Разработка и валидация метода скрининга ингибиторов инфламмасомы NLRP3 на первичных макрофагах мышей C57bl/6j

Полный текст

Инфламмасомы можно определить как высокомолекулярные белковые олигомеры, образующиеся в ответ на различные паттерны, и, являющиеся важными сигнальными молекулами врожденного иммунного ответа [1]. В настоящее время NLRP3 является наиболее распространенной и изученной инфламмасомой из-за ее набора активаторов и аберрантной активации в ряде воспалительных заболеваний [2]. Канонический путь активации инфламмасомы NLRP3 является каспаза-1-зависимым, в результате которого увеличивается уровень транскрипции неактивных предшественников про-ИЛ-1β, про-ИЛ-18 и прокаспазы-11. Вторичный воспалительный сигнал запускает формирование инфламмасомы. Неканонический путь активации инфламмасомы NLRP3 запускается внутриклеточным бактериальным липополисахаридом (ЛПС) и активирует другие каспазы, такие как каспаза-11.

В отличие от других сенсорных белков, NLRP3 может распознавать множество различных факторов, обусловленных не только патогеном, но и окружающей средой или хозяином, поэтому умеренная активация инфламмасомы NLRP3 повышает защиту организма от бактерий, вирусов и паразитов, а аномальная активация инфламмасомы NLRP3 считается инициатором при различных заболеваниях человека, таких как метаболический синдром, сахарный диабет 2-го типа, подагра, атеросклероз и нейродегенеративные заболевания [1, 3].

В частности, длительная активация инфламмасомы NLRP3 в макрофагах, инфильтрирующих жировую ткань, приводит к метаболическому воспалению, которое еще больше усиливает воспалительную среду в чувствительных к инсулину тканях [4].

Также было обнаружено, что инфламмасома NLRP3 играет важную роль в различных физиологических патологических процессах, в том числе, связана с некоторыми возрастными заболеваниями: развитием резистентности к инсулину, болезни Альцгеймера, Паркинсона, старением сердечно-сосудистой системы, потерей слуха и зрения [5].

Известны молекулы, которые действуют как ингибиторы воспаления NLRP3, что достигается путем ингибирования АТФ-чувствительных калиевых каналов (Глибурид), ингибирования активации каспазы-1 (Партенолид), ингибирования активности АТФазы NLRP3 (Партенолид, Bay 11-7082, производное акриламида), ингибирования высвобождения ИЛ-1β (MCC950) и ингибирования АТФ-рецептора P2X7 (AZD9056) [6].

ЦЕЛЬ РАБОТЫ

Оптимизация метода определения активности NLRP3 в целях поиска новых ингибиторов активации инфламмасомы.

МЕТОДИКА ИССЛЕДОВАНИЯ

Материалы и оборудование. Используются мыши-доноры линии C57BL/6J, без специфических патогенов, в возрасте 3–6 мес. Содержание животных должно осуществляться в оборудованных вивариях и отвечать Международным рекомендациям Европейской конвенции по защите позвоночных животных, используемых при экспериментальных исследованиях и правилам лабораторной практики при проведении доклинических исследований в РФ. Активность NLRP3 определяется по образованию ИЛ-1β с помощью коммерческих ИФА-наборов (Cloud-Clone, Китай) и изменению площади стимулированных ЛПС + АТФ мышиных макрофагов. Реактивы, используемые в эксперименте, предпочтительно приобретать у проверенных поставщиков – Sigma Aldrich (США), Диа-М (Россия), ПанЭко (Россия) и других.

Выделение перитонеальных макрофагов. Животным в асептических условиях с помощью стерильного одноразового шприца на 5 мл вводят внутрибрюшинно по 2 мл 3%-го раствора ферментативного пептона. Следует избегать попадания иглы в мочевой пузырь, кишечник и печень. Мышей экспонируют в течение 3 суток и подвергают эвтаназии методом цервикальной дислокации с последующей фиксацией на препаровальном столе. Важно делать эвтаназию быстро и аккуратно во избежание попадания крови в брюшную полость. Одновременно возможно умерщвление 2–5 мышей в зависимости от опыта специалиста. Место разреза обрабатывают 70%-м спиртом и послойно стерильными ножницами вскрывают брюшину «конвертом», обнажая стенку брюшной полости (рис. 1). Заполняют брюшную полость 10 мл охлажденным до +4–6 °С раствором Хенкса (без ионов Ca²⁺ и Mg²⁺, без фенолового красного) в объеме 5 мл с помощью стерильного одноразового шприца. Используя одноканальный дозатор со стерильным наконечником, лаваж аспирируют и переносят в стерильные пробирки объемом 15 мл, которые держат на льду в целях предотвращения адгезии клеток перитонеального экссудата к пластиковой стенке (рис. 1). Пробирки заполняются до метки. После каждой мыши инструменты и препаровальный стол тщательно обрабатывают 70%-м спиртом.

 

Рис. 1. Схема сбора перитонеального экссудата

 

Лаваж центрифугируют при 250 г в течение 10 мин. Надосадочную жидкость отбрасывают, осадок ресуспендируют охлажденным раствором Хенкса. Суспензию центрифугируют при 250 г в течение 5 мин, надосадочная жидкость снова отбрасывается, осадок тщательно ресуспендируют охлажденной полной питательной средой до объема 1 мл, представляющей собой раствор питательной среды DMEM с 2 мМ глутамина и содержанием глюкозы 4,5 г/л, дополненный 10%-й инактивированной телячьей эмбриональной сывороткой и смесью пенициллина и стрептомицина в концентрации 50 ЕД/мл. Из пробирок отбирают 10 мкл первичной клеточной суспензии и проводят окраску с 10 мкл 0,4%-го трипанового синего в стерильных эппендорфах. Проводят подсчет клеток на камере Горяева. Разводят суспензию охлажденной полной питательной средой до концентрации 1,5–2 × 10⁶ клеток/мл. Полученную клеточную суспензию вносят по 100 мкл в лунку культурального планшета (активные лунки). Краевые лунки заполняются только 250 мкл дистиллированной воды (рис. 2).

Инкубируют в течение 2 ч в СО₂-инкубаторе (уровень СО₂ 5 %, температура 37 °С). Затем промывают лунки планшета от погибших и не прикрепившихся макрофагов и других клеточных субпопуляций с помощью раствора Хенкса или DMEM (37 °С). После промывки доводят полной питательной средой до объема 180 мкл/лунка и инкубируют в течение 18 ч.

 

Рис. 2. Схема 96-луночного культурального планшета. Белым цветом обозначены краевые лунки, зеленым – интактные, желтым – ЛПС-контроль, оранжевым – ЛПС+АТФ-контроль, фиолетовым – лунки препарата сравнения, синие – опытные

 

Исследование активности инфламмасомы NLRP3. Вносят ЛПС (E. coli O127:B8, Sigma, США) в лунки планшета (за исключением интактных) в конечной концентрации 10 мкг/мл (рис. 2). Инкубируют в течение 24 ч и вносят исследуемые вещества. Конечная концентрация составляет 100 мкМ (скрининговая концентрация) или используется диапазон концентраций 0,1–100 мкМ для определения зависимости «концентрация-активность». Обработка клеток веществами длится 1 ч в инкубаторе, после чего в лунки (за исключением ЛПС-контроля и интактных) вносят раствор АТФ с конечной концентрацией 5 мМ (рис. 2). После 1,5-часовой инкубации с раствором АТФ делается забор супернатанта для определения ИЛ-1β с помощью ИФА-наборов (Cloud-Clone, Китай). Супернатант допустимо заморозить, если не планируется использовать его сразу. Также целесообразно определение цитотоксичности соединений методом ЛДГ-теста [7]. После забора супернатанта клетки проводят окраску макрофагов по Май-Грюнвальду с целью измерения клеточной площади и оценки морфологических изменений.

Обработка результатов. Измерения и расчет IC₅₀ исследуемых веществ и препарата сравнения проводятся в трех независимых экспериментах. Данные обрабатываются с использованием MS Excel и GraphPad Prism 8.4.3. Величины IC₅₀ вычисляют с помощью нелинейной 3-параметрической регрессии. Статистическая значимость определяется с применением непараметрического критерия Краскела – Уоллиса с пост-тестом Данна.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Определили влияние различных факторов на продукцию ИЛ-1β, таких как продолжительность стимуляции макрофагов (время инкубации) и конечная концентрация ЛПС и АТФ в питательной среде. Показано, что наиболее оптимальной является 24-часовая обработка клеток 10 мкг/мл ЛПС. При этом последующая активация инфламмасом раствором АТФ в конечной концентрации 5 мМ существенно увеличивает продукцию интерлейкина. Напротив, при концентрации 1 мМ АТФ в питательной среде эффект менее выражен, а использование более концентрированных растворов (10 мМ) не дает значимого прироста продукции ИЛ-1β, что, по-видимому, свидетельствует о достижении клетками «метаболического максимума» (рис. 3).

 

Рис. 3. Секреция ИЛ-1β через 3,5 ч и 24 ч после стимуляции ЛПС перитонеальных макрофагов

 

Было оценено влияние глибенкламида на синтез ИЛ-1β в диапазоне концентраций 0,001–50 мкМ (рис. 4). Также оценивали изменение площади макрофагов, обработанных данным препаратом в диапазоне концентраций 0,1–100 мкМ (рис. 5).

 

Рис. 4. Зависимость «концентрация-активность» глибенкламида на секрецию ИЛ-1β
* p < 0,05; ** p <0,005; *** p < 0,001; **** p < 0,0001

 

Рис. 5. Снижение площади стимулированных ЛПС + АТФ макрофагов под действием глибенкламида в диапазоне концентраций 0,1–100 мкМ (n = 100). Статистическая значимость по сравнению с контролем LPS + ATP. Тест Краскела – Уоллиса с посттестом Данна

 

Для оценки качества методики рассчитали Z-фактор по формуле:

$Z = 1-$ $\frac{3·\left({\sigma }_{\rho } + {\sigma }_n\right)}{\left|{\mu }_{\rho } - {\mu }_n\right|}$

где ${\sigma }_{\rho }$ и ${\sigma }_n$ – стандартные отклонения положительного (ЛПС + АТФ) и отрицательного (интакт) контроля;${\mu }_{\rho }$ и ${\mu }_n$ – средние значения положительного и отрицательного контроля соответственно. $Z < 0$ является неприемлемым; $0 \le Z < 0,5$ означает среднее качество; $0,5 \le Z < 1$ – отличное качество; $Z = 1$ – идеальный показатель [8]. В использованных нами условиях значение $Z$ - фактора составило 0,81.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В результате исследования были подобраны оптимальные концентрации ЛПС и АТФ, а также время инкубации перитонеальных макрофагов мышей. Оценкой оптимальных условий проведения исследования послужило значение Z-фактора. На основании выбранных условий была оценена ингибиторная активность глибенкламида в отношении активации NLRP3 стимулированных ЛПС + АТФ мышиных макрофагов по показателям синтеза ИЛ-1β и клеточных площадей.

Об авторах

Роман Дмитриевич Данилов

Волгоградский государственный медицинский университет

Автор, ответственный за переписку.
Email: romkan43@gmail.com

аспирант кафедры фармакологии и биоинформатики, лаборант-исследователь лаборатории метаботропных лекарственных средств, Научный центр инновационных лекарственных средств с опытно-промышленным производством

Россия, Волгоград

Елена Вячеславовна Соколова

Волгоградский государственный медицинский университет

Email: sokolova210795@gmail.com

аспирант кафедры фармакологии и биоинформатики Научный центр инновационных лекарственных средств с опытно-промышленным производством

Россия, Волгоград

Екатерина Константиновна Захарова

Волгоградский государственный медицинский университет

Email: ekzakharova1@gmail.com

кандидат химических наук, доцент, доцент кафедры химии, лаборант-исследователь лаборатории метаботропных лекарственных средств, Научный центр инновационных лекарственных средств с опытно-промышленным производством

Россия, Волгоград

Денис Александрович Бабков

Волгоградский государственный медицинский университет

Email: denis.a.babkov@gmail.com

доктор фармацевтических наук, профессор, профессор кафедры фармакологии и биоинформатики, директор Научного центра инновационных лекарственных средств с опытно-промышленным производством, старший научный сотрудник лаборатории метаботропных лекарственных средств, Научный центр инновационных лекарственных средств с опытно-промышленным производством

Россия, Волгоград

Список литературы

Дополнительные файлы