Sedative effect of U-49900 (3,4-dichloro-N- (2-(diethylamino)cyclohexyl)-N-methyl-benzamide) in adult Zebrafish

Full Text

ОБОСНОВАНИЕ

Опиоиды, в том числе нефентаниловые циклогексилбензамиды, часто употребляемые наркотические вещества [1]. Препарат 3,4-дихлор-N-(2-(диэтиламино)циклогексил)-N-метилбензамид (U-49900) (рис.) представляет собой аналог синтетического опиоида U-47700, вызывает у человека абстиненцию и (при хроническом использовании) потерю вкуса, обоняния и осязания [2]. Данное соединение внесено в список сильнодействующих и наркотических средств во многих странах [3], включая США, Швецию, Испанию [2] и (с 2017 г.) Россию. Ввиду растущего злоупотребления опиатов в мире [1] их изучение становится важной биомедицинской задачей, в том числе в клинических и доклинических исследованиях. Однако, несмотря на данные об эффектах U-47700 у грызунов [2], сведения о действии его аналога U-49900 на животных моделях практически отсутствуют.

Наряду с грызунами, в доклиническом скрининге химических соединений широко используют рыбу зебраданио (zebrafish, Danio rerio), ставшую незаменимым модельным объектом в биомедицине. Наряду с невысокой стоимостью, быстрым развитием, прозрачностью эмбрионов, морфологической, физиологической и генетической гомологией с человеком [4], а также чувствительностью к основным классам препаратов, зебраданио также демонстрируют обучение [5], социальность [6] и сложное поведение [7]. В силу отсутствия данных о нейротропных эффектах U-49900 цель настоящего исследования состояла в изучении его воздействия при остром введении на поведение и двигательную активность взрослых рыб зебраданио.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Анализ взаимосвязи структуры и активности имеет ключевое значение для прогнозирования биологических свойств химических соединений в базе данных PASSOnline, которая с точностью более 96 % предсказывает фармакологические профили лекарств, механизм действия, взаимодействия мишеней и побочные/токсические эффекты на основе библиотеки более 1 млн биологически активных веществ [8]. В работе проанализировано соединение U-49900 с использованием этого подхода для оценки рассчитанной вероятности (Pa) конкретных биологических активностей.

В исследовании использовано 83 зебраданио аутбредной популяции короткоплавникового дикого типа обоего пола в возрасте 4–6 мес., полученные от местного поставщика (Zootrade, Inc., Екатеринбург). Рыбы были акклиматизированы в течение не менее двух недель до начала экспериментов и содержались группами по 40 особей в 40-литровых аквариумах, заполненных чистой фильтрованной водой (температура — 25 ± 1 °С, pH 7,4). Освещение (950−960 люкс) обеспечивали потолочными светильниками, а световой день составлял 12 ч (09:00–21:00 [9]). Экспериментальных животных ранее не применяли в других экспериментах, кормили стандартным кормом (хлопьями Tetramin для аквариумных рыб) дважды в день. Выбор беспородной популяции дикого типа для настоящего исследования был основан на соображениях популяционной валидности и ее значимости для настоящего исследования. Хотя генетически контролируемые модели (например, инбредные линии рыб зебраданио) могут быть более воспроизводимой и надежной системой для нейрогенетических исследований, моделирование нарушений центральной нервной системы на животных подразумевает воспроизведение «реальных» болезней мозга человека, затрагивающих генетически гетерогенные популяции. Таким образом, использование аутбредной линии рыб в данной работе обосновано с популяционной и трансляционной точек зрения.

Эксперименты проводили с 10:00 до 17:00 в тесте «нового аквариума», хорошо валидированном для анализа локомоторных и других поведенческих фенотипов зебраданио [10]. Перед тестированием выполняли инкубацию рыб по 1 штуке в пластиковом стакане емкостью 0,5 л в течение 20 мин в растворе, содержащем U-49900 в разных концентрациях, разведенном в 0,1% диметилсульфоксиде (ДМСО), в данной концентрации не влияющем на поведение зебраданио [11]. Контрольные рыбы подвергались действию раствора ДМСО без препарата. Вещество U-49900 (Россия) было получено от таможенной службы РФ в рамках исследовательских контрактов с Уральским федеральным университетом.

Экспериментальные животные случайным образом разделены на контрольную и экспериментальные группы: 1, 5, 10 и 25 мг/л (n = 16–19 в группе). Концентрации определены на основе собственных пилотных экспериментов по тестированию широкого диапазона острых эффектов U-49900 на зебраданио. Стандартная 20-минутная экспозиция выбрана на основе опыта работы с различными психотропными препаратами.

После инкубации с препаратом поведение рыб исследовали в тесте «нового аквариума», аппарат которого составлял прямоугольный резервуар объемом 1,5 л (15×20×5 см), заполненный водой и разделенный на две равные части виртуальной горизонтальной линией. Поведение рыб записывали на веб-камеру SJ4000 и полученные материалы обрабатывали в программе RealTimer (Open Science, Ltd., Красногорск, Россия). Оценивали количество, продолжительность (с) и латентный период эпизодов замирания (фризинга), латентный период (с) первого выхода в верхнюю часть аквариума, количество выходов наверх и их общую продолжительность (с), а также количество беспорядочных движений (хаотичные движения с высокой скоростью и ускорением, являющиеся маркером тревожного поведения) [12]. Фризинг определяли как полную неподвижность рыбы, за исключением движения жаберных крышек и глаз, более 2 с. Для оценки уровня двигательной активности, общее пройденное расстояние (м), число и продолжительность состояний высокой подвижности подсчитывали с помощью программы Noldus Ethovision XT11 (Wageningen, Нидерланды). Траектории движения зебраданио были также построены в Ethovision XT11 и сохранены в формате JPEG для наглядной иллюстрации пространственных паттернов активности рыб. Полулетальную дозу ЛД₅₀ препарата определяли путем инкубации групп из 30 рыб в различных концентрациях в течение 24 ч.

Группы сравнивали в программе Statistica 10.0 с помощью непараметрического критерия Краскела – Уоллиса с последующим попарным сравнением рангов групп с применением теста Манна – Уитни с поправкой Бонферрони. Данные представлены как среднее ± стандартная ошибка среднего. Различия считали статистически значимыми при p < 0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Препарат U-49900 демонстрирует выраженную нейротропность в тесте «нового аквариума», статистически достоверно влияя на ряд параметров поведения зебраданио, которые отражают уровень их локомоторной активности (см. рис., табл. 1). В частности, в концентрации 25 мг/л U-49900 на 95,79 % уменьшилась частота выходов зебраданио в верхнюю часть аквариума без изменения продолжительности и латентного периода выхода, что свидетельствует о снижении уровня локомоции рыб после воздействия вещества. В концентрации 25 мг/л U-49900 наблюдалось также 75 % уменьшение общей пройденной дистанции по сравнению с контрольной группой, что подтверждает седативный профиль данного препарата. При этом не отмечено значимых различий в частоте отражающих тревожность беспорядочных движений и фризинга во всех группах (см. табл. 1). ЛД₅₀ для тестируемого препарата U-49900 составила 15 мг/л.

 

Таблица 1. Влияние U-49900 на поведенческие реакции зебраданио в 5-минутном тесте «нового аквариума»

Table 1. Effect of U-49900 on the behavioral responses of zebrafish in the 5-minute new aquarium test

Показатель	Контроль (n = 16)	1 мг/л (n = 16)	5 мг/л (n = 16)	10 мг/л (n = 16)	25 мг/л (n = 15)	Значение критерия Краскела – Уоллиса H (4,79), р
Параметры, подсчитанные с помощью программного обеспечения Ethovision XT
Пройденная дистанция, м	19,0 ± 1	17,0 ± 0,9	15,7 ± 0,9	15,0 ± 0,1	0,8 ± 0,1*** # @A	37,5, p = 0,00001
Параметры, подсчитанные с помощью программного обеспечения RealTimer
Частота выходов наверх	28,0 ± 4,6	19,0 ± 2,6	17,0 ± 2,8	17,0 ± 2,7	7,0 ± 1,6***#A	23,3, p = 0,0001
Продолжительность выходов наверх, с	99,0 ± 10,8	77,0 ± 12,4	78,0 ± 16,6	78,0 ± 12,6	53,0 ± 17	7,8, p = 0,1
Общее количество хаотических движений	1,2 ± 0,8	1,1 ± 0,5	0,9 ± 0,3	0,9 ± 0,7	0,0 ± 0,0##@	11,9, p = 0,02
Число актов фризинга	0,1 ± 0,1	0,1 ± 0,1	0,0 ± 0,0	0,3 ± 0,2	1,6 ± 0,6#	21,2, p = 0,0003
Суммарная продолжительность фризинга, с	2,5 ± 2,5	2,2 ± 2,2	0,0 ± 0,0	23,0 ± 15,0	52,0 ± 22,0#A	20,0, p = 0,0005
Латентный период выхода в верхнюю часть аквариума, с	47,0 ± 9,6	62,0 ± 14,3	58,0 ± 13,0	76,0 ± 13,4	50,0 ± 22,0	9,4, p = 0,05
Латентный период фризинга, с	282,0 ± 18,0	282 ± 17,6	300,0 ± 0,0	248,0 ± 28,3	143,0 ± 39,0#@	22,2, p = 0,0002

Примечание: ***р < 0,001 против контроля, ^#р < 0,05 против группы 1 мг/л, ^##р < 0,01 против группы 1 мг/л, ^@р < 0,05 против группы 5 мг/л, ^A р < 0,05 против группы 10 мг/л, тест Краскела – Уоллиса с последующим тестом Манна – Уитни с поправкой Бонферрони для попарного сравнения групп. Данные представлены как среднее ± стандартная ошибка среднего.

Note: ***p < 0.001 vs control; ^#p < 0.05 vs 1 mg/L group; ^##p < 0.01 vs 1 mg/L group; ^@p < 0.05 vs 5 mg/L group; ^A p < 0.05 vs 10 mg/L group; the Kraskell–Wallis test followed by the Mann–Whitney test with Bonferroni correction for pairwise comparison of groups. Data are presented as mean ± standard error of the mean.

 

По сравнению с острым введением морфина, воздействие которого у зебраданио проявляется в поведенческой активности при концентрации 2 мг/л [13], острое введение U-49900 снижает активность рыб в концентрации 25 мг/л (см. рис.), подтверждая сравнительно более слабую активность последнего в центральной нервной системе у зебраданио. Более того, высокие концентрации морфина (10 и 30 мг/л) не влияют на локомоцию зебраданио [14], но в концентрации 25 мг/л U-49900 вызвал седацию в настоящем исследовании (см. рис.), вследствие чего можно предположить его большую эффективность в высоких дозах по сравнению с морфином.

 

Рис. Влияние U-49900 на паттерны плавания рыб в тесте «новый аквариум»

 

Компьютерный анализ химической структуры U-49900 с использованием базы данных PASSOnline предсказал (табл. 2) с высокой вероятностью (Pa > 60 %) анксиолитические свойства U-49900, что в целом согласуется с его седативным действием на зебраданио (см. табл. 1).

 

Таблица 2. Вероятность биологической активности (Ра) препарата U-49900, рассчитанная с помощью базы данных PASSOnline (www.way2drug.com/passonline/)

Table 2. Probabilities of biological activity (Pa) of the drug U-49900, calculated using the PASSOnline database (www.way2drug.com/passonline/)

Pa	Биологическая активность
0,910	Антифобическое действие
0,890	Ингибитор тауриндегидрогеназы
0,826	Ингибитор НАДФН-пероксидазы
0,771	Ингибитор гликозилфосфатидилинозитол фосфолипазы D
0,783	Ингибитор убихинол-цитохром-с-редуктазы
0,735	Ингибитор фосфолипид-транслоцирующей АТФазы
0,707	Ингибитор L-глутаматоксидазы
0,671	Ингибитор 5-O-(4-кумароил)-D-хинат-3’-монооксигеназы
0,631	Ингибитор (S)-6-гидроксиникотиноксидазы
0,613	Ингибитор сульфитоксидазы
0,587	Ингибитор камфор-1,2-монооксигеназы
0,592	Ингибитор белка, ассоциированного с центромерой
0,601	Анксиолитическое (противоневротическое) действие
0,538	Активатор кальциевых каналов

 

Несмотря на обнаружение выраженных нейротропных седативных эффектов U-49900 (см. рис., табл. 1), настоящее исследование имеет несколько ограничений. Например, не изучали потенциальное молекулярное, геномное и протеомное воздействие U-49900 на зебраданио, а также индивидуальные различия [15]. В будущем целесообразно оценить эффекты хронического воздействия U-49900 на рыбах, грызунах и человеке, а также сопоставить возможное привыкание и развитие синдрома отмены, особенно в контексте опиоидергических эффектов препарата. Целесообразен также систематический анализ нейрохимических и фармакокинетических процессов в мозге зебраданио (например, через 1, 2, 6, 12, 24 и 48 ч после воздействия) для низких, средних и высоких доз в будущих доклинических исследованиях U-49900.

Еще один фактор — возможная потенциальная острая неспецифическая токсичность U-49900. Например, в пилотных исследованиях U-49900 нами не выявлено токсичности при применении концентрации 25 мг/л, но показана летальность 80–100 % после однократного острого 60-минутного воздействия в концентрации 50–100 мг/л (данные не приведены). Кроме того, после однократного острого 20-минутного введения 50–100 мг/л наблюдались выраженная атаксия и седативный эффект, а оцененная в настоящей работе ЛД₅₀ препарата составила 15 мг/л при 24-часовой экспозиции. Таким образом, преобладание седативного эффекта при остром воздействии нарастающих доз U-49900 на зебраданио могло маскировать анксиолитические эффекты этого препарата. Однако, поскольку острые дозы морфина и других опиоидов в малых количествах вызывают анксиолитические эффекты у людей [16], в дальнейшем нужна оценка более широкого диапазона низких доз этого вещества, чтобы оценить потенциальное анксиолитическое действие при однократном введении.

В целом седативный эффект U-49900 у взрослых зебраданио в концентрации 25 мг/л (см. рис., табл. 1) аналогичен эффектам U-47700, что позволяет предположить не только химическое, но и фармакологическое сходство данных синтетических опиоидов [17], для чего необходимы дальнейшие исследования данных препаратов. Способность U-49900 вызывать выраженные нейротропные седативные эффекты у зебраданио также согласуется с клиническими и доклиническими данными о синтетических препаратах, подчеркивая важность доклинического скрининга химических соединений на рыбах. Учитывая высокую консервативность мишеней для лекарств и сходство основных молекулярных сетей между рыбами, людьми и грызунами [18, 19], разработка скрининговых платформ на основе зебраданио может стать важной стратегией поиска путей терапии при состояниях, вызванных приемом синтетических препаратов [20].

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Таким образом, вещество U-49900 в концентрации 25 мг/л в течение 20 мин на 95,79 % уменьшает пройденную дистанцию и на 75 % количество выходов в верхнюю часть аквариума в тесте «нового аквариума» (р < 0,001) по сравнению с контрольной группой. Данный фенотип свидетельствует о седативном действии препарата на взрослых зебраданио. Препарат во всех исследуемых концентрациях не влиял на другие параметры в тесте «нового аквариума», но продемонстрировал ЛД₅₀ при концентрации 15 мг/л и 24-часовой инкубации. Проведенный in siliсo анализ U-49900 при помощи базы данных PASSOnline указывает на возможность анксиолитических свойств препарата, что косвенно соответствует его обнаруженной седативности и требует дальнейшего исследования.

ДОПОЛНИТЕЛЬНАЯ ИНФОРМАЦИЯ

Вклад авторов. Все авторы внесли существенный вклад в разработку концепции, проведение исследования и подготовку статьи, прочли и одобрили финальную версию перед публикацией. Т.О. Колесникова — концепция и дизайн исследования, сбор и обработка материалов, написание текста; В.А. Шевырин — анализ полученных данных, обзор литературы, внесение окончательной правки; С.Л. Хацко — сбор и обработка материалов, внесение окончательной правки; А.В. Калуев — концепция и дизайн исследования, анализ полученных данных, написание текста, внесение окончательных правок.

Финансирование. Исследование проведено при поддержке Научно-технологического университета «Сириус», проект № NRB-RND-2116.

Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии потенциального конфликта интересов, требующего раскрытия в данной статье.

ADDITIONAL INFORMATION

Author contribution. Thereby, all authors confirm that their authorship complies with the international ICMJE criteria (all authors have made a significant contribution to the development of the concept, research, and preparation of the article, as well as read and approved the final version before its publication). T.O. Kolesnikova — concept and design of the study, collection and processing of materials, writing the text; V.A. Shevyrin — analysis of the obtained data, literature review, making final corrections; S.L. Khatsko — collecting and processing materials, making final edits; A.V. Kalueff — concept and design of the study, analysis of the data obtained, writing the text, making final edits.

Funding source. The study has been supported by Sirius University of Science and Technology, project № NRB-RND-2116.

Conflict of interests. No conflict of interests is declared.

About the authors

T. O. Kolesnikova

Sirius University of Science and Technology; Ural Federal University

Email: Philimontani@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0002-5561-8583
SPIN-code: 8558-7887
Russian Federation, Sirius; Yekaterinburg

V. A. Shevyrin

Ural Federal University

Email: vadim.shevyrin@gmail.com
ORCID iD: 0000-0002-0369-0786
SPIN-code: 5899-6920

Cand. Sci. (Biology)

Russian Federation, Yekaterinburg

S. L. Khatsko

Ural Federal University

Email: hardscore@mail.ru
ORCID iD: 0000-0001-5921-6680
SPIN-code: 4973-7083
Russian Federation, Yekaterinburg

A. V. Kalueff

Sirius University of Science and Technology; Almazov National Medical Research Center

Author for correspondence.
Email: avkalueff@gmail.com
ORCID iD: 0000-0002-7525-1950
SPIN-code: 4134-0515

Dr. Sci. (Biology)

Russian Federation, 354340, Krasnodar Region, Sirius Federal Territory, Olimpiisky prospect, 1; Saint Petersburg

References

Supplementary files