и versutus-группы (F193, F156-2, F156-3). Арабские числа означают номер особи, римские числа – номер генетической линии. Шипы на фронтальной поверхности показаны пунктирной линией. Шкала: F193, F156-2, F156-3 = 10 µm; 366, VIG2 = 20 µm.

 

Рис.7. КЛСМ микрофотографии (a VIG2, b VIG2, 366) и рисунки каудальной стороны P4 improcerus-группы и D. sp (VIG2). Арабские числа означают номер особи, римские числа – номер генетической линии. b VIG2 – P4, коксоподит, соединительная пластинка с каудальной стороны. Шкала: F130 = 10 µm; a VIG2, b VIG2, D16, 366 = 50 µm.

 

Особи D. konstantini и F156-2 (V) генетически близки и отличаются от versutus-группы в вооружении Enp3P4. Они имеют два шипа и три щетинки. У особи F156-2 (V) соединительная пластинка P4 несет два ряда длинных шипов. Базиподит A2 особи F156-2 (V) орнаментирован двумя рядами шипов и группой мелких шипиков на каудальной поверхности, двумя рядами тонких шипов на проксимальной части фронтальной поверхности и тонкими шипами вдоль обеих боковых поверхностей и вооружен двумя голыми щетинками и экзоподальной щетинкой с сетулами (Рис. 5, 6). Второй эндоподит антенны несет семь щетинок.

Особи D16 (X), F130 (IX) и 366 (XI) принадлежат трем генетическим линиям improcerus-группы. D. sp (VIG2) генетически близок к ним. Особи D. sp (VIG2) и XI линии improcerus-группы несут на Enp3P4 два шипа и три щетинки. У особей D16 (X) и F130 (IX) этот членик вооружен тремя шипами и двумя щетинками. D. sp (VIG2) отличается от представителей improcerus-групп апикальным положением внутренней щетинки на Enp3P4, рядом с IAS (Рис. 7). У особей F130 (XI) и D. sp (VIG2) соединительная пластинка P4 орнаментирован двумя рядами шипов в средней части и вдоль дистальной поверхности. У особи 366 (XI) также имеются два ряда шипов на соединительной пластинке P4, однако они прерываются в средней части пластинки. Особь D16 (X) имеет соединительную пластинку P4 с двумя группами немногочисленных шипов. Базиподиты антенны D. sp (VIG2) и 366 (XI) в целом схожи и орнaментированы двумя рядами шипов на каудальной поверхности и рядом щетинок в проксимальной части боковой поверхности, однако у D. sp (VIG2) имеется больше шипов в каждом ряду (8 и 9), чем у особи 366 (XI) (Рис. 6).

4. Обсуждение

4.1. Три видовых комплекса, близких по морфологии к D. improcerus, D. galbinus и D. versutus

Хотя мы обнаружили образцы Diacyclops со сходной морфологией с тремя интересующими нас эндемичными видами D. improcerus, D. versutus и субэндемичным D. galbinus, нам не удалось идентифицировать их таксономически до уровня вида. Филогенетический анализ Diacyclops, основанный на двух мтДНК и одном ядерном молекулярных маркерах, выявил три кластера в соответствии с разделением особей на три группы по морфологическим признакам: improcerus-, galbinus- и versutus-группы. Каждая из них включает в себя несколько генетических линий. Мы предполагаем, что improcerus-, galbinus- и versutus-группы являются близкородственными комплексами видов. Существование этих комплексов, вероятно, объясняет значительные вариации диагностических признаков, которые приводятся в описании D. improcerus, D. versutus и D. galbinus.

Генетические расстояния между разными линиями galbinus- и improcerus-групп соответствуют известным межвидовым аналогичными значениям для этих молекулярных маркеров среди Copepoda в целом и Cyclopoida в частности (Zagoskin et al., 2014; Kochanova et al., 2021; Karanovic and Bláha, 2019; Sukhikh et al., 2020). Самыми близкими являются генетические линии versutus-группы. На первый взгляд выделение F120 (VII) в качестве отдельной от VIII линии, вызывает сомнения, но мы ее выделили пока с неясным таксономическим статусом опираясь также на отличающуюся от VIII линии общую длину ITS1 (330 / 333 п.н.). Общая длина ITS1 может быть видоспецифичным признаком, как показано для рода Culicoides (Diptera) (Li et al., 2003). Только в versutus-группе разные методы делимитации дали не согласованные результаты. GMYK метод разделил VIII генетическую линию на два вида на основе данных по COI. На древе по этому фрагменту нуклеотидные последовательности BG14, F191-5, BK21 генетически обособленны от ММ2, ММ3 и в то же время на ITS1 древе данной кластеризации нет. С одной стороны, известно, что метод GMYK может преувеличивать число «видов» (Pentinsaari et al., 2017; Luo et al., 2018). С другой стороны, мы отмечаем разный характер орнаментации соединительной пластинки P4 у MM3 и BG14, что вместе с орнаментацией базиподита антенны является таксономически важными признаками у циклопов и приводятся при их описании (Karanovic et al., 2013; Hołyńska et al., 2021). Линия VI (F156-1, F156-3) versutus-группы, по нашему мнению, может рассматриваться, как отдельный вид, так как имеет отличный характер микропризнаков базиподита антенны и соединительной пластинки P4, и по обоим молекулярным маркерам формирует отдельный кластер. Кроме того, особи F156-1, F156-3 отличаются от всех других особей в versutus-группе самым маленьким значением пропорции длины и ширины каудальных ветвей (Lf/Wf). Хотя этот признак, как отмечают для байкальских циклопов, варьирует на внутривидовом уровне и может быть не так таксономически важен, как в других родах циклопов, таких как Eucyclops к примеру (Rylov, 1948; Мазепова, 1978; Flössner, 1984). Тем не менее по результатам PCA анализа индекс Lf/Wf позволяет разграничить генетически сестринские D. konstantini и versutus-группу. Также можно использовать в идентификации особей VI линии такой качественный признак, как число щетинок на втором эндоподите антенны, по которому он отличается от VIII линии.

Мы предполагаем, что особь F156-2 (V) также принадлежит к отдельному новому виду, наиболее близкому versutus-группе. Хоть по результатам PCA на основе морфометрических индексов этот потенциально новый вид не отделяется от versutus-группы, тем не менее он имеет качественные отличия от ее представителей в арматуре третьего эндоподита и второго эндоподита антенны, орнаментации коксоподита P4 и базиподита антенны. Все три использованных метода делимитации видов, также выделяют F156-2 в отдельный вид, и его полная длина ITS1 (328 п.н.) отличается от таковых в versutus-группе.

Предполагаемые три вида improcerus-группы и генетически сестринского ей D. sp. (VIG2) перекрываются по результатам PCA, но ясно отличаются по обоим молекулярным маркерам, согласовано разграничиваются всеми используемыми методами делимитации видов и имеют отличия в орнаментации коксоподита P4. Они также имеют качественные отличия в арматуре P4, что для большинства копепод приводится как диагностический признак даже различных родов (Boxshall and Halsey, 2004).

Каранович нашел сходство в короткой пропорции каудальных ветвей у эндемичного D. ishidai Karanovic, Grygier & Lee, 2013, обитающего в интерстициали рядом с древним озером Бива и байкальскими видами D. improcerus, D. versutus. В то же время он отметил ряд количественных отличий этого вида от D. improcerus, D. versutus даже на основе доступного ограниченного набора известных морфологических характеристик для D. improcerus, D. versutus. Мы можем дополнить эти отличия качественными признаками. Только XI линия improcerus-группы имеет схожее вооружение третьего эндоподита P4 (3 щетинки и 2 шипа), остальные линии этой группы и versutus-группы (VI-IX) отличаются по данному признаку (2 щетинки и 3 шипа). Все определенные генетические линии, improcerus- и versutus-группы имеют экзоподальную щетинку на базиподите антенны, тогда как у D. ishidae она остутствует.

Большая часть особей из improcerus-группы, принадлежащие XI генетической линии, и часть особей galbinus-группы, принадлежащие I генетической линии, отличались от описаний D. improcerus и D. galbinus только меньшей пропорцией цефалоторокаса и остальных торакальных сегментов или более длиной антеннулой. Так как эти признаки состоят из телескопических сегментов, возможно, разная фиксация и хранение особей могли повлиять на точность их измерения, что также отмечается для Cyclopoida (Huys and Boxshall, 1991; Karanovic and Krajicek, 2012). Кроме того, мы вычисляли соотношение длины цефалоторакса к сумме длин 2-5 сегментов торакса, но не уверенны, что Г.Ф. Мазепова измеряла также, возможно, она использовала только длины 2-4 сегментов. Таким образом, возможно именно XI и I генетической линии представляют D. improcerus и D. galbinus. Полученные генетические и морфологические данные могут стать основой для интегративного переописания этих видов в будущем. Это особенно важно в условиях отсутствия типового материал для эндемичных циклопов D. improcerus, D. versutus и D. galbinus из озера Байкал.

Метод главных компонент с использованием морфометрических индексов, основанных на линейных измерениях, ограничен в разделении близких видов в пределах комплексов, хотя данные индексы широко используются в таксономии циклопов и указываются при описании видов. Возможно, более детальный морфометрический анализ позволит больше разграничить близкие виды в каждом из трех найденных комплексов, как было показано при разделении близких по морфологии видов из рода Acanthocyclops, считавшихся криптическими, (Karanovic and Bláha, 2019) или популяций гарпактикоиды Bryocamptus pygmaeus (G.O. Sars, 1863) (Novikov and Fefilova, 2021). Кроме того, мы уверенны, что при детальном морфологическом анализе будут найдены новые качественные признаки, которые будут отличать близкие виды. Мы обратили внимание на базиподит антенны и каудальную сторону P4 и нашли отличия у особей из разных генетических линий. Остаются еще не проанализированными большое число информативных характеристик на цефалотораксе, плавательных ногах, каудальных ветвях, как самок, так и самцов.

Таким образом, наши результаты показывают, что действительное разнообразие эндемичной фауны циклопов в озере Байкал выше, чем предполагалось ранее. Использование молекулярных методов позволило расширить понимание о видовом разнообразии таких ракообразных, как амфиподы, остракоды и гарпактикоиды, обитающих в озере Байкал, за счет обнаружения криптических видов (Schön et al., 2017; Väinölä and Kamaltynov, 1999). В нашем исследовании мы обнаружили виды циклопов, которые имеют генетические и морфологические отличия и могут быть идентифицированы по последним. Данная группа нуждается в интегративном тщательном переописании, наряду с описанием новых видов.

Представители разных генетических линий всех трех групп встречаются в одних пробах и относятся к симпатрическим видам. Наиболее близкими генетически и встречающиеся симпатрически являются сестринские V и VI линии. Г.Ф. Мазепова также обнаруживала в одной пробе D. galbinus, D. improcerus и D. versutus и отмечала их симпатрическое распространение. В каждой группе мы отметили по одной наиболее часто встречающейся генетической линии, особи которых мы периодически находили в разных местах. Интересно то, что особи этих наиболее представленных линий (I и XI) более других близки по морфологии к D. galbinus и D. improcerus, как отмечалось выше. Остальные генетические линии являются редкими и представлены одной двумя особями в нашем анализе. Возможно, обилие трех линий в данном исследовании связано с их обитанием на небольших глубинах начиная от уреза воды, откуда у нас была большая часть проб. Тогда как особи редких линий собраны с глубин от 10 до 30 м.

4.2. Филогения Diacyclops из озера Байкал

Несмотря на то, что род Diacyclops богат по видовому составу и на данный момент содержит более 100 видов, тем не менее генетические данные для этого рода остаются крайне ограниченными. Мы включили в анализ нуклеотидные последовательности не байкальских Diacyclops, и согласно обоим молекулярным маркерам байкальские Diacyclops формируют монофилетичную группу. Предыдущие исследования байкальских Diacyclops с использованием консервативного фрагмента 18S рРНК также показывали монофилетичность эндемичных видов Diacyclops из озера Байкал (Майор и др., 2010). С одной стороны, это может свидетельствовать об общей предковой форме для всех проанализированных байкальских Diacyclops, которая дивергировала и дала начало видовым комплексам, наблюдаемым сейчас. Данный сценарий возможен в связи с уникальностью Байкала, который миллионы лет оставался рифугиумом и центром видообразования для многих групп животных, в том числе ракообразных: амфипод, остракод и гарпактицид (Тимошкин, 2001; Schön et al., 2017; Moskalenko et al., 2020). А с другой стороны в нашем наборе данных присутствуют виды Diacyclops из разных морфологических групп (видовых комплексов) и только байкальские виды относятся к languidoides-группе. Существует мнение, что род Diacyclops – поли- или парафилетичный и выявленные морфологические группы могут представлять отдельные роды (Monchenko, 2000; Karanovic, 2006). Морфологические группы выделены на основе членистости плавательных ног и антеннул. На нашем древе по 12S включены последовательности видов из трех групп: languidoides-, bicuspidatus- и aticola-групп. Считается, что эволюция у Cyclopoida идет в сторону олигомеризации придатков. Таким образом bicuspidatus- и aticola-группы являются самыми «примитивными» группами, тогда как languidoides-группа является более эволюционно продвинутой и успешной, являясь одной из самых богатых по числу видов (Pesce, 1994; Monchenko and Klein, 1999). В нашем анализе languidoides- и aticola-группы представлены эндемичными видами из Байкала и Австралии, bicuspidatus-группа представлена палеарктическими видами. Виды из трех групп предсказуемо сформировали три монофилетичные группы и интересным оказалось то, что bicuspidatus- является сестринской и более генетически близкой languidoides-группе, чем к схожей по морфологии aticola-группе. Для полного понимания картины взаимоотношений видовых комплексов в пределах рода Diacyclops необходимо дополнительное исследование консервативных ядерных молекулярных фрагментов и включение представителей всех морфологических групп.

В пределах монофилетичной группы проанализированных байкальских эндемичных Diacyclops обнаружены два кластера сестринских таксонов. Первый кластер формируют D. sp. (VIG2) и комплекс видов improcerus-группы, второй кластер включает D. konstantini, V линию, и versutus-группу. Особи improcerus-группы принадлежат к Diacyclops с наименьшей длиной тела в данном исследовании и в целом среди байкальских Diacyclops являясь крупнее только трех эндемичных видов: литорального D. zhimulevi и интерстициальных D. biceri и D. eulithoralis. Возможно, уменьшение размеров тела влияет на экологический успех improcerus-группы и связан с адаптацией к питанию мелкими формами животных, водорослей или детритом. Известно, что некоторые мелкие литоральные и интерстициальные циклопиды относятся к группе собирателей. Они обследуют детрит, стебли водных растений и включают в питание эпифитные водоросли, простейших, трупы мелких беспозвоночных (Монаков, 1998). В.И. Монченко, используя род Diacyclops в качестве модельного объекта, показал, что в ходе морфолого-эволюционного развития Cyclopoida происходит уменьшение размеров тела и олигомеризация торакальных конечностей. При этом уменьшение размеров тела является ведущим процессом. Автор связывал оба процесса со значительно сокращающимися энергетическими затратами (Монченко, 2003).

Вероятно, первоначально предок improcerus-группы дивергировал симпатрически наряду с предками versutus- и galbinus-группы, в то время, как в дальнейшем в improcerus-группе могли происходить случаи и перипатрического видообразования. В нашем исследовании особь IX генетической линии improcerus-группы была найдена в географически том же месте и в одно время, что и часть особей XI линии, но с глубины 30 метров, тогда как особи XI линии были собраны с глубины 10 метров. Конечно, данное предположение о периптрическом видообразовании IX и XI линий требует дополнительной проверки.

Самыми относительно эволюционно молодыми среди рассматриваемых Diacyclops являются потенциальные виды versutus-группы. Они имеют наименьшие генетические расстояния по COI и ITS1. Для дальнейшего исследования данной группы целесообразно использовать более полиморфные генетические маркеры. Например, ген nad2 мтДНК, который у Copepoda имеет относительно более высокую скорость эволюции, чем COI (He et al., 2023). Данная группа характеризуется укороченными, утолщенными антеннулами, не достигающими заднего крася цефалоторакса, армированные большим числом щетинок и вооружением третьего эндоподита P4 тремя шипами и двумя щетинками. Г.Ф. Мазепова связывала наличие большого числа щетинок на антеннуле у D. versutus c его обитанием на мягких грунтах, в том числе илах. В наших сборах особи versutus-группы были собраны c разного типа субстратов в том числе и твердых: с песка, камней и камней с песком. Возможно, изменение морфологии антеннул и эндоподита P4 у предковой формы versutus-группы также привело к экологическому успеху, как и уменьшение тела у improcerus-группы, и связано с преимуществом в хищном питании. Можно также предположить, что дальнейшее видообразование в группе, было перипатрическое вдоль градиента глубин. Так как особи VIII генетической линии были обнаружены на минимальных глубинах до 1 метра, а особи VII и VI линий найдены на больших глубинах 10 и 15 метров.

Самой загадочной в исследованных Diacyclops является galbinus-группа. Во-первых, валидность вида D.galbinus вызывала вопросы после его описания. В.И. Монченко считал этот вид синонимом D. moravicus (Sterba, 1956), обитающего в карстовых водах Моравии (Monchenko, 1974). К сожалению, сиквенсов D. moravicus нет в базах данных, чтобы сравнить его с galbinus-группой. Во-вторых, это единственный вид из описанных эндемичных Diacyclops, который найден за пределами озера Байкал, в озере Шартлинское и является таким образом субэндемиком. Из бентосных байкальских копепод, обитающих в озере Байкал, известен также субэндемичный вид Harpacticella inopinata, встречающийся в реке Енисей. Молекулярное исследование этого вида из р. Енисей показало его относительно недавнее байкальское происхождение, вероятно, связанное с антропогенным вселением (Fefilova et al., 2023). Чтобы оценить пути расселения galbinus-группы необходимо провести анализ молекулярно-генетических данных из озера Шартлинское. И в-третьих, наше исследование показывает, что хоть galbinus-группа и входит в монофилетичную группу с остальными байкальскими Diacyclops, но тем не менее занимает дистантное положение. Можно предположить, что, дивергенция предковой формы galbinus-группы, произошла на относительно ранних этапах эволюции Cyclopoida в озере Байкал или, возможно, имела другую предковую форму Diacyclops, чем остальные анализируемые эндемичные Diacyclops. В нашем исследовании обнаружено наличие четырех генетических линий, среди особей, похожих по морфологии на D.galbinus. Возможно, каждая из них является потенциально новым видом.

Благодарности

Выражаем искреннюю благодарность коллегам из ЛИН СО РАН А.П. Федотову, Л.В. Сухановой, С.В. Усову, а также Е. Сафонову, А.Г. Лухневу за помощь в отборе материала. Мы также благодарны Е.Б. Фефиловой (Институт биологии Коми научного центра УО РАН), М. Холинска (Музей и Институт Польской Академии Наук) и Ю.П. Сапожниковой (ЛИН СО РАН) за их ценные консультации и помощь с переводом статьи. Работа выполнена в рамках темы государственного задания № 0279-2021-0005 (121032300224-8). Секвенирование на генетическом анализаторе Нанофор 05 (Синтол, Россия) и исследование на конфокальном лазерном сканирующем микроскопе выполнено в Приборном центре коллективного пользования физико-химического ультрамикроанализа ЛИН СО РАН (ЦКП «Ультрамикроанализ»).

Конфликт интересов

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Об авторах

Т. Ю. Майор

Лимнологический институт Сибирского Отделения Российской Академии Наук

Автор, ответственный за переписку.
Email: tatyanabfo@mail.ru
ORCID iD: 0000-0003-4425-1330
Россия, ул. Улан-Баторская, 3, Иркутск, 664033

И. Ю. Зайдыков

Лимнологический институт Сибирского Отделения Российской Академии Наук

Email: tatyanabfo@mail.ru
ORCID iD: 0000-0001-6669-682X
Россия, ул. Улан-Баторская, 3, Иркутск, 664033

С. В. Кирильчик

Лимнологический институт Сибирского Отделения Российской Академии Наук

Email: tatyanabfo@mail.ru
ORCID iD: 0000-0002-9997-6294
Россия, ул. Улан-Баторская, 3, Иркутск, 664033

Список литературы

Дополнительные файлы