Acid-base composition of mice blood during the progression of toxic pulmonary edema

全文:

ВВЕДЕНИЕ

Моделирование токсического отека легких (ТОЛ) с целью исследования эффективности лекарственных препаратов сопряжено со сложностями валидации модели и объективизации критериев эффективности лекарственных средств. Для подтверждения значимости изменений легочных коэффициентов и визуальных изменений ткани легкого применяли анализ кислотно-основного состояния (КОС) и газов крови для объективизации возникающих нарушений газообмена. ТОЛ приводит к формированию дыхательной недостаточности, заключающейся в нарушении газообмена между альвеолярным воздухом и омывающей альвеолы кровью [1, 2]. Основными патогенетическими звеньями такого процесса считают нарушения вентиляции легких, изменения кровотока в них и затруднение диффузии газов через альвеолокапиллярную мембрану [3–5]. Расстройства внешнего дыхания приводят к изменениям КОС и напряжения газов крови [1, 2, 6, 7], нарушениям кислород-транспортной функции крови и баланса электролитов, выявление и оценка которых в динамике экспериментального токсического отека легких составила цель настоящего исследования, достижение которой будет способствовать валидации экспериментальной модели для фармакологических исследований.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Эксперименты проводили на белых беспородных мышах-самцах массой 18–20 г. ТОЛ моделировали путем ингаляционного отравления животных фосгеном в затравочной камере в дозе, соответствующей LСt₅₀ [8, 9]. Животных декапитировали, для анализа забирали смешанную кровь. В крови определяли pH, парциальное давление кислорода (pO₂), парциальное давление углекислого газа (рСО₂), содержание общего гемоглобина (tHb), оксигемоглобина (O₂Hb), карбоксигемоглобина (COHb), метгемоглобина (MetHb), восстановленного (редуцированного) гемоглобина (RНb), кислородное насыщение (sO₂m), концентрацию кислорода (O₂ct) и кислородную емкость крови (O₂cap), парциальное давление кислорода при 50 % насыщении крови (P₅₀), содержание общего диоксида углерода (tCO₂), содержание истинного (HCO₃) и стандартного бикарбоната (SBC), актуальный (BE_b) и стандартный избыток оснований (BЕ_ecf), анионную разницу (Anion Gaр), содержание лактата (Lac), содержание ионов Na⁺, K⁺, Ca²⁺, Cl^-, Ca_{(pH 7,4)}²⁺.

Измерение проводили с использованием газоанализатора «Synthesis 45» (Instrumentation Laboratory, США), через 30 мин, 3 и 24 ч после начала опыта.

Для статистической обработки полученных количественных данных применяли программное обеспечение Graph Pad Prizm v.6. Все данные были представлены как среднее ± стандартная ошибка среднего (M ± m). Проверку на нормальность распределения осуществляли с использованием критерия Колмогорова – Смирнова. В случае нормальности распределения использовали однофакторный дисперсионный анализ ANOVA для выявления статистических различий нескольких групп. Для сравнения только между двумя группами попарно применяли t-критерий Стьюдента для независимых выборок. При отсутствии нормальности распределения использовали непараметрический аналог дисперсионного анализа критерий Краскела – Уоллеса. Для парного сравнения в этом случае применяли непараметрический критерий Манна – Уитни. Различия считали значимыми при уровне значимости 95 % (р < 0,05).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Полученные результаты исследования газового состава крови представлены в таблицах 1 и 2. Установлено, что через 30 мин после отравления ни один из исследуемых параметров не изменился по сравнению с показателями интактных животных. Через 3 ч после отравления показатель рН крови, характеризующий КОС и представляющий собой один из самых «жестких» параметров крови, сместился в кислую сторону.

 

Таблица 1. Газовый состав крови мышей, отравленных фосгеном в токсической дозе LСt₅₀ (M ± m, n = 6)

Table 1. Blood gas composition in mice exposed to toxic doses of phosgene (LСt₅₀) (M ± m, n = 6)

Группа животных, время после отравления	Параметры, единицы измерения
	pH	рСО2, мм рт. ст.	pO2, мм рт. ст.	tHb, г/л	O2Hb, %	COHb, %
Интактные	7,366 ± 0,024	32,2 ± 6,2	57,0 ± 6,0	96,0 ± 14,0	72,5 ± 4,8	6,3 ± 2,0
Отравленные, 30 мин	7,390 ± 0,013	32,7 ± 2,5	51,0 ± 3,0	106,0 ± 14,0	67,2 ± 2,7	6,8 ± 1,6
Отравленные, 3 ч	7,272 ± 0,068*	42,0 ± 3,9*	53,0 ± 14,0	92,0 ± 30,0	56,6 ± 9,5*	6,5 ± 3,0
Интактные	7,246 ± 0,049	43,3 ± 6,9	57,0 ± 8,0	93,0 ± 12,0	61,4 ± 8,1	4,7 ± 1,3
Отравленные, 24 ч	7,262 ± 0,011	52,2 ± 7,8	53,0 ± 6,0	111,0 ± 5,0	60,5 ± 10,0	3,4 ± 1,0

Примечание: * — p ≤ 0,05 в сравнении с группой интактных животных; рСО₂ — парциальное давление углекислого газа, pO₂ — парциальное давление кислорода, tHb — содержание общего гемоглобина, O₂Hb — содержание оксигемоглобина, COHb — содержание карбоксигемоглобина.

Note: * — p ≤ 0.05 compared to intact control animals; рСО₂ — partial carbon dioxide pressure; pO₂ — partial oxygen pressure; tHb — total hemoglobin content; O₂Hb — oxyhemoglobin content; COHb — carboxyhemoglobin content.

 

Таблица 2. Газовый состав крови мышей, отравленных фосгеном в токсической дозе LCt₅₀ (M ± m, n = 8)

Table 2. Blood gas composition in mice exposed to toxic doses of phosgene (LCt₅₀) (M ± m, n = 8)

Группа животных, время после отравления	Параметры, единицы измерения
	MetHb, %	RНb, %	sO2m, %	O2ct, об.%О2	O2cap, об.%О2	P50, мм рт. ст.
Интактные	0	22,5 ± 5,2	77,3 ± 5,7	9,7 ± 1,9	12,5 ± 1,7	37,4 ± 1,4
Отравленные, 30 мин	0	26,9 ± 3,2	72,1 ± 3,0	9,9 ± 1,7	13,8 ± 1,9	36,3 ± 1,4
Отравленные, 3 ч	0,4 ± 0,2	37,9 ± 16,2	60,6 ± 7,4 *	7,3 ± 3,2	12,1 ± 4,0	44,8 ± 3,8*
Интактные	0	34,8 ± 8,9	64,5 ± 8,8	7,9 ± 1,2	12,3 ± 1,7	46,0 ± 2,7
Отравленные, 24 ч	0,4 ± 0,3	36,6 ± 10,1	62,9 ± 10,2	9,3 ± 1,7	14,9 ± 0,8	43,5 ± 2,4

Примечание: * — p ≤ 0,05 в сравнении с группой интактных животных; MetHb — содержание метгемоглобина; RНb — содержание восстановленного (редуцированного) гемоглобина; sO₂m — кислородное насыщение крови; O₂ct — концентрация кислорода крови; O₂cap — кислородная емкость крови; P₅₀ — парциальное давление кислорода при 50 % насыщении крови.

Note: * — p ≤ 0.05 compared to intact control animals; MetHb — methemoglobin content; RHb — reduced hemoglobin content; sO₂m — blood oxygen saturation; O₂ct — blood oxygen concentration; O₂cap — blood oxygen capacity; P₅₀ — partial oxygen pressure at 50 % saturation.

 

Во всех экспериментальных группах обнаружено достоверное повышение pCO₂. При нормальных значениях концентраций HCO₃ и SBC (табл. 3), это указывает на развитие респираторного ацидоза, причиной которого может быть альвеолярная гиповентиляция. При этом обнаружено повышение парциального давления кислорода при 50 % насыщении крови (параметра Р₅₀), т. е. сдвиг кривой диссоциации оксигемоглобина вправо, что можно рассматривать как один из компенсаторных механизмов, который приводит к облегчению высвобождения кислорода в тканях.

 

Таблица 3. Кислотно-основной состав крови мышей, отравленных фосгеном в токсической дозе LCt₅₀ (M ± m, n = 6)

Table 3. Acid-base composition of blood in mice exposed to toxic doses of phosgene (LCt₅₀) (M ± m, n = 6)

Группа животных, время после отравления	Параметры, единицы измерения
	HCO3–, ммоль/л	SBC, Моль/л	tCO2, ммоль/л	BEb, ммоль/л	BЕecf, ммоль/л	Anion Gaр, ммоль/л
Интактные	18,7 ± 3,8	20,4 ± 2,5	19,7 ± 4,0	–5,2 ± 3,3	–6,9 ± 3,9	23,0 ± 1,0
Отравленные, 30 мин	20,0 ± 1,5	21,7 ± 0,7	20,9 ± 1,9	–3,6 ± 1,3	–5,2 ± 1,6	22,0 ± 2,0
Отравленные, 3 ч	19,6 ± 1,9	19,4 ± 2,6	21,0 ± 2,0	–6,2 ± 2,9	–7,5 ± 2,9	22,0 ± 3,0
Интактные	18,9 ± 1,4	18,6 ± 1,0	20,2 ± 1,5	–7,3 ± 1,2	–8,6 ± 1,2	23,0 ± 1,0
Отравленные, 24 ч	23,7 ± 3,0*	21,8 ± 1,5*	25,4 ± 3,2*	–3,0 ± 2,3*	–3,5 ± 2,7*	22,0 ± 2,0

Примечание: * — p ≤ 0,05 в сравнении с группой интактных животных; tCO₂ — содержание общего диоксида углерода; HCO_3– — содержание истинного бикарбоната; SBC — содержание стандартного бикарбоната; BE_b — актуальный избыток оснований; BЕ_ecf — стандартный избыток оснований; Anion Gaр — анионная разница.

Note: * — p ≤ 0.05 compared to intact control animals; tCO₂ — total carbon dioxide content; HCO_3– — true bicarbonate content; SBC — standard bicarbonate content; BE_b — actual base excess; BE_ecf — standard base excess.

 

Содержание O₂Hb (см. табл. 1) и sO₂m (см. табл. 2) у таких животных через 3 ч после перенесенного отравления достоверно снижалось, а рСО₂, (см. табл. 1) достоверно и логично повышалось. Кроме того, у этих животных в крови обнаруживался метгемоглобин, которого не наблюдалось ни у интактных животных, ни у животных через 30 мин после отравления фосгеном. Через 24 ч после отравления наблюдали нормализацию pH и всех измененных до этого параметров. Кроме этого, в группе контрольных животных через 24 ч после отравления также обнаруживался метгемоглобин.

Таким образом, мы установили, что во время скрытого периода отравления фосгеном (через 30 мин) нарушения со стороны газового состава крови не выявлялись. На этапе выраженных клинических проявлений отека легких (через 3 ч после отравления фосгеном) обнаруживали снижение рН крови, содержания оксигемоглобина и кислородного насыщения крови, а также повышение парциального давления углекислого газа, т. е. признаки дыхательной недостаточности и респираторного ацидоза (компенсированного). Через 24 ч после отравления у выживших животных происходила нормализация кислородного статуса с сохраняющимися признаками разбалансировки.

Результаты исследования КОС и электролитного состава крови в динамике ТОЛ представлены в таблицах 3 и 4.

 

Таблица 4. Содержание электролитов и лактата в крови мышей, отравленных фосгеном в токсической дозе LСt₅₀ (M ± m, n = 6)

Table 4. Electrolyte and lactate levels in blood of mice exposed to toxic doses of phosgene (LСt₅₀) (M ± m, n = 6)

Группа животных, время после отравления	Параметры, единицы измерения
	Na+, Моль/л	K+, Моль/л	Ca++, ммоль/л	Cl–, ммоль/л	Lac, ммоль/л	Ca(pH 7,4)2+, ммоль/л
Интактные	149,0 ± 2,0	5,4 ± 1,0	0,44 ± 0,05	113,0 ± 3,0	4,82 ± 0,64	0,4 ± 0,01
Отравленные, 30 мин	147,0 ± 2,0	6,7 ± 1,9	0,48 ± 0,09	112,0 ± 1,0	3,34 ± 0,79	0,5 ± 0,1
Отравленные, 3 ч	150,0 ± 5,0	5,3 ± 0,8	0,48 ± 0,12	114,0 ± 2,0	3,50 ± 0,29 *	0,43 ± 0,09
Интактные	148,0 ± 1,0	5,8 ± 1,5	0,47 ± 0,11	111,0 ± 3,0	3,90 ± 0,80	0,44 ± 0,11
Отравленные, 24 ч	146,0 ± 2,0	5,0 ± 0,2	0,43 ± 0,05	106,0 ± 3,0	4,68 ± 0,22	0,40 ± 0,05

Примечание: * — p ≤ 0,05 в сравнении с группой интактных животных; Lac — содержание лактата.

Note: * — p ≤ 0.05 compared to intact control animals; Lac — lactate content.

 

Установлено, что через 30 мин и 3 ч после инициации ТОЛ ни один из исследованных показателей КОС не изменялся. Существенные изменения показатели КОС претерпевали лишь через 24 ч наблюдения. В крови животных на фоне нормализации pH происходило повышение содержания HCO₃, SBC и tCO₂. Изменялись показатели актуального избытка оснований и стандартного избытка оснований, что свидетельствовало об уменьшении недостатка оснований в крови.

Исследование содержания электролитов на все сроки наблюдения показало отсутствие каких-либо изменений во всех экспериментальных группах (табл. 4).

Интерес представляет снижение содержания лактата, обнаруженное в группе отравленных животных через 3 ч наблюдения. По всей видимости, снижение лактата на данном этапе развития ТОЛ может объясняться либо отсутствием тканевой гипоксии (при манифестации гипоксии респираторной) [5, 10], либо доступностью глюкозы вследствие гипоксической перестройки энергетического обмена, либо низкой доступностью глюкозы вследствие гипоксической перестройки энергетического обмена [11, 12], либо усилением использования лактата для синтеза глюкозы (глюконеогенеза) [13, 14].

Последние два предположения можно сделать исходя из патогенеза ТОЛ. Помимо этого, известно, что одним из патогенетических звеньев ТОЛ является поражение эндотелия [15, 16], которое носит генерализованный характер и, как мы установили ранее, наблюдается уже в первые 30 мин развивающегося патологического процесса. Тогда же выявляются и прогрессируют изменения во внутренних органах. В связи с этим уменьшение содержания лактата в крови отравленных животных на раннем этапе ТОЛ может свидетельствовать также о снижении доступности глюкозы и в результате развивающегося тканевого отека, так как глюкоза является предшественником лактата в условиях анаэробного метаболизма [17, 18].

В целом мы установили, что в процессе развития ТОЛ, вызванного ингаляцией фосгена, во все сроки наблюдения ни у одной из экспериментальных групп мышей нарушений электролитного состава крови не возникало. Изменения КОС манифестировали через 3 ч после отравления и выражались снижением pH. Через 24 ч после отравления изменения уже касались практически всех исследованных показателей КОС, где на фоне нормализации pH происходило повышение содержания истинного бикарбоната, стандартного бикарбоната и общего диоксида углерода. Изменялись показатели актуального избытка оснований и стандартного избытка оснований, что свидетельствовало об уменьшении недостатка оснований в крови.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Таким образом, эксперименты позволили установить детали, сопровождающие развитие респираторной гипоксии в динамике развития ТОЛ, и в целом подтверждают формирование дыхательной (респираторной) гипоксии как пускового звена патогенетической цепи, приводящей к драматическим изменениям энергетического метаболизма при ТОЛ.

作者简介

Pavel Torkunov

Saint Petersburg City Multidisciplinary Hospital No. 2; Kirov Military Medical Academy

编辑信件的主要联系方式.
Email: tpa4@mail.ru
ORCID iD: 0000-0003-0491-2237
SPIN 代码: 3656-7755

MD, Dr. Sci. (Medicine)

俄罗斯联邦, 194354, Saint Petersburg, Uchebny Lane, 5; Saint Petersburg

Aleksandr Zemlyanoy

Scientific Research Institute of Hygiene, Occupational Pathology and Human Ecology

Email: al-zem@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0001-8055-2291
SPIN 代码: 2114-1375

MD, Cand. Sci. (Medicine)

俄罗斯联邦, Kuzmolovsky settlement, Leningrad Region

Sergei Chepur

State Research and Testing Institute of Military Medicine

Email: chepursv@mail.ru
ORCID iD: 0000-0002-5324-512X

MD, Dr. Sci. (Medicine)

俄罗斯联邦, Saint Petersburg

Olga Torkunova

Saint Petersburg State Pediatric Medical University of the Ministry of Health of Russia

Email: ovt4@mail.ru
ORCID iD: 0000-0002-8471-3854

Cand. Sci. (Biology)

俄罗斯联邦, Saint Petersburg

Petr Shabanov

Kirov Military Medical Academy

Email: pdshabanov@mail.ru
ORCID iD: 0000-0003-1464-1127
SPIN 代码: 8974-7477

MD, Dr. Sci. (Medicine), professor

俄罗斯联邦, Saint Petersburg

参考

补充文件