Design, Molecular Docking, and Structure–Property Analysis of Novel Combretastatin A-4 Derivatives

Full Text

Введение

Злокачественные новообразования остаются одной из ведущих причин смертности во всем мире. Это обусловлено их фундаментальным свойством – неконтролируемой пролиферацией и нарушением регуляции клеточного цикла. Современная стратегия таргетной терапии, направленной на специфические молекулярные структуры опухолевых клеток, позволяет достичь избирательного подавления роста новообразований при снижении системной токсичности. Одним из наиболее перспективных направлений таргетного подхода является ингибирование полимеризации тубулина – структурного белка, формирующего микротрубочки, которые обеспечивают поддержание клеточной формы, внутриклеточный транспорт и процесс митоза [1].

Нарушение динамической нестабильности микротрубочек приводит к остановке клеточного цикла и индукции апоптоза, что подтверждает тубулин как высоковалидную мишень для противоопухолевых препаратов [2]. К числу классических ингибиторов микротрубочек относятся паклитаксел, винкристин и колхицин, связывающиеся с различными сайтами β-тубулина (таксановым, винка-алкалоидным и колхициновым соответственно). Особый интерес вызывают соединения, взаимодействующие с колхициновым сайтом, поскольку они способны преодолевать множественную лекарственную устойчивость [3].

Целью работы является выявление соединений с высокой аффинностью к колхициновому сайту β-тубулина, представляющих интерес для дальнейшего синтеза и биологической оценки.

 

Обзор литературы

Одним из наиболее изученных ингибиторов этого типа выступает комбретастатин A-4 (CA-4) (1) – природный стильбеноид, выделенный из Combretum caffrum¹. Связываясь с колхициновым сайтом β-тубулина, соединение (1) индуцирует деполимеризацию микротрубочек, проявляя выраженную антимитотическую и антиваскулярную активность [4]. Простая структура и высокая цитотоксичность обусловили использование (1) как ведущего фармакофора для разработки новых антимитотических соединений. Исследования в области «структура–активность» (Specific Absorption Rate, SAR) показали, что для реализации активности критически важны: 3,4,5-триметоксифенильный фрагмент (кольцо A), цис-конфигурация ароматических колец относительно этиленового моста и 3-гидрокси-4-метокси-заместитель в фенильном кольце B [5].

Однако клиническое применение (1) ограничено его низкой биодоступностью, вызванной изомеризацией активной цис-формы в термодинамически стабильную, но малоактивную транс-форму in vivo. Для устранения данного недостатка предложены структурные модификации, включающие замену этиленового моста изостерными циклическими или гетероциклическими фрагментами (триазольными [6], оксазольными [7], изоксазольными [8] и др.), что предотвращает изомеризацию и повышает противоопухолевую активность.

Важным инструментом рационального дизайна аналогов CA-4 является молекулярный докинг, позволяющий моделировать пространственную ориентацию лигандов в активном сайте белка, оценивать энергию связывания и выявлять ключевые межмолекулярные взаимодействия.

 

Материалы и методы

Молекулярное моделирование выполнено для серии аналогов комбретастатина, в которых варьировались: количество и положение гидроксильных и метоксильных заместителей на бензольных или пиридиновых кольцах; природа центрального фрагмента, соединяющего арильные кольца – цис-алкеновая связь, циклопропановое или оксадиазольное кольцо.

Исследование направлено на дизайн и молекулярный докинг новых производных CA-4, основанных на стильбазольных структурах — аналогах цис-ресвератрола (2), где этиленовый мост заменён изостерными циклическими фрагментами (3,4) (рисунок 1).

 

Рис. 1. Структурные формулы исследуемых соединений

Fig. 1. Structural formulas of the researched compounds

_{Источник: материалы рисунков и таблиц подготовлены авторами по итогам исследования}

_{Source: the materials of the figures and tables were prepared by the authors based on the results of the study}

 

Все структуры были подготовлены в формате SMILES и конвертированы в трехмерные модели с использованием пакета Schrödinger Suite 2023-4. Расчеты проводились на рабочей станции под управлением операционной системы Windows 11 Pro версии 25Н2 с процессором AMD Ryzen 7 PRO 8845HS, объемом оперативной памяти 16 Гб и графическим ускорителем Radeon 780M Graphics. Геометрия соединений оптимизировалась в модуле LigPrep с учетом протонирования при pH 7,0 ± 0,5 и стандартных параметров силового поля OPLS4.

В процессе подготовки генерировались все возможные стереоизомеры для хиральных центров, стереохимия которых не была явно задана во входных структурах, а также учитывалось образование возможных таутомеров. Молекулярный докинг выполнялся в программном комплексе Glide² (модуль Schrödinger Maestro) [9]. В качестве рецептора использована кристаллографическая структура комплекса тубулина с комбретастатином A-4 (PDB ID 5LYJ) [10]. Белковая структура была подготовлена с помощью Protein Preparation Wizard (реализовались оптимизация цепей, удаление воды, добавление отсутствующих атомов боковых цепей, минимизация при OPLS4). Минимизация проводилась с критерием сходимости по среднеквадратичному отклонению (Root–Mean–Square Deviation, RMSD) 0,30 Å. Сетка докинга центрировалась по положению исходного лиганда (1) с размером 20×20×20 Å, включающим весь гидрофобный карман β-тубулина. Докинг осуществлялся в режиме жесткого рецептора.

Режимом для докинга был выбран Standard Precision (SP). Для каждой молекулы сохранялось по пять лучших конформеров, ранжированных по суммарному значению GlideScore и DockingScore. В качестве эталонного значения использовались результаты для комбретастатина (1) из того же расчета: GlideScore = − 8,888.

Для выявления зависимостей «структура–свойство» были вычислены простые дескрипторы:

– количество гидроксильных и метоксильных групп;

– наличие C=C-связей между sp²-центрами;

– наличие циклопропановых фрагментов;

– наличие 1,2,5-оксадиазольных колец.

Статистический анализ проводился с использованием Python (библиотеки Pandas, Scikit-learn, Matplotlib). Корреляционный анализ реализовывался с расчетом коэффициента корреляции Пирсона. Полученные p-значения корректировались для учета множественного сравнения с помощью метода Бенджамини-Хохберга (False Discovery Rate, FDR). Перед проведением анализа главных компонентов (Principle Component Analysis, PCA) исходные данные были стандартизированы путем вычитания среднего и масштабирования до единичной дисперсии (StandardScaler). Первые два главных компонента объясняют 81 % (PC1 = 58 %, PC2 = 23 %) общей дисперсии данных. ADME характеристики рассчитывались с использованием ресурса ADMETlab [11].

Результаты исследования

В проанализированной серии присутствовали соединения с варьирующимся числом кислородсодержащих заместителей (от 1 до 5). Значения GlideScore находились в диапазоне от − 9,68 до – 8,26 ккал/моль, что сопоставимо и в ряде случаев превосходит результаты для эталонного комбретастатина (− 8,888 ккал/моль). Из 96 рассмотренных соединений 7 молекул продемонстрировали лучшие (более отрицательные) значения GlideScore, чем комбретастатин (табл.1). Это указывает на сохранение и возможное улучшение ключевых взаимодействий в активном сайте при определенных модификациях.

 

Таблица 1. Результаты расчетов

Table 1. Calculation results

Соединение / Compound	GlideScore, ккал/моль / GlideScore, kcal/mol	M, г/моль / M, g/mol	Log Po/w	Log S	TPSA, Å2
2ж	– 9,675	229,07	2,03	– 2,43	73,58
2и	– 9,393	229,07	2,17	– 3,05	73,58
3д	– 9,103	243,09	1,93	– 2,84	73,58
2к	– 9,027	245,07	1,71	– 2,61	93,81
2в	– 8,981	213,08	2,66	– 3,36	53,35
3к	– 8,954	259,08	1,62	– 2,08	93,81
3б	– 8,939	227,09	2,30	– 2,76	53,35
2е	– 8,866	229,07	2,13	– 2,69	73,58
2д	– 8,822	229,07	2,00	– 2,71	73,58
4в	– 8,820	255,06	2,54	– 3,56	92,27
1	− 8,888	316,35	2,87	– 3,83	57,15

 

Кроме того, для указанных соединений были рассчитаны основные ADME характеристики. Большинство соединений, представленных в таблице 1, имеют умеренную липофильность, среднюю растворимость и среднюю площадь полярной поверхности, что соответствует приемлемым ADME характеристикам для удовлетворительной пероральной биодоступности.

На рисунке 2 представлено расположение в сайте связывания соединений каждого ряда, показавших лучшую аффинность.

 

 

Анализ взаимодействия комбретастатина A-4 и его аналогов с тубулином показал, что все соединения связываются в колхициновом сайте и сохраняют ключевые фармакофорные взаимодействия. При этом для рассматриваемых производных фиксируются дополнительные контакты в форме водородных связей, что может обеспечивать повышенную аффинность связывания. Таким образом, аналоги являются эффективными биоизостерными заменами исходного соединения, демонстрируя перспективный профиль взаимодействий для дальнейшей структурной оптимизации в качестве ингибиторов полимеризации тубулина.

Корреляционный анализ выявил взаимосвязь между структурными особенностями молекул и энергией связывания. Полученные результаты согласуются с литературными данными, подчеркивающими критическую важность метокси-групп, особенно в 3,4,5-положениях кольца А, для взаимодействия с колхициновым сайтом. Гидроксильные группы также показали умеренную положительную корреляцию, что говорит об их способности формировать дополнительные водородные связи, однако их избыток может увеличивать полярность молекулы, потенциально ухудшая связывание с преимущественно гидрофобным карманом.

Замена цис-алкенового моста на циклопропановое кольцо не ухудшала энергию связывания. Одно из лучших значений GlideScore (− 9,10 ккал/моль) наблюдалось именно для циклопропанового аналога с двумя гидроксильными группами в орто- и мета-положениях. Это подтверждает возможность использования циклопропана как пространственного биоизостера цис-двойной связи, сохраняющего оптимальную ориентацию арильных колец. Данный подход активно используется для стабилизации биоактивной конформации и улучшения фармакокинетических свойств.

В то же время замена на оксадиазольное звено ухудшала показатели, вероятно, вследствие нарушения планарности системы и дестабилизации взаимодействий с аминокислотными остатками в активном кармане. Тем не менее, некоторые исследования показывают, что правильная функционализация гетероциклических линкеров может компенсировать этот эффект и привести к высокоактивным соединениям.

Наилучшее соединение в серии (2ж) показало GlideScore = − 9,675 ккал/моль, что на 0,787 ккал/моль лучше эталонного комбретастатина. Эта структура сохраняет цис-конфигурацию и содержит по одной гидроксильной группе на каждом арильном кольце, что обеспечивает симметричное взаимодействие с белком. Таким образом, минимальная модификация, не нарушающая геометрию и распределение доноров/акцепторов, может улучшить связывание.

Иерархическая кластеризация (Ward linkage) выделила три устойчивых кластера, различающиеся как по типу мостика, так и по числу донорных групп. Средние значения GlideScore для этих кластеров представлены в таблице 2.

 

Таблица 2. Средние значения GlideScore по типу мостика, ккал/моль

Table 2. Average GlideScore values by bridge type, kcal/mol

Тип мостика / Bridge type	Среднее ± SD / Mean ± SD	Медиана / Median	Характерные признаки / Characteristic features
Цис-C=C / Cis-C=C	– 8,54 ± 0,27	– 8,53	Сохранённое π-сопряжение / Saved π-conjugation
Циклопропан / Cyclopropane	– 8,21 ± 0,33	– 8,20	Умеренно жёсткая цис-геометрия, потеря сопряжения / Moderately rigid cis geometry, loss of coupling
Оксадиазол / Oxadiazole	– 7,98 ± 0,31	– 8,00	Гетероциклический изостер, более выраженное искажение геометрии / Heterocyclic isostere, more pronounced distortion of geometry

 

Анализ показал, что сохранение цис-C=C-моста обеспечивает наилучшее пространственное связывание и наивысшую аффинность. Циклопропановый мостик является приемлемой заменой, сохраняя цис-ориентацию с умеренной потерей эффективности связывания. Оксадиазольные производные образуют отдельный кластер с наихудшими показателями, что указывает на необходимость дальнейшей оптимизации их структуры.

Обсуждение и заключение

Комплексный анализ методом молекулярного докинга серии новых аналогов комбретастатина A-4 позволил выявить ключевые зависимости «структура–аффинность»:

Наличие метоксильных групп отрицательно коррелирует со значением GlideScore, внося основной вклад в аффинность за счет гидрофобных взаимодействий с сайтом связывания.

Гидроксильные группы также демонстрируют благоприятную, хотя и более слабую, отрицательную корреляцию, выступая в роли доноров водородных связей, однако их избыток может быть не оптимальным.

Наилучшие показатели наблюдаются для соединений с цис-C=C-мостиком (GlideScore ≈ – 8,5 ккал/моль), что подчеркивает важность сохранения планарности и π-сопряжения.

Замещение C=C на циклопропановый фрагмент является перспективной стратегией стабилизации цис-конформации и приводит к получению соединений с сопоставимой аффинностью (GlideScore ≈ – 8,2 ккал/моль).

Оксадиазольные аналоги в среднем демонстрируют худшие показатели связывания (GlideScore ≈ – 8,0 ккал/моль) и требуют направленной оптимизации геометрии и заместителей.

Таким образом, стратегия изостерной модификации молекулярного каркаса за счет введения циклопропанового фрагмента является обоснованной и позволяет получить перспективные соединения, не уступающие эталону по энергии связывания. Несколько соединений из исследованной серии, в частности сохраняющие цис-алкеновый мостик и содержащие комбинацию гидрокси- и метокси-заместителей, продемонстрировали значения GlideScore, превосходящие комбретастатин A-4.

Основным ограничением настоящего исследования является узкий выбор предлагаемых модификаций двойной связи, а также предсказательный характер результатов, требующий экспериментальной проверки in vitro. В дальнейшем планируется расширить ряд исследуемых соединений за счет включения других гетероциклических и карбоциклических изостеров, а также провести молекулярно-динамическое моделирование для оценки стабильности комплексов лиганд-белок. Кроме того, перспективным направлением представляется изучение влияния полярности и стерических факторов на проницаемость клеточных мембран и метаболическую стабильность предложенных кандидатов.

Полученные результаты имеют практическую ценность для исследователей, занимающихся разработкой противоопухолевых препаратов таргетного действия. Выявленные закономерности «структура–аффинность» и отобранные соединения-кандидаты могут быть использованы для планирования синтеза новых перспективных ингибиторов тубулина и последующего изучения их биологической активности in vitro и in vivo.

 

 

Дополнительная информация

Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Вклад авторов:

А. В. Семенов – научное руководство; создание и подготовка рукописи.

О. И. Балакирева – создание и подготовка рукописи; редактирование.

А. С. Агальцова – осуществление научно-исследовательского процесса.

С. М. Афанасьев – осуществление научно-исследовательского процесса.

 

¹ Pettit G.R., Singh S.B., Hamel E., Lin C. M., Alberts D. S., Garcia-Kendal D. Isolation and Structure of the Strong Cell Growth and Tubulin Inhibitor Combretastatin A-4. Experientia. 1989;45:209–211. https://doi.org/10.1007/BF01954881

² Friesner R.A., Banks J.L., Murphy R.B. [et al.] Glide: A New Approach for Rapid, Accurate Docking and Scoring. 1. Method and Assessment of Docking Accuracy. Journal of Medicinal Chemistry. 2004;47(7):1739–1749. https://doi.org/10.1021/jm0306430

About the authors

Aleksandr V. Semenov

National Research Mordovia State University

Email: salexan@mail.ru
ORCID iD: 0000-0001-7671-7110
SPIN-code: 7081-3122
Scopus Author ID: 7402499001
ResearcherId: AAK-3379-2021

Associate Professor, Cand. Sci. (Chem.), Associate Professor, Chair of Fundamental Chemistry and Chemical Engineering

Russian Federation, 68 Bolshevistskaya St., Saransk, 430005

Olga I. Balakireva

National Research Mordovia State University

Author for correspondence.
Email: olja.balakireva@mail.ru
ORCID iD: 0009-0009-2822-9927
SPIN-code: 4680-4771
Scopus Author ID: 57192097505

Cand. Sci. (Chem.), Senior Lecturer at the Chair of Fundamental Chemistry and Chemical Engineering

Russian Federation, 68 Bolshevistskaya St., Saransk, 430005

Alina S. Agaltsova

National Research Mordovia State University

Email: as617as@yandex.ru
ORCID iD: 0009-0001-1540-0627

Student at the Institute of Science-Intensive Technologies and New Materials 

Russian Federation, 68 Bolshevistskaya St., Saransk, 430005

Stefan M. Afanasev

National Research Mordovia State University

Email: StefanQw@yandex.ru
ORCID iD: 0009-0002-4144-1067
SPIN-code: 1822-7255

Student at the Institute of Science-Intensive Technologies and New Materials

Russian Federation, 68 Bolshevistskaya str., Saransk, 430005

References

Supplementary files