Antidrug effects of GTS201 dipeptide, an imitation of the second bird BDNF, in morphine-addicted rats

Mark A. Konstantinopolskii; Константинопольский Марк Александрович; Larisa G. Kolik; Колик Лариса Геннадиевна; Irina V. Chernyakova; Чернякова Ирина Владимировна; Nelli M. Sazonova; Сазонова Нелли Михайловна; Tatyana A. Gudasheva; Гудашева Татьяна Александровна

doi:10.17816/phbn567968

Антинаркотические эффекты дипептида ГТС-201, миметика 2-й петли BDNF, у крыс, зависимых от морфина

Авторы: Константинопольский М.А.¹, Колик Л.Г.¹, Чернякова И.В.¹, Сазонова Н.М.¹, Гудашева Т.А.¹
Учреждения:
1. Научно-исследовательский институт фармакологии им. В.В. Закусова
Выпуск: Том 14, № 3 (2023)
Страницы: 185-191
Раздел: Биологическая наркология
URL: https://ogarev-online.ru/1606-8181/article/view/258282
DOI: https://doi.org/10.17816/phbn567968
ID: 258282

Цитировать

Полный текст

Аннотация
Полный текст
Об авторах
Список литературы
Дополнительные файлы
Статистика

Аннотация

Актуальность. В НИИ фармакологии имени В.В. Закусова были созданы дипептидные димерные миметики 1-й, 2-й и 4-й петли BDNF — ГСБ-214, ГТС-201 и ГСБ-106 соответственно. Было показано, что соединение ГТС-201 (гексаметилендиамид бис-гексаноил-серил-лизина), миметик 2-й петли BDNF, активирует специфический рецептор TrkB и MAPK/Erk-киназный путь, не влияет на сигнальный путь PI3K/Akt и обладает нейропротекторной активностью, аналогично BDNF в опытах in vitro на модели окислительного стресса в культуре гиппокампальных нейронов линии НТ-22.

Цель — изучить влияние дипептида ГТС-201 на поведение лабораторных белых крыс в процессе формирования у них состояния зависимости и синдрома отмены морфина.

Методы. Зависимость от морфина у крыс вырабатывали введением морфина в возрастающих дозах от 10 до 20 мг/кг, 2 раза в день, с интервалом 8 ч, в течение 5 сут. ГТС-201 в дозах 1 или 5 мг/кг вводили однократно за 30 мин до морфина на 5-й день эксперимента или ежедневно (в одной из групп), в течение 5 дней утром за 30 мин до введения морфина. Тестирование животных на наличие специфических признаков синдрома отмены морфина проводили на 5-й день опыта в течение 5 мин в «открытом поле». Были сформированы 4 экспериментальные группы: группа 1 (группа активного контроля) — «морфин хр. + налоксон»; группа 2 — «морфин хр. + ГТС-201 (1) + налоксон»; группа 3 — «морфин хр. + ГТС-201 (5) + налоксон»; группа 4 — «морфин хр. + ГТС-201 (1 × 5) + налоксон» (обозначения: хр. — введение морфина в течение 5 дней; (1) и (5) — дозы веществ в мг/кг, (1 × 5) — хроническое введение пептида в течении 5 дней).

Результаты. При изучении влияния дипептида ГТС-201 на поведенческие, соматические и неврологические показатели поведения животных после отмены морфина были отмечены значимые изменения выраженности отдельных признаков синдрома отмены. Проявления диареи существенно уменьшались во всех группах животных, которым вводили пептид. У животных из группы 3 был отмечен максимальный эффект: диарея снижалась на 71,0 % (p < 0,001), судороги — на 83,3 % (p < 0,05), бегство — на 71,4 % (p < 0,01), вокализация — на 62,5 % (p < 0,05). В группе 2 ГТС-201, вводимый в дозе 1 мг/кг однократно, полностью устранял появление попыток бегства, в то время как в группе 4, при хроническом введении, пептид в той же дозе полностью блокировал судорожные реакции у крыс. Несмотря на значимые изменения отдельных показателей, суммарный индекс синдрома отмены морфина для групп, которым хронически вводили морфин, не изменялся статистически значимо в сравнении с группой 1 активного контроля. В контрольной группе его значение составило 7,3 ± 0,36 балла (100 %), тогда как в группах 2, 3, 4 — от 6,2 (84,9 %) до 6,5 (89,0 %) балла, p > 0,05.

Заключение. Предполагается, что обнаруженная антиаддиктивная активность дипептида ГТС-201 может быть опосредована активацией TrkB-рецепторов и MAPK/Erk-киназного сигнального пути, что не исключает участия опиоидных рецепторных механизмов в реализации отмеченных поведенческих феноменов.

Ключевые слова

олигопептиды, ГТС-201, BDNF, морфин, зависимость, синдром отмены

Полный текст

АКТУАЛЬНОСТЬ

Ранее в НИИ фармакологии имени В.В. Закусова были созданы дипептидные димерные миметики 1, 2 и 4-й петли BDNF — ГСБ-214 (гептаметилендиамид бис-моносукцинил-метионил-серина), ГТС-201 (гексаметилендиамид бис-гексаноил-серил-лизина) и ГСБ-106 (гексаметилендиамид бис-моносукцинил-серил-лизина) соответственно. Было показано, что соединение ГТС-201, миметик 2-й петли BDNF, активирует специфический рецептор TrkB и MAPK/Erk-киназный путь, не влияет на сигнальный путь PI3K/Akt и обладает нейропротекторной активностью, аналогично BDNF в опытах in vitro, на модели окислительного стресса, в культуре гиппокампальных нейронов линии НТ-22 [1, 2].

Впервые в данном исследовании изучалось влияние дипептида ГТС-201 на различные показатели поведения лабораторных белых крыс в процессе формирования у них состояния зависимости и синдрома отмены (СО) морфина. Полученные данные сравнивались с соответствующими показателями для дипептида ГСБ-106, одного из перспективных и ранее изученных пептидных соединений, в аспекте возможной коррекции состояния зависимости от опиатов [3, 4].

Цель данного исследования — изучение влияния дипептида ГТС-201 на различные показатели поведения лабораторных белых крыс в процессе формирования у них состояния зависимости и синдрома отмены (СО) морфина.

МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Эксперименты были выполнены на 80 беспородных крысах-самцах массой 240–260 г. Животные были получены из питомника «Столбовая» и содержались 1 нед. до начала эксперимента в условиях вивария, при естественном освещении и температуре воздуха 21–23 °С, в стандартных пластиковых клетках, по 8 особей в каждой, при потреблении гранулированного корма и воды ad libitum.

Эксперименты выполняли в соответствии с требованиями, содержащимися в Приказе Минздрава РФ от 01.04.2016 № 199н «Об утверждении Правил надлежащей лабораторной практики» и Решениями Совета Европейского экономического союза № 81 «Об утверждении Правил надлежащей лабораторной практики европейского экономического союза в сфере обращения лекарственных средств». Все манипуляции с животными были одобрены биоэтической комиссией ФГБНУ «НИИ фармакологии имени В.В. Закусова», заключение этического комитета: (Протокол №7 от 16.05.2022 г.).

C целью снижения уровня стресса и адаптации к условиям эксперимента с животными проводили процедуру хэндлинга в течение 3–4 дней до начала исследований. Крыс помещали в экспериментальную комнату с естественной сменой освещенности за 1 сут до начала эксперимента, температура воздуха в помещении поддерживалась в пределах 23 ± 1,0 °С. Взвешивание животных проводили через день в течение 12 дней, начиная с 1-го дня введения морфина и ГТС-201. Рассчитывали средние значения изменений массы тела крыс в группах по дням эксперимента.

Применяли следующие препараты: морфина гидрохлорид в дозах 10–20 мг/кг, хронически, агонист µ-опиоидных рецепторов (Чимкентский завод фармпрепаратов); налоксона гидрохлорид, антагонист µ-опиоидных рецепторов (DuPont DeNemours Int. S.A., Швейцария) в дозе 1 мг/кг, однократно, для провокации СО морфина; ГТС-201, гексаметилендиамид бис(N-гексаноил-L-серил-L-лизина), миметик 2-й петли BDNF (ФГБНУ «НИИ фармакологии им. В.В. Закусова), в дозах 1 и 5 мг/кг. Вещества растворяли в дистиллированной воде и вводили extempore, внутрибрюшинно, в объеме 1 мл/1 кг массы тела животного.

Были сформированы 4 экспериментальные группы: группа 1 — «морфин хр. + налоксон» (группа активного контроля); группа 2 — «морфин хр. + ГТС-201 (1) + налоксон»; группа 3 — «морфин хр. + ГТС-201 (5) + налоксон»; группа 4 — «морфин хр. + ГТС-201 (1 × 5) + налоксон» (обозначения: хр. — введение морфина в течение 5 дней; (1) и (5) — дозы веществ в мг/кг, (1 × 5) — хроническое введение пептида в течение 5 дней).

Зависимость от морфина у крыс вырабатывали по ранее разработанной схеме, в соответствии с которой его вводили в возрастающих дозах, от 10 до 20 мг/кг, 2 раза в день, с интервалом 8 ч, в течение 5 сут [5]. ГТС-201 в дозах 1 или 5 мг/кг, однократно, за 30 мин до морфина на 5-й день эксперимента или ежедневно, в одной из групп, в течение 5 дней, утром, за 30 мин до введения морфина. Тестирование животных на наличие специфических признаков СО морфина проводили на 5-й день опыта в течение 5 мин в «открытом поле» (освещенная круглая арена) через 15 мин после введения антагониста опиатных рецепторов налоксона. Контрольные животные ежедневно, в течение 5 дней, получали инъекции дистиллированной воды по той же схеме, что и животные из экспериментальных групп, на 5-й день опыта перед тестированием — налоксон в дозе 1 мг/кг. У животных всех групп регистрировали поведенческие реакции: двигательную активность (ДА), стойки, груминг, дефекации и специфические признаки СО морфина (до 18 показателей). Дискретные признаки абстиненции (диарею — в баллах, отряхивания и скрежет зубами — по числу актов) оценивали количественно и альтернативно, остальные — в альтернативной форме, по принципу «да/нет». Суммарный индекс (СИ) выраженности СО для каждого животного и средние значения для опытных и контрольной групп рассчитывали на основании альтернативных признаков при максимально возможной величине СИ, равной 18 баллам. Среднее значение выраженности СО в группе 1 принимали за 100 %.

Для оценки влияния дипептида ГТС-201 на поведение зависимых от морфина крыс в тесте приподнятый крестообразный лабиринт (ПКЛ) его использовали в стандартной конфигурации: длина рукавов 50 см, ширина — 14 см, центральная площадка — 14 × 14 см, высота бортиков закрытых рукавов — 15 см. Через 24 ч после отмены инъекций морфина в течение 5 мин регистрировали стандартные показатели поведения: число заходов в открытые рукава, время нахождения в открытых рукавах секунды и число заходов в закрытые рукава.

Оценку тактильных порогов у крыс проводили в тесте фон Фрея, использовали стандартный набор филаментов фирмы Ugo Basile (Италия), способных оказывать градуированное давление на подошвенную поверхность задних лап крыс, каждое измерение с отдельным филаментом выполняли не менее 3 раз, оценивали реакцию животных на давление, силу которого выражали в граммах. Для каждой группы животных проводили исходные измерения тактильных порогов, до применения веществ, и финальные измерения, через 24 ч после отмены морфина и последнего введения дипептида ГТС-201. Статистический анализ: тест ANOVA, U-тест Манна — Уитни и тест Дункана для сравнения различий между группами. Данные представляли как средние значения ± ошибка среднего (m ± SEM), а также в % относительно исходного уровня значений в каждом тесте. Данные оценивали как статистически значимые при величинах р < 0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ОБСУЖДЕНИЕ

Изменения массы тела животных по группам регистрировали в течение 12 дней. Статистически значимые изменения этого показателя отмечались с 5-го дня, от начала введения морфина, в группах 1 и 2 к этому дню среднее значение снижения массы тела составило 11 % (р < 0,05) от исходного уровня. После отмены морфина, на 7-й день эксперимента, отмечали максимальное падение массы тела в группах 1, 2, 3 соответственно на 17,8; 16,9 и 14,6 % (р < 0,01). При хроническом введении ГТС-201 блокировал падение массы тела у морфинзависимых животных в группе 4 (табл. 1).

Таблица 1. Изменение массы тела крыс под влиянием морфина и соединения ГТС-201 (m ± S.E.M.)

Table 1. Weight changes of rat body after administration of morphine and GTS-201 compound (m ± S.E.M.)

Дни эксперимента	Масса тела крыс (г) в экспериментальных группах
	Группа 1		Группа 2		Группа 3		Группа 4
	грамм	%	грамм	%	грамм	%	грамм	%
1	273,5±4,9	100	282,5±2,5	100	272,0±4,6	100	283,0±3,3	100
3	260,5±6,2	95,2±1,4	271,5±3,6	96,1±1,4	261,5±3,9	96,2±1,4	272,5±5,6	96,2±1,2
5	243,5±5,2	89,0^*±0,6	251,5±2,1	89,0^*±0,5	254,5±4,6	93,5±0,9	261,0±6,7	92,1±1,7
7	224,8±4,3	82,2^**±1,1	234,7±2,3	83,1^**±0,9	232,3±3,8	85,4^**±1,2	264,6±4,6	93,5^#±1,5
12	266,4±4,8	97,4±1,3	273,2±1,8	96,7±0,8	263,8±4,2	97,0±0,9	277,9±3,9	98,2±1,3

Примечание. ^*P < 0,05; ^**P < 0,01 при сравнении величин массы тела в ٥-й и ٧-й дни с значениями в ١-й день эксперимента. ^#P < 0,05 при сравнении гр. ١ и гр. ٤ в ٧-й день эксперимента. Описание групп см. в разделе «Методы исследования».

Тактильные пороги у крыс были заметно снижены во всех группах после отмены морфина. Однако после введения дипептида ГТС-201 отмечалось частичное восстановление тактильных порогов, наиболее выраженное для группы 2, до уровня 25,6 % (р < 0,05), и для группы 3, до уровня 20,1 % (р < 0,01), в меньшей степени для группы 4, до уровня 12,5 % (р < 0,05) исходных значений. Указанные величины статистически значимо отличались от средних значений порогов в группе 1 (контрольной) (табл. 2).

Таблица 2. Изменения тактильных порогов у морфин-зависимых крыс в тесте von Frey (m ± S.E.M.)

Table 2. Tactil thresholds changes in morphine-depended rats in von Frey’s test (m ± S.E.M.)

Экспериментальные группы	Исходные значения		После отмены
Экспериментальные группы	Грамм	%	Грамм	%
Группа 1	0,72 ± 0,06	100	0,05 ± 0,005 P = 0,004^##	7,67 ± 0,93
Группа 2	0,82 ± 0,09	100	0,18 ± 0,04 P = 0,02^#	25,56 ± 7,04 P = 0,02*
Группа 3	0,88 ± 0,06	100	0,17 ± 0,03 P = 0,02^#	20,10 ± 2,70 P = 0,004**
Группа 4	1,02 ± 0,14	100	0,13 ± 0,03 P = 0,01^##	12,47 ± 1,98 P = 0,04*

Примечания. ^#P < 0,05; ^##P < 0,01 между исходными величинами тактильных порогов и их значениями после отмены морфина; ^*P < 0,05; ^**P < 0,01 между величинами тактильных порогов для группы 1 в сравнении с группами морфин-зависимых животных, получавших дипептид ГТС-201. Тест ANOVA, Mann–Whitney U-test и Duncan test для сравнения различий между группами.

При изучении влияния дипептида ГТС-201 на поведение зависимых от морфина крыс в тесте ПКЛ не было отмечено значимых различий между группой 1 активного контроля и группой 2 по числу заходов в открытые рукава и временем пребывания в них. Наблюдалась умеренно выраженная тенденция к снижению указанных показателей при сравнении групп 1 и 3 (р = 0,1) (табл. 3).

Таблица 3. Влияние дипептида ГТС-201 на поведение зависимых от морфина крыс в тесте приподнятого крестообразного лабиринта (m ± S.E.M.)

Table 3. Effect of dipeptide GTS-201 on behavior of morphine-depended rats in elevated plus maze test (m ± S.E.M.)

Группы животных	Заходы в открытые рукава	Время нахождения в открытых рукавах (с)	Заходы в закрытые рукава
Группа 1	2,4±0,74	25,2±7,20	4,3±0,96
Группа 2	2,0±0,39 P = 0,58^*	27,6±5,90 P = 0,77^*	3,7±0,75 P = 0,58
Группа 3	1,1±0,27 P = 0,10^*; 0,22^#	11,6±3,37 P = 0,10^*; 0,14^#	3,5±0,54 P = 0,50^*; 0,85^#

Примечание. Статистические различия между и внутри каждой группы не были значимы.

При изучении влияния дипептида ГТС-201 на поведенческие, соматические и неврологические показатели поведения животных после отмены морфина были отмечены значимые изменения выраженности отдельных признаков СО. Проявления диареи существенно уменьшались во всех группах животных, которым вводили пептид. У животных из группы 3 был отмечен максимальный эффект: диарея снижалась на 71,0 % (р < 0,001), судороги — на 83,3 % (р < 0,05), бегство — на 71,4 % (p < 0,01), вокализация — на 62,5 % (р < 0,05). В группе 2, ГТС-201, вводимый в дозе 1 мг/кг однократно, полностью устранял появление попыток бегства, в то время как в группе 4, при хроническом введении, пептид в той же дозе полностью блокировал судорожные реакции у крыс. Несмотря на значимые изменения отдельных показателей, СИ СО морфина для групп, которым хронически вводили морфин, не изменялся статистически значимо в сравнении с группой активного контроля. В контрольной группе его значение в баллах составило 7,3 ± 0,36 (100 %), тогда как в группах 2, 3, 4 — от 6,2 (84,9 %) до 6,5 (89,0 %), р > 0,05. (табл. 4)

Таблица 4. Влияние дипептида ГТС-٢٠١ на поведенческие показатели синдрома отмены морфина у крыс (m ± S.E.M.)

Table 4. Effect of dipeptide GTS-201 on behavior indexes of withdrawal syndrome of morphine in rats (m ± S.E.M.)

Поведенческие признаки	Экспериментальные группы
Поведенческие признаки	Группа 1	Группа 2	Группа 3	Группа 4
Индекс CО морфина	7,3±0,36	6,5±0,36 P = 0,45 н.д.	6,2±0,48 P = 0,48 н.д.	6,4±0,47 P = 0,19 н.д.
Диарея	3,1±0,27	2,1±0,36^*	0,9±0,48^***	1,6±0,47^**
Поза	0,5±0,16	0,9±0,18	0,8±0,13	0,8±0,13
Птоз	0,7±0,12	0,6±0,14	0,8±0,13	0,3±0,12
Пилоэрекция	0,8±0,13	0,7±0,16	0,9±0,16	0,8±0,13
Ринорея	0,4±0,10	0,0±0,0	0,4±0,12	0,7±0,14
Диспноэ	0,8±0,13	0,9±0,16	0,9±0,16	0,9±0,16
Корчи	0,4±0,12	0,3±0,12	0,2±0,12	0,1±0,11
Судорги	0,6±0,16	0,3±0,11	0,1±0,11^*	0,0±0,0^**
Попытки бегства	0,7±0,16	0,0±0,0^**	0,2±0,12^**	0,7±0,14
Вокализация	0,8±0,13	0,8±0,14	0,3±0,14^*	0,6±0,12

Примечание. ^*P < 0,05; ^**P < 0,01; ^***P < 0,001 между величинами поведенческих показателей для группы ١ в сравнении с этими показателями для групп морфин-зависимых животных, получавших дипептид ГТС-٢٠١. Тест ANOVA, Mann–Whitney U-test и Duncan test для сравнения различий между группами. СО — синдром отмены; н.д. — не достоверны.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

ГТС-201, гексаметилендиамид бис(-N-гексаноил-L-серил-L-лизина), миметик 2-й петли BDNF, был изучен на лабораторных крысах в отношении способности воздействовать на различные соматические, поведенческие и неврологические признаки состояния зависимости от морфина. В тесте ПКЛ ГТС-201, вводимый в дозе 5 мг/кг, показал умеренную тенденцию (р = 0,1) снижать число заходов и время пребывания в открытых рукавах лабиринта. Показана способность ГТС-201 устранять или снижать выраженность отдельных проявлений СО морфина у крыс, таких как диарея, вокализация, попытки бегства и судороги. Пептид, используемый однократно, в дозах 1 или 5 мг/кг, частично восстанавливал уровень тактильного порога у крыс, сниженный после отмены морфина. ГТС-201, вводимый животным хронически в дозе 1,0 мг/кг, устранял падение массы тела, вызванное отменой морфина. Несмотря на отмеченные изменения в отдельных показателях, СИ СО морфина для разных экспериментальных групп не различались статистически значимо в сравнении с группой активного контроля. Сравнение результатов, полученных при изучении дипептида ГТС-201, с соответствующими ранее представленными данными для миметика 4-й петли BDNF, ГСБ-106, показали заметное преимущество последнего как средства снижающего выраженность поведенческих проявлений СО морфина у крыс. Предполагается, что обнаруженная антиаддиктивная активность дипептида ГТС-201 может быть опосредована активацией TrkB-рецепторов и MAPK/Erk-киназного сигнального пути, что не исключает участия опиоидных рецепторных механизмов в реализации отмеченных поведенческих феноменов.

ДОПОЛНИТЕЛЬНАЯ ИНФОРМАЦИЯ

Вклад авторов. Все авторы внесли существенный вклад в разработку концепции, проведение исследования и подготовку статьи, прочли и одобрили финальную версию перед публикацией. Вклад каждого автора: М.А. Константинопольский, Л.Г. Колик, И.В. Чернякова, Н.М. Сазонова — написание статьи, анализ данных; Т.А. Гудашева — разработка общей концепции.

Конфликт интересов. Авторы декларируют отсутствие явных и потенциальных конфликтов интересов, связанных с публикацией настоящей статьи.

Источник финансирования. Авторы заявляют об отсутствии внешнего финансирования при проведении исследования.

Об авторах