РАЗРАБОТКА И ВАЛИДАЦИЯ МЕТОДИКИ КОЛИЧЕСТВЕННОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ КАРОТИНОИДОВ И ХЛОРОФИЛЛОВ В ЛИСТЬЯХ ОБЛЕПИХИ КРУШИНОВИДНОЙ

Полный текст

Введение Облепиха крушиновидная - ценное лекарственное растение, плоды которого богаты каротиноидами, витаминами и используются для получения облепихового масла пищевого и фармацевтического назначения. Препараты на его основе (суппозитории, ректокапсулы, масло для приема внутрь и наружного применения) применяются в качестве средств, ускоряющих репаративные процессы при раневых повреждениях, а также при язве желудка и двенадцатиперстной кишки, геморроидальных трещинах. Помимо плодов, заготовке также подлежат и листья облепихи с целью получения экстракта, содержащего полифенольный комплекс, для производства противовирусного препарата «Гипорамин» [12, 17]. Богатый химический состав обуславливает широкий спектр фармакологической активности, среди которых выделяют противовирусную, противовоспалительную, антиоксидантную и адаптогенную активности. Ряд российских и зарубежных исследователей активно занимаются изучением возможных видов активности экстрактов из листьев облепихи (спиртовые, водно-спиртовые, водные) [6, 10, 18-21]. Следует отметить, что, согласно литературным данным, экстракты показывают отличные результаты в оценке токсичности при исследованиях in vivo. При оценке цитотоксичности водного экстракта из листьев облепихи установлено, что в концентрации 25-400 г/мл не обнаружено цитотоксического влияния на обработанные клетки. При оценке острой токсичности в дозе 5 г/кг массы тела животного не отмечено смерти или ухудшения состояния ни одного из животных. С целью оценки кожной токсичности водный экстракт вводили в дозе 1 г/кг/сут в течение 28 дней, в результате чего не выявлено существенных изменений в массе тела животных, биохимических показателях крови, а также гистологических изменений [22]. Листья облепихи крушиновидной являются перспективным лекарственных растительным (ЛРС) сырьём благодаря богатому составу биологически активных веществ (БАВ), включающему такие соединения как, флавоноиды, дубильные вещества, органические, полиненасыщенные жирные кислоты и аминокислоты, витамины (А, С, Е). Флавоноиды в листьях представлены лютеолином, рутином, изорамнетином, нарциссином, стриктинином; дубильные вещества представлены гидролизуемыми танинами (галловая кислота, катехин, эпикатехин); жирные кислоты - линолевая, линоленовая; а среди аминокислот основными являются лизин, глутаминовая кислота, аргинин, пролин и др., в том числе незаменимые [1-2, 4, 8, 11, 14-16]. В то же время состав и содержание липофильной фракции БАВ в листьях (каротиноидов и хлорофиллов) изучено мало. Однако, следует учитывать, что активно изучаемые на предмет выявления различных видов фармакологической активности спирто-водные извлечения из листьев характеризуются многокомпонентным составом БАВ (в т.ч. присутствуют каротиноиды и хлорофиллы), а следовательно, и комплексным характером действия. Поэтому всестороннее изучение химического состава БАВ ЛРС является актуальной задачей. Подводя итог вышеописанному, листья облепихи крушиновидной являются ценным и перспективным ЛРС с целью разработки лекарственных растительных препаратов (ЛРП) с различной фармакологической активностью и низкой токсичностью. Цель исследования - разработать и валидировать спектрофотометрическую методику количественного определения каротиноидов и хлорофиллов в листьях облепихи крушиновидной. Методика Объект исследования - заготовленные на территории Воронежской области в 2022 году и высушенные воздушно-теневым способом до остаточной влажности не более 10% листья облепихи крушиновидной трёх фаз развития (I - фаза завязывания плодов, II - фаза единичного созревания плодов, III - фаза массового созревания плодов). За основу была взята методика прямого спектрофотометрического определения хлорофиллов, каротиноидов и гидроксикоричных кислот в листьях крапивы двудомной, основанная на извлечении БАВ из сырья подходящим растворителем и измерении оптической плотности на спектрофотометре СФ-2000 в максимумах поглощения при длинах волн 442±2 нм (каротиноиды) и 667±3 нм (хлорофиллы) [13]. Валидация методики проведена в соответствии с ОФС «Валидация аналитических методик» ГФ РФ XIV издания [3]. Статистическая обработка результатов проведена в Microsoft Excel 2016. Результаты исследования и их обсуждение На начальном этапе методом ТСХ было установлено наличие в листьях облепихи каротиноидов и хлорофиллов. Идентифицированы такие соединения, как феофитин, ксантофиллы, хлорофилл b, хлорофилл а и β-каротин [7]. Электронные спектры (рис. 1) поглощения измеряли на спектрофотометре СФ-2000 (РФ, ОКБ «Спектр», СПб) в кварцевых кюветах с толщиной поглощающего слоя 10 мм в диапазоне волн 400-800 нм. При изучении спектральных характеристик извлечений из листьев облепихи крушиновидной наблюдали основные максимумы поглощения в области 455±5 нм, характерные для каротиноидов (γ-каротин и другие фракции), и 667±3 нм, свойственные для хлорофилла. Рис. 1. Спектр поглощения спиртового извлечения из листьев облепихи крушиновидной На начальном этапе нами осуществлён подбор степени измельчения листьев облепихи при экстракции спиртом этиловым 96% в течение 30 минут однократно. Согласно полученным результатам, наибольший выход каротиноидов и хлорофиллов отмечен для сырья со степенью измельчения 0,5-1,0 мм (табл. 1). Несмотря на максимальный выход этих соединений при степени измельчения 0,2 мм, использование данной фракции нецелесообразно в связи с необходимостью двух-трёхкратного фильтрования мутных извлечений. Даже в этом случае частицы сырья попадают в фильтрат, что приводит к увеличению значений оптической плотности и, как следствие, завышенным результатам содержания определяемых БАВ. Таблица 1. Влияние степени измельчения листьев на выход каротиноидов и хлорофиллов в извлечение Фракции измельченного сырья, мм Содержание каротиноидов, % Содержание хлорофиллов, % 3,0-2,0 0,021±0,00002 0,067±0,0002 2,0-1,0 0,039±0,00004 0,118±0,0004 1,0-0,5 0,047±0,00005 0,141±0,0005 0,5-0,2 0,044±0,00005 0,149±0,0041 Менее 0,2 0,050±0,00005 0,159±0,0005 На следующем этапе разработки методики провели выбор экстрагента, который позволяет получить максимальный выход каротиноидов и хлорофиллов из сырья. Экстракцию осуществляли спиртом этиловым в концентрации 70 и 96% согласно рекомендациям литературы [13]. Установлено, что положения максимумов менялось незначительно, а наибольшее значение оптической плотности извлечения наблюдалось при использовании спирта этилового в концентрации 96%, что соответствует максимальному выходу хлорофиллов и каротиноидов (табл. 2). Таблица 2. Влияние экстрагента на выход хлорофиллов и каротиноидов из листьев облепихи Экстрагент Максимум поглощения каротиноидов, хлорофиллов нм Выход каротиноидов, % Выход хлорофиллов, % Спирт этиловый 70% 460±5 665±5 0,042±0,00005 0,102±0,0003 Спирт этиловый 96% 460±5 665±5 0,047±0,00005 0,141±0,0005 При выборе оптимального времени экстракции (рис. 2) были проанализированы пробы, собранные в 5 точках: после 30, 45, 60, 90 и 120 мин нагревания на водяной бане с обратным холодильником. В результате было установлено, что с увеличением длительности экстракции выход хлорофиллов и каротиноидов возрастал, достигая максимума при 45 мин., и далее снижался, выходя на плато после 60 мин. Рис. 2. Влияние времени экстракции на содержание каротиноидов и хлорофиллов в извлечении Для установления полноты экстракции каротиноидов и хлорофиллов из листьев облепихи крушиновидной изучали влияние соотношения сырье-экстрагент (табл. 3). В результате установлено, что с увеличением объема экстрагента наблюдалось возрастание выхода каротиноидов и хлорофиллов и при соотношении 1:200 выход был максимальным (0,053% - каротиноиды, 0,167% - хлорофиллы). Дальнейшее увеличение объёма экстрагента является нецелесообразным, т.к. приведет к значительному удорожанию стоимости единицы продукции в связи с большим расходом экстрагента, не приводя к значительному росту выхода анализируемых БАВ. Таблица 3. Влияние соотношения сырье-экстрагент на извлечение флавоноидов из листьев облепихи Соотношение сырье-экстрагент Содержание каротиноидов, % % увеличения выхода БАВ Содержание хлорофиллов, % % увеличения выхода БАВ 1:25 0,027±0,00003 100 0,087±0,0003 100 1:50 0,036±0,00004 +33,33 0,113±0,0004 +29,89 1:100 0,042±0,00005 +16,70 0,134±0,0004 +18,58 1:150 0,050±0,00005 +19,05 0,163±0,0005 +21,64 1:200 0,053±0,00006 +6,0 0,167±0,0006 +2,45 При определении содержания каротиноидов и хлорофиллов в листьях облепихи крушиновидной различных фаз развития (табл. 4) установлено, что наиболее богатой данными соединениями является фаза массового созревания плодов (III). Таблица 4. Содержание каротиноидов и хлорофиллов в листьях облепихи крушиновидной различных фаз вегетации Фенологическая фаза Фенофаза I Фенофаза II Фенофаза III Содержание каротиноидов, % 0,050±0,0001 0,043±0,00005 0,070±0,00008 Содержание хлорофиллов, % 0,163±0,0005 0,123±0,0004 0,179±0,0006 На заключительном этапе осуществляли варьирование кратностью экстракции (одно-, двух- и трёхкратная экстракция). Результаты представлены в табл. 5. Согласно полученным данным, наибольший выход каротиноидов и хлорофиллов отмечен при двукратной экстракции. Таблица 5. Влияние кратности экстракции на выход БАВ в извлечение Кратность Содержание каротиноидов, % Содержание хлорофиллов, % 1 0,053±0,00006 0,167±0,0006 2 0,054±0,00006 0,177±0,0006 3 0,048±0,00005 0,159±0,0005 Большинство методик по определению БАВ в ЛРС предлагают использовать в качестве фильтрующего материала бумажный фильтр. С целью выявления влияния способа фильтрования проведена сравнительная оценка содержания каротиноидов и хлорофиллов в извлечениях при фильтрации через бумажный фильтр и через марлю (10 слоёв) (табл. 6). Установлено, что при использовании бумажного фильтра процесс более длителен (фильтрация одной порции при двукратной экстракции осуществляется 40-50 минут). При использовании марли наблюдается большее содержание БАВ в извлечениях (примерно на 30%). Предположительно, это объясняется тем, что в порах бумажного фильтра задерживаются балластные вещества высокомолекулярной структуры (слизи, полисахариды и др.), забивая поры и сорбирую на своей поверхности молекулы каротиноидов и хлорофиллов. На основании этого использование марли в качестве фильтрующего материала целесообразно. Таблица 6. Влияние фильтрующего материала на выход БАВ в извлечение Кратность Содержание каротиноидов, % Содержание хлорофиллов, % Бумажный фильтр 0,054±0,00006 0,177±0,0006 Марля (10 слоёв) 0,096±0,0001 0,228±0,0008 Методика количественного определения: около 1,0 г (точная навеска) высушенных и измельчённых листьев до размера частиц, проходящих сквозь сито с диаметром отверстий 1 мм помещали в коническую колбу вместимостью 250 мл, заливали 100 мл спирта этилового 70%об., взвешивали и в течение 45 минут проводили кипячение на водяной бане с обратным холодильником. По истечении времени колбу с экстрактом быстро охлаждали, доводили объём растворителя по массе до первоначального значения и фильтровали через 10 слоёв марли. Экстракцию повторяли второй порцией растворителя. Фильтраты объединяли в мерной колбе вместимостью 200 мл и доводили до метки тем же растворителем (раствор А). 10 мл раствора А помещали в мерную колбу вместимостью 25 мл и доводили до метки тем же этанолом (раствор Б). Оптическую плотность раствора Б измеряли на спектрофотометре СФ-2000 (Россия, СПб, ОКБ «Спектр») при длинах волн 460±5 нм, характерных для каротиноидов, и 665±5 нм, характерных для хлорофиллов, в кювете с толщиной слоя 10 мм относительно растворителя (спирт этиловый 70%об.). Содержание суммы каротиноидов (в пересчёте на β-каротин) и суммы хлорофиллов (в пересчёте на хлорофилл а) в процентах (Х) в пересчёте на абсолютно сухое сырьё рассчитывали по формулам (1 и 2, соответственно): (1) (2) , где А - оптическая плотность раствора Б в соответствующем максимуме поглощения; m - масса сырья, г; В - потеря в массе при высушивании сырья, %; Е1см1% - удельный показатель поглощения (2500 для β-каротин при 450±5 нм; 944,5 для хлорофилла при 663±5 нм); W1 и W2 - объёмы мерных колб, использованных для разведения, мл; Va - объём аликвоты, взятый на анализ, мл. Проведена метрологическая оценка разработанной методики. Относительная ошибка единичного определения составляет 3,54% для хлорофиллов и 2,74% для каротиноидов (с доверительной вероятностью 95%), что свидетельствует о нахождении в пределах средней ошибки (до 5%) (табл. 7). Таблица 7. Метрологическая характеристика методики определения каротиноидов (1) и хлорофиллов (2) (Р=95%; n=7) БАВ xср S2 S Sxcp ∆x ∆xcp ε, % εср, % 1 0,0957 0,00000115 0,00107 0,000404 0,00262 0,00099 2,738 1,034 2 0,228 0,0000108 0,00329 0,00124 0,00806 0,00304 3,535 1,333 Так как валидация является обязательным завершающим этапом разработки методики количественного определения, нами выполнена оценка методики по следующим критериям: прецизионность на уровне сходимости, предел обнаружения, предел количественного определения, линейность, аналитическая область методики, специфичность. Специфичность методики оценивали по совпадению положения максимумов на спектрах поглощения индивидуальных хлорофиллов, каротиноидов (литературные данные) и исследуемого извлечения (рис. 1). Для хлорофилла a характерен узкий максимум поглощения, расположенный при 662 нм, а для β-каротина - широкий пологий максимум с плечом в диапазоне 450-455 нм [9]. Рис. 3. График линейности методики Линейность определяли на восьми уровнях концентраций. График, уравнение линейности и коэффициент аппроксимации представлены на рис. 3. Так как R2 и по определению каротиноидов, и по определению хлорофиллов более 0,99, можно сделать вывод, что область линейности методики находится в диапазоне концентраций от 0,55 до 7,74×10-5 г/мл (каротиноиды) и от 1,32 до 18,45×10-5 г/мл (хлорофиллы). Предел обнаружения - 0,55 и 1,32×10-5 г/мл каротиноидов и хлорофиллов данной методикой, соответственно. Аналитическая область методики составляет 80-120% от номинальной величины (3,32-5,55×10-5 г/мл для каротиноидов и 7,91-13,18×10-5 г/мл для хлорофиллов). Предел количественного обнаружения каротиноидов по данной методике составляет 5,55×10-5 г/мл, хлорофиллов - 15,81×10-5 г/млПрецизионность оценивали на уровне сходимости путём получения семи независимых результатов в одной и той же лаборатории, одним и тем же исследователем по одной и той же методике с использованием того же оборудования за короткий промежуток времени. Результаты, полученные при статистической обработке, достоверны при доверительной вероятности 95% и свидетельствуют о прецизионности методики в условиях повторяемости (табл. 8). Таблица 8. Прецизионность методики определения каротиноидов и хлорофиллов (Р=95%; n=7) Каротиноиды Хлорофиллы Проба Оптическая плотность Содержание, % Проба Оптическая плотность Содержание, % 1 0,4497 0,0972 1 0,4058 0,232 2 0,4480 0,0969 2 0,4064 0,233 3 0,4440 0,0960 3 0,3978 0,228 4 0,4363 0,0943 4 0,3948 0,226 5 0,4408 0,0953 5 0,3976 0,228 6 0,4401 0,0951 6 0,3952 0,226 7 0,4390 0,0949 7 0,3915 0,224 Наименьшее значение, % = 0,0943 Наибольшее значение, % = 0,0972 Среднее значение, % = 0,0957 Доверительный интервал (Р=95%), % = 0,0957±0,00262 Стандартное отклонение, % = 0,107 Коэффициент вариации, % = 1,118 Наименьшее значение, % = 0,224 Наибольшее значение, % = 0,233 Среднее значение, % = 0,228 Доверительный интервал (Р=95%), % = 0,228±0,00806 Стандартное отклонение, % = 0,329 Коэффициент вариации, % = 1,443 В результате проведенных исследований в качестве критерия качества сырья по показателю «Количественное определение» можно предложить регламентировать содержание суммы каротиноидов, в пересчёте на β-каротин не менее 0,08% (80 мг%) и содержание суммы хлорофиллов - не менее 0,2%. Для оценки перспективности листьев облепихи крушиновидной в качестве источника данных групп БАВ, интересным представлялось сравнить полученные экспериментальные результаты по содержанию каротиноидов и хлорофиллов в образцах листьев с литературными данными [5] по другим фармакопейным представителям лекарственных растений (табл. 9). Таблица 9. Литературные данные по содержанию каротиноидов и хлорофиллов в образцах листьев других фармакопейных представителей лекарственных растений № Название вида Содержание хлорофиллов, % Содержание каротиноидов, % 1 Tanacetum achilleifolium (M. Bieb.) Sch. Bip. 0,652 0,108 2 Thymus marschallianus Willd. 0,584 0,104 3 Potentilla glaucescens Schltdl. 0,581 0,078 4 Salvia stepposa Des.- Shost. 0,469 0,119 5 Artemisia austriaca Jacq. 0,512 0,079 6 Centaurea turgaica Klok. 0,520 0,062 7 Fragaria viridis (Duchesne) Weston 0,450 0,111 Заключение Таким образом, разработана и валидирована методика количественного определения суммы каротиноидов (в пересчёте на β-каротин) и хлорофиллов методом спектрофотометрии в листьях облепихи крушиновидной, которая может быть использована для стандартизации данного ЛРС. В результате исследований установлено, что оптимальной степенью измельчения, при которой наблюдается максимальный выход каротиноидов и хлорофиллов из сырья, является фракция 0,5-1,0 мм, экстракцию рекомендовано проводить спиртом этиловым 70%об. при соотношении сырьё: экстрагент 1:200 мл в течение 45 минут двухкратно. Наибольшее содержание определяемых соединений наблюдается в листьях фенологической фазы III (период заготовки - конец августа - начало сентября). Разработанная методика валидна и пригодна для спектрофотометрического определения каротиноидов и хлорофиллов в листьях облепихи крушиновидной. Рекомендуемый срок заготовки листьев по содержанию изучаемых групп БАВ, в целом, совпадает со сроками сбора плодов, так как последние являются широко востребованным фармакопейным ЛРС. Листья на данном этапе развития могут быть использованы как самостоятельное ЛРС для получения ЛРП.

Об авторах

Наталья Александровна Ковалёва

Воронежский государственный университет

Email: email@example.com
аспирант, преподаватель кафедры фармацевтической химии и фармацевтической технологии ФГБОУ ВО «Воронежский государственный университет» Россия, 394018, Воронеж, Университетская пл., 1

Ольга Валерьевна Тринеева

Воронежский государственный университет

Email: email@example.com
доктор фармацевтических наук, доцент, профессор кафедры фармацевтической химии и фармацевтической технологии ФГБОУ ВО «Воронежский государственный университет» Россия, 394018, Воронеж, Университетская пл., 1

Анастасия Игоревна Колотнева

Воронежский государственный университет

Email: email@example.com
студентка фармацевтического факультета ФГБОУ ВО «Воронежский государственный университет» Россия, 394018, Воронеж, Университетская пл., 1

Список литературы

Дополнительные файлы