ФАРМАКОЛОГИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ СИРОПА АЗОКСИМЕРА БРОМИДА

Полный текст

Введение Азоксимера бромид относится к классу водорастворимых производных гетероцепных алифатических полиаминов. Данный класс соединений не имеет аналогов как по структуре, так и по свойствам. Наличие в основной цепи макромолекулы третичного атома азота открывает практически неограниченные возможности получения модификатов с широким спектром физико-химических, физиологических и фармакологических свойств [1, 3, 5]. Варьирование химического строения гетероцепного полиамина, а также химического строения модифицирующих агентов и степени модификации полиамина позволяет регулировать в широких пределах указанные выше свойства [4, 6]. Азоксимера бромид обладает многоцелевым терапевтическим действием: иммуномодулирующим, дезинтоксикационным, антиоксидантным и мембранопротекторным эффектами. При этом молекула препарата не имеет чужеродной антигенной нагрузки [2]. В настоящее время доступны три лекарственные формы препарата: лиофилизат для приготовления раствора для инъекций и местного применения, суппозитории и таблетки. Наличие корригированной жидкой лекарственной формы, в том числе сиропа - не выявлено. Цель исследования - изучить фармакологическую активность азоксимера бромида в составе разработанного авторами лекарственного сиропа в сравнении с таблетированной лекарственной формой азоксимера бромида на модели дексаметазоновой иммуносупрессии. Методика Работа выполнена на 40 беспородных крысах самцах c массой 250-300 грамм (n=10 каждая группа). Животные были получены из питомника лабораторных животных «Рапполово» (Ленинградская обл.). Перед непосредственным проведением эксперимента животные помещались в карантинное отделение на 14 дней. Во время исследования животные содержались в контролируемых условиях вивария при температуре воздуха 22±20С, относительной влажности 60±5% и 12-ти часовой смене суточного цикла в макролоновых клетках по 5 особей. Доступ к корму и воде не ограничивали. Биометодология и содержание животных соответствовали международным этическим нормам обращения с лабораторными животными (Directive 2010/63 / EU of the European Parliament and of the council on the protection of animals used for scientific purposes, September 22, 2010).Для создания модели иммуносупрессии применяли дексаметазон (АО «ПФК Обновление», Россия) в дозе 40 мг/кг в течении 5 суток внутрибрюшинно [7]. Тестируемый препарат 0,1% сироп азоксимера бромида и препарат сравнения таблетки азоксимера бромида вводили интрагастрально через зонд на 6-е сутки с момента введения дексаметазона в течении 7 дней. Для определения экспериментальной дозы использовали максимальную суточную дозу препаратов на основе азоксимера бромида, рекомендуемую для клинического применения 12 мг/кг (на человека) и 2 мг/кг (на крысу с учетом коэффициента пересчета - 6) («НПО Петровакс Фарм», Россия) [8]. Исследуемый препарат вводили из расчёта 0,4 мл сиропа на крысу массой 200 грамм. Препарат сравнения вводили из расчёта 0,4 мг на крысу массой 200 грамм в виде водной суспензии приготовленной на воде очищенной с содержанием действующего вещества 1,2 мг/мл. На 14-й день эксперимента под хлоралгидратным наркозом (внутрибрюшинно в дозе 300 мг/кг) проводили декапитацию животных. Использовали кристаллический порошок хлоралгидрата 98,5% (Jersey, USA:1-800-ACROS-01), который предварительно растворяли в воде очищенной из расчёта 120 мг/мл раствора, что составило 0,5 мл на крысу массой 200 грамм. При манипуляциях с лабораторными животными руководствовались Решением Совета Евразийской экономической комиссии от 03.11.2016 №81 «Об утверждении Правил надлежащей лабораторной практики Евразийского экономического союза в сфере обращения ЛС». Для исследования осуществляли забор венозной крови из правой половины сердца (пункцию сердца осуществляли при помощи вакуумных пробирок BD Vacutainer), извлекали органы: тимус, селезенку, надпочечники. Кровь анализировали на гематологическом анализаторе «MindrayBC-2800Vet». Извлеченные органы взвешивали, фиксировали в 10%-ном нейтральном формалине и заливали парафином. Срезы органов и тканей были изготовлены с помощью санного микротома (окраска гематоксилин-эозином). Морфометрическое исследование проводилось с использованием инструментов программного обеспечения "LeicaApplicationSuite". Результаты исследования и их обсуждение Результаты по изучению картины крови. Глюкокортикоиды оказывают выраженное воздействие на кроветворные органы, в частности на созревание и жизнедеятельность клеточных элементов кроветворной системы и крови. Введение глюкокортикоидных препаратов в организм приводит к инволюции тимуса и лимфатической ткани, понижению количества лимфоцитов в периферической крови. Это является следствием снижения их выработки и повышенным распадом на периферии [9]. Дексаметазоновая модель иммуносупрессии вызывает снижение уровня лимфоцитов, моноцитов с одновременным развитием лейкоцитоза за счет повышения гранулоцитов. Влияние 7-ми дневного применения 0,1% сиропа азоксимера бромида на картину крови крыс с дексаметазоновой иммуносупрессией (медиана Me; нижний и верхний квартили [Q1; Q2.]) представлен в табл. 1. Таблица 1. Результаты исследования влияния 7-ми дневного применения 0,1% сиропа азоксимера бромида на картину крови крыс с дексаметазоновой иммуносупрессией Показатели Интактные Контроль Сироп азоксимера бромида 0,1% Таблетки азоксимера бромида Лейкоциты, 109/л 9,9 [9, 1; 11, 9] 18,0 [16, 5; 25, 4] p1<0,05 12,1 [11, 2; 14, 7] p1<0,05, p2<0,05 14,1 [12.2; 15,2] p1<0,05, p2<0,05 Лимфоциты,% 43,55 [27, 9; 43, 8] 21,45 [16, 8; 25, 4] p1<0,05 45,55 [31, 7; 45, 8] p1>0,05, p2<0,05 29,5 [26.9; 35,1] p1>0,05, p2<0,05 Гранулоциты,% 54,45 [49, 2; 66, 2] 96,60 [84, 7; 99, 2] p1<0,05 68,55 [64, 2; 80, 3] p1<0,05, p2<0,05 68,05 [60; 69, 7] p1<0,05, p2<0,05 Моноциты,% 2,45 [2, 1; 2, 9] 1,95 [1, 6; 2, 3] p1<0,05 2,3 [2, 1; 2, 7] p1>0,05, p2<0,05 2,7 [2, 3; 2, 9] p1>0,05, p2<0,05 Эритроциты,1012/л 8,27 [8, 03; 8, 6] 8,55 [8, 25; 8, 93] 8,40 [8, 05; 8, 71] 7,53 [7, 23; 8, 03] p1<0,05, p1<0,05 Гемоглобин, г/л 160,5 [151, 0; 167, 0] 164,5 [157, 0; 173, 0] 161,5 [156, 0; 167, 0] 143,5 [137, 0; 149, 0] Тромбоциты,109/л 625,0 [594, 0; 689, 0] 652,0±77,0 [625; 702] 636,5±64,0 [625, 0; 689, 0] 572,0 [247, 0; 648, 0] Примечание: р1- уровень статистической значимости по отношению к интактным животным; р2- уровень статистической значимости по отношению к группе контроля Из приведенных данных видно, что у животных контрольной группы на фоне введения дексаметазона на 82% достоверно повышается уровень лейкоцитов, на 51% снижается содержание лимфоцитов и на 20% моноцитов, при этом содержание гранулоцитов достоверно выше на 77% по сравнению с группой интактных животных. В группе животных с дексаметазоновой моделью и леченных сиропом азоксимера бромида 0,1% лейкоцитоз менее выражен, содержание лейкоцитов повышалось на 22% относительно интактной группы и на 33% снижалось относительно контрольной группы. Лимфоцитопения не развивалась, отличия не достоверны относительно значений интактной группы крыс. Содержание моноцитов снижалось на 6% по отношению к интактной группе и на 17% повышалось по отношению к показателем контрольной группы крыс. Содержание гранулоцитов на 26% выше показателей интактной группы и 29% меньше чем в контрольной группе. В группе крыс, получавших препарат сравнения - таблетки азоксимера бромида, показатели крови были сопоставимы с результатами группы исследуемой лекарственной формы сироп азоксимера бромида 0,1%. Содержание лейкоцитов повышалось на 38% относительно интактной группы и на 32% снижалось относительно контрольной группы. Содержание лимфоцитов повышалось на 37% относительно контрольной группы, моноцитопения не проявлялась (отличия не достоверны относительно интактной группы). Гранулоцитоз менее выражен, содержание гранулоцитов увеличивалось на 25% относительно интактной группы и на 30% меньше чем в контрольной группе. Результаты по изучению органов иммунной системы. При воздействии факторов, подавляющих иммунные реакции в органах иммунной системы возможно развитие гипотрофии и гипоплазии, с уменьшением объема клеток и межклеточных структур и дальнейшем развитием атрофии органа. Результаты исследования влияния 7-ми дневного применения 0,1% сиропа азоксимера бромида на массу и весовые индексы отдельных органов крыс с дексаметазоновой иммуносупрессией (медиана Me; нижний и верхний квартили [Q1; Q2]) представлены в табл. 2. Таблица 2. Результаты исследования влияния 7-ми дневного применения 0,1% сиропа азоксимера бромида на массу и весовые индексы отдельных органов крыс с дексаметазоновой иммуносупрессией Группа Селезенка Тимус Правый надпочечник Левый надпочечник Интактные (масса органа, г индекс массы, %) 1,0286 [0, 795; 1, 350] 0,264 [0, 25; 0, 30] 0,014 [0, 012; 0, 017] 0,017 [0, 012; 0, 019] 0,366 [0, 324; 0, 466] 0,099 [0, 086; 0, 105] 0,051 [0, 0046; 0, 0064] 0,0633 [0, 0045; 0, 0071] Контроль (масса органа, г индекс массы, %) 1,0425 [0, 9; 1, 108] 0,172 [0, 155; 0, 212], p1<0,05 0,0130 [0, 011; 0, 019] 0,0140 [0, 012; 0, 018] 0,3736 [0, 3422; 0, 41699] 0,0647 [0, 0572; 0, 0779] 0,00474 [0, 0039; 0, 00699] 0,00517 [0, 0045; 0, 0073] Сироп азоксимера бромида 0,1% (масса органа, г индекс массы, %) 0,76 [0, 712; 0, 90] 0,231 [0, 215; 0, 249] 0,017 [0, 015; 0, 028] 0,021 [0, 015; 0, 028] 0,366 [0, 336; 0, 443] 0,108 [0, 100; 0, 117] 0,0813 [0, 0074; 0, 0126] 0,0096 [0, 0075; 0, 0122] Таблетки азоксимера бромида (масса органа, г индекс массы, %) 1,0335 [0, 951; 1, 117] 0,278 [0, 218; 0, 3] 0,037 [0, 028; 0, 037] 0,037 [0, 028; 0, 037] 0,4785 [0, 419; 0, 589] 0,1249 [0, 092; 0, 1572] 0,0162 [0, 0089; 0, 0210] 0,0162 [0, 0089; 0, 0210] Примечание: р1- уровень статистической значимости по отношению к интактным животным Изучение массы и весовых индексов селезенки, тимуса и надпочечников у животных с дексаметазоновой иммуносупрессией достоверных отличий с интактной группой крыс не выявило. Исключение составили данные по массе тимуса в контрольной группе, зафиксировано достоверное уменьшение массы данного органа на 35% относительно интактной группы крыс (p1<0,05). Результаты по изучению гистологической картины тимуса, селезенки и надпочечников. На гистологических срезах селезенки интактной группы крыс отчетливо просматриваются все анатомо-морфологические структуры. Селезенка покрыта капсулой, плотно прилегающей к поверхности паренхимы органа. От нее внутрь идут трабекулы в различных направлениях. Синусоиды красной пульпы спавшиеся, так как в процессе приготовления и фиксации препарата селезенка не была специально растянута. Сосуды селезенки умеренно наполнены кровью. Фолликулы белой пульпы в виде округлых и овальных образований разбросаны среди ткани красной пульпы и достаточно четко отграничены. Средний размер фолликулов белой пульпы составляет 3,43±0,17 отн. ед., представлен на рис. 1А. В группе контрольных крыс картина гистологических срезов в целом напоминала описанную выше. Наблюдалось уменьшение среднего размера фолликулов белой пульпы до 2,82±0,15 отн. ед, что может свидетельствовать о снижении активности иммунологических реакций лимфоцитов, представлен на рис. 1Б. Рис. 1. Селезенка интактной крысы (А), крысы контрольной группы (Б) (×40, окуляр К7х) В группе крыс с дексаметазоновой иммуносупрессией на фоне применения сиропа азоксимера бромида 0,1%, картина гистологических срезов в целом приближалась к интактной группе. Значительных изменений размеров фолликулов белой пульпы не наблюдалось. Морфометрическое исследование показало, что средний размер фолликулов белой пульпы составил 3,02±0,14 отн. ед., представлен на рис. 2А. Рис. 2. Селезенка крыс, получавших 0,1% сиропа азоксимера бромида (А), получавших азоксимера бромид (полиоксидоний) таблетки (Б) (×40, окуляр К7х) В группе животных, получавших в качестве лечения таблетки азоксимера бромида, гистологическая картина селезенки в целом напоминала вышеописанную. Средний размер фолликулов белой пульпы составил 3,17±0,16 отн. Ед., представлен на рис. 2Б. На гистологических срезах тимуса интактных крыс хорошо различимы корковый и мозговой слой долек. В наружном субкапсулярном слое различимы более крупные клетки-лимфобласты. В корковом слое определялись отростчатые эпителиальные клетки (клетки-кормилицы), окруженные большим количеством малых лимфоцитов. В мозговом слое также присутствовали эпителиальные отростчатые клетки, окруженные лимфоцитами средних размеров, а также тельца Гассаля, представлены на рис. 3А. На гистологических срезах тимуса животных контрольнойгруппы наблюдалось выраженное дольчатое строение. В каждой дольке различаются корковый и мозговой слои. Корковый слой окрашен более интенсивно базофильными красителями. Мозговой слой светлый, более эозинофильный. В мозговом веществе определяются специфические для тимуса слоистые эпителиальные образования - тельца Гассаля, клеточная плотность незначительно снижена, представлена на рис. 3Б. Рис. 3. Гистологический срез тимуса интактных крыс (А), контрольной группы крыс Б) (×40, окуляр К7х) На гистологических срезах тимуса животных из группы, получавшей сироп азоксимера бромида 0,1%, гистологическая картина аналогична группе интактных крыс. Тимус имеет дольчатое строение. В каждой дольке отчетливо различаются корковый и мозговой слой. Корковый слой окрашен более интенсивно базофильными красителями. Мозговой слой светлый, более эозинофилен. Дольки отграничены друг от друга соединительнотканными прослойками. Как в корковом, так и в мозговом веществе определяются крупные эпителиальные клетки отростчатой формы, вокруг которых располагаются ассоциированные с ними лимфоциты различной степени зрелости. В корковом слое располагаются преимущественно малые лимфоциты, а в мозговом средних размеров. В мозговом веществе определяются специфические для тимуса слоистые эпителиальные образования-тельца Гассаля, представлены на рис. 4А. На гистологических срезах тимуса животных из группы, получавшей таблетки азоксимера бромида гистологическая картина аналогична вышеописанной, представлена на рис. 4Б. Рис. 4. Гистологический срез тимуса крысы из группы, получавшей сироп азоксимера бромида 0,1% (А), крысы из группы, получавшей таблетки азоксимера бромида (Б) (×40, окуляр К7х) На гистологических срезах интактной группы хорошо различимы капсула надпочечников, клубочковая, пучковая и сетчатая зона коры, хромафинные клетки мозгового вещества. Окраска зон равномерная по всем полям. Капсула плотно прилегает к пучковой зоне по всей поверхности. Клетки клубочковой зоны формируют округлые скопления. В клетках содержится не большое количество липидов. Клетки пучковой и сетчатой зоны более крупные, плотно прилегают друг к другу, располагаются радиальными пучками от цента к периферии. В цитоплазме клеток большое количество липидов. Тяжи клеток перемежаются с капиллярами и тонкими веретенообразными эндотелиоцитами. Мозговое вещество представлено крупными клетками округлой формы, между которыми располагаются сосуды. Полости сосудов содержат эритроциты. Цитоплазма клеток мозгового вещества заполнена плотными мелкими гранулами. Различаются светлые и темные клетки. Ядра округлой формы расположены в центральной зоне цитоплазмы, представлены на рис. 5А. Гистологическая картина срезов надпочечников в группе контрольных животных сохранена. На срезах все зоны хорошо различимы. В цитоплазме клеток клубочковой зоны небольшое содержание липидов. Ядра располагаются в центральной зоне цитоплазмы. Размеры клеток во всех зонах коры надпочечников и мозгового слоя соответствуют размеру клеток в контроле. В клетках пучковой и сетчатой зоны содержится большое количество липидных капель. Клетки мозгового вещества более крупные. Различаются темные и светлые клетки. Патологических изменений не обнаружено, представлены на рис. 5Б. Рис. 5. Гистологический срез надпочечника интактной крысы (А), контрольной группы крыс (×40, окуляр К7х) На гистологичесих срезах надпочечников группы животных получавших сироп азоксимера бромида 0,1% все слои коркового вещества надпочечников ясно различимы. Клетки клубочкового, пучкового и сетчатого слоев плотно прилегают друг к другу. В клетках пучковой и сетчатой зоны содержится большое количество липидных капель. Признаков воспалительных, дистрофических, некротических, склеротических и других патологических процессов не обнаружено, представлено на рис. 6А. На гистологических срезах надпочечников группы, получавшей таблетки азоксимера бромида гистологическая картина аналогична вышеописанной, патологический изменений не выявлено, представлена на рис. 6Б. Рис. 6. Гистологический срез надпочечника крысы из группы, получавшей сироп азоксимера бромида 0,1% (А), из группы, получавшей таблетки азоксимера бромида (Б) (×40, окуляр К7х) Заключение Исследования показали, что при моделировании дексаметазоновой иммуносупрессии наблюдались изменения со стороны картины крови, которые проявлялись лейкоцитозом, за счет значительного повышения зернистых лейкоцитов, а также лимфоцито- и моноцитопенией. Терапевтическое введение азоксимера бромида в составе сиропа в дозе 2 мг/кг веса животного в течение 7 дней способствовало улучшению показателей крови, приближая их к значениям интактной группы (группа биологического контроля). Эффекты, полученные при введении сиропа азоксимера бромида 0,1% в дозе 2 мг/кг сопоставимы с эффектами от введения азоксимера бромида в составе таблетированной лекарственной формы в дозе 2 мг/кг. Гистологические исследования тимуса, селезенки и надпочечников животных из групп тестируемых лекарственных форм патологических изменений не выявили. Однако, в контрольной группе было установлено достоверное, относительно интактной группы, снижение массы и незначительное снижение клеточной плотности в тимусе. Полученные данные указывают, что лекарственная форма «сироп азоксимера бромида 0,1%» в дозе 2 мг/кг обладает иммуномодулирующим действием на модели дексаметазоновой иммуносупрессии, сопоставимым с действием лекарственной формы «таблетки азоксимера бромида 12мг» в дозе 2 мг/кг.

Об авторах

Магомед-Эми Хусейнович Хамидов

Пятигорский медико-фармацевтический институт - филиал ФГБОУ ВО ВолгГМУ

Email: email@example.com
соискатель кафедры фармацевтической технологии с курсом медицинской биотехнологии Пятигорского медико-фармацевтического института - филиала ФГБОУ ВО «Волгоградский государственный медицинский университет» Минздрава России Россия, 357532, Пятигорск, проспект Калинина, 11

Марина Алексеевна Огай

Пятигорский медико-фармацевтический институт - филиал ФГБОУ ВО ВолгГМУ

Email: email@example.com
доктор фармацевтических наук, профессор кафедры фармацевтической технологии с курсом медицинской биотехнологии Пятигорского медико-фармацевтического института - филиала ФГБОУ ВО «Волгоградский государственный медицинский университет» Минздрава России Россия, 357532, Пятигорск, проспект Калинина, 11

Светлана Олеговна Лосенкова

Смоленский государственный медицинский университет

Email: email@example.com
доктор фармацевтических наук, доцент, заведующая кафедрой фармацевтической технологии ФГБОУ ВО «Смоленский государственный медицинский университет» Минздрава России Россия, 214019, Смоленск, ул. Крупской, 28

Ирина Леонидовна Абисалова

Пятигорский медико-фармацевтический институт - филиал ФГБОУ ВО ВолгГМУ

Email: email@example.com
кандидат фармацевтических наук, заведующая кафедрой патологии Пятигорского медико-фармацевтического института - филиала ФГБОУ ВО «Волгоградский государственный медицинский университет» Минздрава России Россия, 357532, Пятигорск, проспект Калинина, 11

Список литературы

Дополнительные файлы