Разработка метода выделения лизоцима из слюны человека
- Авторы: Кренев И.А.1, Берлов М.Н.1
-
Учреждения:
- ФГБНУ «Институт экспериментальной медицины»
- Выпуск: Том 28, № 2 (2025)
- Страницы: 40-47
- Раздел: Биологическая химия
- URL: https://ogarev-online.ru/1560-9596/article/view/281070
- DOI: https://doi.org/10.29296/25877313-2025-02-06
- ID: 281070
Цитировать
Открытый доступ
Доступ предоставлен
Только для подписчиков
Аннотация
Введение. Растущая антибиотикорезистентность диктует необходимость поиска альтернативных антимикробных препаратов. Среди перспективных прототипов – антимикробные полипептиды, в том числе лизоцим. Существующие методы выделения лизоцима человека менее разработаны в сравнении с методами получения лизоцима из других видовых источников.
Цель исследования – разработка простого и быстрого метода выделения лизоцима из слюны человека, который может быть реализован в условиях лабораторий, специализирующихся на биохимии пептидов и низкомолекулярных белков.
Материал и методы. Слюну человека обрабатывали NaCl, центрифугировали, пропускали через фильтры с диаметром пор
0,45 мкм, подвергали двухступенчатой твердофазной экстракции на картриджах C18 (элюция 20%-ным и 60%-ным ацетонитрилом), а также обращенно-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии на колонке C18 в градиенте ацетонитрила и рехроматографии. Гомогенность и соответствие молекулярной массы лизоцима подтверждали электрофорезом в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия. Ферментативную активность устанавливали с помощью турбидиметрического анализа в присутствии Micrococcus lysodeikticus. Наличие антимикробной активности выявляли методом наложения геля после электрофореза в кислой системе на гель с бактерией Listeria monocytogenes.
Результаты. Обработка слюны 62,5–1000 мМ NaCl не влияла на содержание общего белка в супернатантах после центрифугирования. Обработанную 0,5 М NaCl и профильтрованную слюну подвергали двухступенчатой твердофазной экстракции. После отделения компонентов, элюирующихся 20%-ным ацетонитрилом, использовали компоненты, элюирующиеся при 60% аце-тонитрила, для проведения высокоэффективной жидкостной хроматографии, в результате которой получили мажорный пик. Фракции, соответствующие мажорному пику, использовали для дополнительной очистки и анализа. Полученный препарат содержал белок, по молекулярной массе соответствующий лизоциму. Белок обладал мурамидазной активностью в отношении клеточных стенок M. lysodeikticus и антимикробной активностью в отношении L. monocytogenes.
Выводы. В настоящей работе удалось разработать простой метод выделения лизоцима из слюны человека (около 5 мкг очищенного белка из 1 мл слюны). Протокол сохраняет важнейшие биологические свойства лизоцима.
Полный текст
Открыть статью на сайте журналаОб авторах
И. А. Кренев
ФГБНУ «Институт экспериментальной медицины»
Автор, ответственный за переписку.
Email: il.krenevv13@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0001-7970-3291
SPIN-код: 1411-0962
аспирант, мл. науч. сотрудник, отдел общей патологии и патологической физиологии
Россия, Санкт-Петербург, 197022, ул. Акад. Павлова, 12М. Н. Берлов
ФГБНУ «Институт экспериментальной медицины»
Email: berlov.mn@iemspb.ru
ORCID iD: 0000-0001-5191-0467
SPIN-код: 9006-6127
кандидат биологических наук, ст. науч. сотрудник, отдел общей патологии и патологической физиологии
Россия, Санкт-Петербург, 197022, ул. Акад. Павлова, 12
Список литературы
- Ventola C.L. The Antibiotic Resistance Crisis: Part 1: Causes and Threats. P & T. 2015;40(4): 277–283.
- Ventola C.L. The Antibiotic Resistance Crisis: Part 2: Management Strategies and New Agents. P & T. 2015; 40(5): 344–352.
- Ghosh C., Sarkar P., Issa R., Haldar J. Alternatives to Conventional Antibiotics in the Era of Antimicrobial Resistance. Trends in Microbiology. 2019; 27(4): 323–338. doi: 10.1016/j.tim.2018.12.010.
- Fleming A. On a Remarkable Bacteriolytic Element Found in Tissues and Secretions. Proceedings of the Royal Society of Lon-don. Series B. 1922; 93: 306–317. doi: 10.1098/rspb.1922.0023.
- Ragland S.A., Criss A.K. From Bacterial Killing to Immune Modulation: Recent Insights into the Functions of Lysozyme. PLoS Pathogens. 2017; 13(9): e1006512. doi: 10.1371/jour-nal.ppat.1006512.
- Ferraboschi P., Ciceri S., Grisenti P. Applications of Lysozyme, an Innate Immune Defense Factor, as an Alternative Antibiotic. Antibiotics (Basel). 2021; 10(12): 1534. doi: 10.3390/antibiotics10121534.
- Shahmohammadi A. Lysozyme Separation from Chicken Egg White: a Review. European Food Research and Technology. 2018; 244: 577–593. doi: 10.1007/s00217-017-2993-0.
- Liu B.L., Ooi C.W., Ng I.S. et al. Effective Purification of Lysozyme from Chicken Egg White by Tris(hydroxyme-thyl)amino-methane Affinity Nanofiber Membrane. Food Chemistry. 2020; 327: 127038. doi: 10.1016/j.food-chem.2020.127038.
- Yao X., Du T., Guo J. et al. Extraction and Characterization of Lysozyme from Salted Duck Egg White. Foods. 2022; 11(22): 3567. doi: 10.3390/foods11223567.
- Mohamed R., Campbell J.L., Cooper-White J. et al. The Impact of Saliva Collection and Processing Methods on CRP, IgE, and Myoglobin Immunoassays. Clinical and Translational Medicine. 2012; 1(1): 19. doi: 10.1186/2001-1326-1-19.
- Jenzano J.W., Hogan S.L., Lundblad R.L. Factors Influencing Measurement of Human Salivary Lysozyme in Lysoplate and Turbidimetric Assays. Journal of Clinical Microbiology. 1986; 24(6): 963–967. doi: 10.1128/jcm.24.6.963-967.1986.
- Bradford M.M. A Rapid and Sensitive Method for the Quantitation of Microgram Quantities of Protein Utilizing the Principle of Protein-Dye Binding. Analytical Biochemistry. 1976; 72: 248–254. doi: 10.1006/abio.1976.9999.
- Schägger H., von Jagow G. Tricine-Sodium Dodecyl Sulfate-Polyacrylamide Gel Electrophoresis for the Separation of Pro-teins in the Range from 1 to 100 kDa. Analytical Biochemistry. 1987; 166(2): 368–379. doi: 10.1016/0003-2697(87)90587-2.
- Mörsky P. Turbidimetric Determination of Lysozyme with Micrococcus lysodeikticus Cells: Reexamination of Reaction Conditions. Analytical Biochemistry. 1983; 128(1): 77–85. doi: 10.1016/0003-2697(83)90347-0.
- Lehrer R.I., Rosenman M., Harwig S.S. et al. Ultrasensitive Assays for Endogenous Antimicrobial Polypeptides. Journal of Immunological Methods. 1991; 137(2): 167–173.
- doi: 10.1016/0022-1759(91)90021-7.
- Panyim S., Chalkley R. The Heterogeneity of Histones. I. A Quantitative Analysis of Calf Histones in Very Long Polyacrylamide Gels. Biochemistry. 1969; 8(10): 3972–3979. doi: 10.1021/bi00838a013.
- Schipper R.G., Silletti E., Vingerhoeds M.H. Saliva as Research Material: Biochemical, Physicochemical and Practical Aspects. Archives of Oral Biology. 2007; 52(12): 1114–1135. doi: 10.1016/j.archoralbio.2007.06.009.
Дополнительные файлы
