Cytogenetic Violations in Blood Lymphocytes of Macaca Mulatta Monkeys in the Long Term after Irradiation with Accelerated Krypton Ions

Texto integral

На современном этапе развития космической радиобиологии перед исследователями стоят задачи определения критических параметров, ограничивающих работу космических экипажей за пределами магнитосферы Земли. Появились литературные данные, указывающие на уязвимость центральной нервной системы к воздействию космической радиации и возможному нарушению когнитивных функций у животных [1-2]. В ходе выполнения межпланетных экспедиций возрастает риск облучения экипажа ускоренными тяжелыми заряженными частицами (ТЗЧ) высоких энергий. Вероятность радиационного поражения в этих условиях рассматривается как результат действия ТЗЧ на критические структуры центральной нервной системы, что, в свою очередь, может вызвать изменения высших интегративных функций мозга и привести к нарушениям операторской деятельности экипажей. Это обусловило формирование новой концепции радиационного риска для пилотируемых полетов в дальнем космосе [3].

Спектр галактических космических лучей (ГКЛ) состоит из высокоэнергетических протонов и ТЗЧ с энергиями вплоть до сверхвысокого порядка 10²⁰ МэВ. Именно ускоренные ионы обладают высокой биологической эффективностью и, несмотря на низкие флюенсы, вносят определяющий вклад в радиационный риск для космонавтов. Защититься от таких высокоэнергетических излучений в условиях космического корабля чрезвычайно сложно. Воздействие этих излучений в наземных условиях возможно смоделировать, используя излучение ускорителей, генерирующих заряженные частицы с энергиями, соответствующими ГКЛ. В связи с планами по подготовке к полетам на Марс и изучением воздействия космической радиации, представляющей собой потенциальную угрозу для здоровья космонавтов, увеличилось число проводимых экспериментов на приматах. Только в США количество проведенных в 2016 г. экспериментов на нечеловекообразных обезьянах выросло на 15 ٪ [4]. В ходе текущего исследования проведен эксперимент по локальному облучению ускоренными ионами криптона головы обезьян Macaca mulatta и, соответственно, головного мозга, обеспечивающего и определяющего состояние когнитивных функций приматов. Определенный интерес в данном исследовании представляет анализ хромосомных аберраций, который является характерным и стабильным показателем воздействия радиации на клетки млекопитающих и может служить ретроспективным маркером в отдаленные сроки после облучения.

Работа выполнена в коллаборации с коллегами из Института медицинской приматологии ФГБУ “НИЦ “Курчатовский институт” и Института медико-биологических проблем РАН в рамках изучения поведенческих реакций и когнитивных функций у обезьян Macaca mulatta в условиях радиационного воздействия в соответствии с Программой подготовки межпланетных пилотируемых полетов.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Исследование проводили на 12 обезьянах-самцах вида Macaca mulatta в возрасте до 3 лет и средним весом 3 кг на момент облучения.

На первом этапе эксперимента животные были разделены на две группы. Группа из 12 обезьян являлась обобщенным контролем, часть из которых (пять особей) в последующем были облучены и составили вторую группу. В экспериментальной группе одна обезьяна (№ 383, ИМБП, Москва) за 3 мес. до облучения головы ионами ⁷⁸Kr находилась на протяжении 7 сут в условиях антиортостатической гипокинезии. Четыре обезьяны экспериментальной группы из питомника Института медицинской приматологии (г. Адлер) перед облучением головы животных ионами ⁷⁸Kr перенесли транспортировку самолетом Адлер–Москва.

Контрольную группу приматов разбили на несколько подгрупп, поскольку животные находились в разных городах (питомник в Адлере, виварий в Москве). Первую подгруппу (контроль со стрессом) составили четыре обезьяны, которые перенесли транспортировку самолетом Адлер–Москва, и перед облучением у них был произведен забор венозной крови. Во вторую подгруппу (контроль Адлер) вошли две обезьяны из питомника Института медицинской приматологии ФГБУ “НИЦ “Курчатовский институт”, которые не покидали своего места расположения. Третья подгруппа (контроль (ИМБП)) —это шесть обезьян из Института медико-биологических проблем РАН. Вторая и третья подгруппы животных служили в качестве контроля на протяжении всего эксперимента.

Перед началом эксперимента животные прошли соответствующий карантин и обследование на наличие патогенной микрофлоры и гельминтов. Все работы с обезьянами проводились в соответствии с требованиями Европейской Конвенции о защите позвоночных животных, используемых для экспериментов или иных целей, ETS № 123, и директивы № 2010/63/ EU, принятой Европейским парламентом 22 сентября 2010 г. Разрешение на проведение работ было получено от Комитета по биоэтике ФГБНУ “Научно-исследовательский институт медицинской приматологии” (Протокол №11 от 01.11.2017 г.), который создан и работает в соответствии с требованиями законодательства Российской Федерации, и одобрено заключением комиссии по биоэтика ГНЦ РФ — ИМБП РАН /(№ 461 от 04.12.2017 г.).

Однократное облучение обезьян Macaca mulatta ионами ⁷⁸Kr проводили на “Нуклотроне” Лаборатории высоких энергий Объединенного института ядерных исследований (Дубна) [5]. Для облучения животных привозили из питомника обезьян Института медицинской приматологии ФГБУ “НИЦ “Курчатовский институт” (Сочи) и Института медико-биологических проблем (Москва). После облучения животных возвращали в исходные условия проживания, которые были аналогичными для обеих групп.

Пучок ядер криптона направлялся в область головы с затылочной части черепа. Основная часть потока облучения приходилась на гиппокамп, т.е. были облучены только локальные участки мозга. Пучок в месте облучения обезьян был узким и имел в сечении форму, близкую к эллипсу. Расчет средней линейной передачи энергии (ЛПЭ) ядер криптона проводился с учетом затылочной кости мозга толщиной 0.5 см и плотностью 1.85 г/см³ и составил 260 кэВ/мкм. Поток ядер криптона, необходимый для создания в мозге поглощенной дозы 1 Гр, равен 2.4·10⁶ ядер/см². Измерение потока частиц, прошедших через мозг обезьян, осуществлялось с помощью пролетной ионизационной камеры, предварительно градуированной в этом пучке ядер криптона по показаниям сцинтилляционного счетчика, устанавливаемого на пучок. Чувствительность камеры к ядрам ⁷⁸Кг с энергией 2.3 ГэВ/н составила 14.0 ядра на 1 импульс камеры. Фоновый счет камеры составлял менее 1٪. В ходе облучения через мозг обезьян прошло от 7.365·10⁶ до 8.336·10⁶ ядер. Длительность облучения обезьян составила 5–8 мин. Локальная доза облучения составила около 3 Гр. Доза усредненная по всему мозгу обезьян, оценивается примерно в 0.15 Гр (расчетная масса мозга обезьян считалась равной 100 г).

Отдельно проведено облучение лимфоцитов крови in vitro у трех контрольных обезьян Macaca mulatta на пучке фазотрона Медико-технического комплекса Лаборатории ядерных проблем ОИЯИ протонами с исходной энергией 170 МэВ в дозах 1, 2, 3, 4 и 5 Гр при мощности 0.4 Гр/мин.

Забор венозной крови у животных выполняли в разные сроки после облучения головы обезьян. Через 1, 40, 96 и 460 сут после облучения забор крови из вены осуществляли у всех облученных животных, а на 7-е и 350-е сутки – только у обезьяны № 383, которая обитала в виварии ИМБП. Во время взятия крови обезьяны находились под наркозом. Анестезия использовалась на всех сроках забора крови у обезьян. Транквилизацию обезьян проводили с помощью комбинации препаратов “Ксила” (Interchemie, Голландия), 0,1 мл/кг веса животного, и “Золетил” (Virbac, Франция), 0,05 мл/кг веса животного. Венозную кровь животных отбирали в специальные одноразовые стерильные вакуумные пробирки с гепарином (BD Vacutainer® Plus). Образцы крови доставляли в Лабораторию радиационной биологии (г. Дубна), где осуществлялись все процедуры по культивированию, приготовлению цитогенетических препаратов и анализу хромосомных нарушений в лимфоцитах крови обезьян Macaca mulatta. Лимфоциты культивировали в соответствии со стандартным протоколом [6] с некоторой модификацией методики. Использовали полную питательную среду RPMI-1640 с добавлением 20٪ фетальной телячьей сыворотки, 1٪ глютамина и 2٪ антибиотика. Для стимуляции клеток к вступлению в митоз добавляли в полную питательную среду 4٪ фитоггемаглютинина (PHA, Sigma-Aldrich) и 0.05٪ форбол-12-миристат-13-ацетата (PMA, Sigma-Aldrich). Инкубацию клеточной культуры осуществляли в атмосфере с содержанием 5٪ CO₂.

Для накопления клеток на стадии метафазы использовали ингибитор образования веретена деления колцемид, который добавляли за 2 ч до фиксации в конечной концентрации 0.12 мкг/мл. После осаждения лимфоцитов центрифугированием проводили гипотоническую обработку 0.075 моль/л раствором KCl. Клетки фиксировали свежеприготовленной и охлажденной до –20°С смесью метанола и ледяной уксусной кислоты (3 : 1). Классификацию хромосомных нарушений проводили по общепринятой методике, рекомендованной МАГАТЭ [7].

Препараты лимфоцитов готовили раскапыванием клеточной суспензии на влажные стекла с последующим их окрашиванием свежеприготовленным 3٪-ным раствором Гимза на фосфатном буфере. Для анализа лимфоцитов общепринятым метафазным методом использовали стандартные световые микроскопы (Olympus CX41). В анализ включали все встреченные полные метафазы с числом хромосом 42 ± 1 и хорошим разбросом хромосом. Неполные метафазы и метафазы с множественными наложениями из анализа исключались. Учитывали все виды хромосомных аберраций, выявляемых без проведения кариотипирования. При анализе хромосомных нарушений к дицентрику и центрическому кольцу относили по одному сопутствующему фрагменту.

У животных проанализированы цитогенетические показатели через 1, 7, 40, 96 и 460 сут после облучения головы обезьяны ионами ⁷⁸Kr. Для каждого образца просчитывали от 500 до 1000 клеток. Общее количество клеток, просчитанных для контрольных обезьян, составило более 11000 клеток, а для облученных — более 19000. Отдельно было просчитано более 4000 клеток крови, облученной in vitro протонами с энергией 170 МэВ.

Гематологический анализ крови обезьян проводили на анализаторе фирмы Beckman 5 diff, USA.

Статистический анализ полученных данных проводился с использованием программы Microsoft Office Excel. Данные на графиках и таблицах представлены как среднее арифметическое результатов, полученных для каждого животного в группе по всем исследуемым параметрам. Частоту хромосомных нарушений рассчитывали на 100 клеток. Статистическая неопределенность измеренного числа хромосомных аберраций была рассчитана с учетом количества проанализированных метафаз как √(n/N), где n — общее количество выявленных аберраций, а N — общее количество проанализированных клеток. Результаты гематологических и физиологических показателей представлены как средние значения экспериментов ± стандартная ошибка.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Анализ хромосомных аберраций у контрольных животных разных подгрупп не выявил существенных отличий по их уровню и спектру. Это позволило обобщить данные по спонтанному уровню хромосомных нарушений, которые в дальнейшем использовали для сравнения выхода хромосомных аберраций у облученных обезьян (табл. 1).

 

Таблица 1. Хромосомные нарушения в лимфоцитах крови обезьян Macaca mulatta

Table 1. Chromosomal abnormalities in blood lymphocytes of Macaca mulatta monkeys

Показатель	Число обезьян	Просчитано клеток	Клетки с аберрациями, %	Число аберраций, на 100 клеток	Аберрации, на 100 клеток
					хроматидные	хромосомные
Контроль со стрессом (транспортировка Адлер–Москва)	4	4000	1.48 ± 0.12	1.48 ± 0.12	0.95 ± 0.10	0.53 ± 0.07
Контроль (Адлер)	2	2400	1.92 ± 0.14	2.08 ± 0.14	1.46 ± 0.12	0.63 ± 0.08
Контроль (ИМБП)	6	4730	1.72 ± 0.13	1.77 ± 0.13	1.27 ± 0.11	0.50 ± 0.07
Обобщенный контроль	12	11130	1.67 ± 0.13	1.73 ± 0.13	1.20 ± 0.11	0.53 ± 0.07

 

Данные цитогенетического анализа хромосомных нарушений в лимфоцитах крови обезьян Macaca mulatta контрольной группы выявили низкий уровень хромосомных аберраций. Среднее количество клеток с хромосомными нарушениями для всего исследованного контроля не превышало 1.67٪. В аберрантных клетках, как правило, регистрировалось не более одной аберрации. Сопоставимые данные по анализу спонтанного уровня хромосомных аберраций в лимфоцитах крови обезьян Macaca mulatta были получены в работе [8]. Основную долю встреченных хромосомных нарушений (до 72٪) составляли аберрации хроматидного типа. Среди них превалирующими оказывались фрагменты.

Количество клеток с дицентриками и центрическими кольцами, встреченных при анализе контрольных образцов, не превышало 0.02 на 100 клеток. Уровень спонтанно возникающих дицентриков в лимфоцитах крови человека, являющийся нормой по рекомендации МАГАТЭ [7], составляет 1 на 1000 клеток. Наблюдаемые в лимфоцитах крови контрольных обезьян Macaca mulatta показатели низкого уровня как общего количества возникающих хромосомных аберраций, так и дицентриков, являющихся маркерами радиационного воздействия, коррелируют с аналогичными показателями, характерными для лимфоцитов крови человека, не подвергавшихся воздействию ионизирующего излучения. При цитогенетическом анализе также проводилась оценка модального числа хромосом в клетках. По литературным данным кариотип обезьяны Macaca mulatta представлен 42 хромосомами [9]. У всех просчитанных образцов модальным числом хромосом являлось 42. При этом как у контрольных, так и у облученных обезьян были встречены полиплоидные клетки. В среднем их уровень не превышал 1–3٪.

Проведенный цитогенетический анализ лимфоцитов периферической крови обезьян, подвергшихся воздействию ускоренных ионов ⁷⁸Kr в дозе около 3 Гр, позволил выяснить, что средний уровень аберрантных клеток у локально облученных обезьян через сутки после облучения вырос почти в 2.7 раза по сравнению с контролем (рис. 1). Спустя 7 сут после облучения головы обезьян ионами криптона количество клеток и общее число хромосомных нарушений снизилось на 10–15٪ и составило 3.9 и 4.6 соответственно, превышая контрольный уровень в 2.3 и 2.6 раза.

 

Рис. 1. Данные цитогенетического анализа лимфоцитов периферической крови обезьян, подвергшихся локальному воздействию ускоренных ионов 78Kr в дозе 3 Гр в разные сроки наблюдений.

Fig. 1. Cytogenetic analysis of peripheral blood lymphocytes of monkeys locally exposed to 3 Gy of accelerated ⁷⁸Kr ions at different observation times.

 

Основную долю аберраций представляли хроматидные и хромосомные фрагменты до 80٪. На 7-е и 350-е сутки исследования данные представлены только по одной обезьяне, к сожалению, не было возможности провести исследование у остальных облученных животных. Индивидуальные показания обезьян на каждом сроке исследования представлены в табл. 2.

 

Таблица 2. Хромосомные нарушения в лимфоцитах крови обезьян Macaca mulatta на разные сроки после облучения головы обезьян ионами криптона

Table 2. Chromosomal abnormalities in blood lymphocytes of Macaca mulatta monkeys at different times after irradiation of the monkeys’ heads with krypton ions

№ исследуемых обезьян	Срок исследования, сутки	Просчитано клеток	Клетки с аберрациями, %	Количество аберраций, на 100 кл.	Дицентрики и кольца, на 100 кл.	Фрагменты, на 100 кл.
42118	1	1000	5.20	5.80	0.40	2.50
42031		1000	6.00	7.30	0.50	5.00
41930		1000	3.70	3.90	0	2.80
42090		1000	3.70	4.40	0.20	2.60
383		1000	4.00	4.00	0	2.20
Среднее за 1 сут		5000	4.52 ± 0.21	5.08 ± 0.22	0.22 ± 0.05	3.02 ± 0.17
383	7	1000	3.90 ± 0.20	4.60 ± 0.21	0.30 ± 0.05	3.20 ± 0.18
42118	40	1000	3.80	3.90	0.40	2.20
42031		1000	3.50	3.70	0.40	2.50
41930		1000	2.20	2.20	0.30	1.20
42090		1000	2.40	2.50	0.20	1.60
383		1000	2.90	3.10	0.10	1.70
Среднее за 40 сут		5000	2.96 ± 0.17	3.08 ± 0.17	0.28 ± 0.05	1.84 ± 0.14
42118	96	1000	2.70	2.90	0.20	1.90
42031		1000	3.50	3.80	0.40	2.50
41930		1000	2.50	2.70	0.10	1.70
42090		1000	2.70	2.80	0.40	2.00
383		1000	2.10	2.30	0	1.80
Среднее за 96 сут		5000	2.70 ± 0.16	2.90 ± 0.17	0.22 ± 0.05	1.98 ± 0.14
383	350	690	2.61 ± 0.16	2.61 ± 0.16	0.14 ± 0.03	1.16 ± 0.09
42118	460	1000	4.87	5.23	0.36	3.97
42031		883	2.94	3.17	0.45	1.81
41930		1000	2.50	2.60	0.20	1.70
42090		1000	2.20	2.30	0.30	1.80
383		1000	2.60	2.80	0.40	1.90
Среднее за 460 сут		4437	3.00 ± 0.18	3.20 ± 0.17	0.32 ± 0.05	2.24 ± 0.13

 

При исследовании хромосомных нарушений в первые сроки после облучения (1-е и 7-е сутки) практически у каждой обезьяны были встречены клетки с многочисленными аберрациями в одной клетке (от 2 до 5). В дальнейшем вплоть до 96-х суток происходит снижение клеток с хромосомными аберрациями и уменьшение количества клеток с множественными аберрациями. В отдаленные сроки исследования встречаются только единичные клетки с двумя аберрациями. Полученные результаты согласуются с имеющимися в литературе данными по снижению уровня хромосомных нарушений у человека, проанализированными после инцидента с тотальным воздействием γ-излучений в разных дозах [10].

К 460-м суткам исследования средний уровень хромосомных нарушений сохранялся повышенным, превышая показатели необлученного контроля в 1.8 раза. При этом отмечается незначительное повышение среднего уровня хромосомных нарушений по сравнению с предыдущим сроком исследования. Значительный вклад в это повышение вносили две обезьяны (42118 и 42031), у которых на протяжении всего эксперимента наблюдался более высокий уровень клеток с хромосомными нарушениями по сравнению с остальными облученными обезьянами (табл. 2). Стоит отметить, что у остальных обезьян в отдаленные сроки после облучения отсутствовали клетки с множественными аберрациями, тогда как у двух обезьян (42118 и 42031) на каждом сроке исследования до 5٪ клеток от общего числа аберрантных клеток были клетками с двумя и более аберрациями, и данное соотношение сохранялось на протяжении всего исследуемого срока. Сохранение повышенного уровня структурных повреждений хромосом наблюдали в более ранних работах на обезьянах Macaca mulatta. Было показано сохранение в костном мозгу животных, переживших общее разовое и длительное γ-облучение в дозе 410-650 Р, повышенного уровня спустя 9–13 лет [11, 12]. А повышенный уровень хромосомных транслокаций в лимфоцитах крови облученных обезьян сохранялся через 28 лет после облучения [13].

Результаты анализа дицентриков и центрических колец показали, что через 1 сут после локального облучения ионами криптона средний уровень дицентриков и центрических колец вырос в более чем 11 раз по сравнению с контролем и оставался повышенным на протяжении всех сроков исследования. К 460-м суткам исследования маркеры радиационного воздействия все еще превышали показатели контрольного уровня. Уровень хроматидных и хромосомных фрагментов к этому сроку также снизился. Вместе с тем на 460-е сутки отмечено увеличение числа хромосомных фрагментов по сравнению с предыдущим сроком наблюдений с 0.30 до 0.75 на 100 клеток.

Проведенное исследование позволило оценить динамику снижения клеток с хромосомными аберрациями. В течение первых трех месяцев после локального облучения головы обезьян уровень хромосомных аберраций снизился на 40٪. Примечательно, что даже после локального облучения головы обезьян уровень дицентриков и центрических колец сохраняется повышенным на протяжении всего периода наблюдения без какой-либо тенденции к их снижению. Аналогичные результаты по сохранению хромосомных нарушений наблюдались в лимфоцитах детей и подростков, проживавших на радиоактивно загрязненных областях в течение 17 лет после Чернобыльской аварии [14].

Снижение общего числа хромосомных аберраций, по всей видимости, связано с элиминацией из циркулирующей крови клеток с нестабильными хромосомными аберрациями. Сохранение в лимфоцитах крови повышенного по сравнению с контролем уровня дицентриков и иных типов хромосомных аберраций через 460 суток после облучения головы обезьян Macaca mulatta, скорее всего, указывает на существование фракции лимфоцитов с разной продолжительностью жизни, которая может варьировать от 15 дней до 6 лет [15].

Метод биологической дозиметрии, основанный на оценке хромосомных аберраций в лимфоцитах периферической крови, зарекомендовал себя надежным показателем, поскольку количество аберраций, вызванных ионизирующим излучением, соответствует поглощенной дозе. Исследование дозовой зависимости выхода хромосомных аберраций, регистрируемых в лимфоцитах периферической крови обезьян, является важной задачей с целью определения поглощенной дозы в дальнейших планируемых модельных экспериментах на обезьянах Macaca mulatta при подготовке к полетам за пределами магнитосферы Земли и сопоставлении полученных данных с имеющимися таковыми для человека.

Ранее в нашей лаборатории получены результаты цитогенетического исследования клеток человека после облучения протонами разных энергий [16–18]. Данные после воздействия протонов с энергией 170 МэВ и 1 ГэВ на лимфоциты человека и обезьян при облучении крови in vitro представлены на рис. 2. Характер дозовой зависимости по выходу клеток с хромосомными аберрациями после воздействия протонов на лимфоциты обезьян имеет линейный вид вплоть до 4 Гр с последующим отклонением от линейности и выходом на уровень насыщения. Для общего числа хромосомных аберраций наблюдается степенная линейно-квадратичная зависимость от дозы вследствие вклада аберраций двухударного типа.

 

Рис. 2. Распределение дицентриков, центрических колец и фрагментов в разные сроки наблюдения.

Fig. 2. Distribution of dicentrics (Dic), centric rings (Rc), and fragments at different observation times.

 

Основной тип хромосомных аберраций, выявленных в лимфоцитах крови обезьян после облучения протонами с энергией 170 МэВ при анализе стандартным метафазным методом, составили дицентрики (до 35–40٪ от общего числа аберраций). Данные цитогенетического анализа хромосомных нарушений после облучения лимфоцитов крови in vitro свидетельствуют о широком спектре возникающих хромосомных аберраций, увеличении их выхода с увеличением дозы лучевого воздействия и отсутствии существенных количественных различий этих показателей у исследуемых обезьян.

Несомненно, полученные результаты представляют большой интерес. Как видно (рис. 3), кривые по частоте образования клеток с хромосомными аберрациями и общему числу аберраций хромосом практически идентичны, что подтверждает одинаковую радиочувствительность клеток человека и обезьян. В литературе имеются фрагментарные сведения о схожей радиочувствительности обезьян и человека после действия рентгеновского или γ-излучения [19].

 

Рис. 3. Дозовая зависимость частоты образования лимфоцитов с хромосомными аберрациями (а) и общего числа хромосомных аберраций (b) после облучения образцов цельной крови обезьян Macaca mulatta и человека протонами 170 МэВ (кривые красного и синего цвета) и 1 ГэВ (кривая зеленого цвета). Прерывистыми линиями представлены усредненные данные по лимфоцитам крови человека, сплошной линией представлены усредненные данные по лимфоцитам крови обезьян. Незакрашенные символы (квадратики и кружки) — данные для каждого отдельного донора (человека), закрашенные символы (треугольники) — данные для каждой особи обезьян.

Fig. 3. Dose dependence of the formation frequency of lymphocytes with chromosomal aberrations (a) and the total number of chromosomal aberrations (b) after irradiation of whole blood samples of Macaca mulatta monkeys and humans with 170 MeV (the red and blue curves) and 1 GeV (the green curve) protons. The dashed and solid lines represent the average data for human and monkey blood lymphocytes, respectively. The unfilled symbols (squares and circles) represent the data for each individual human donor; the filled symbols (triangles), for each individual monkey.

 

В ходе проведенного исследования были также проанализированы гематологические, биохимические, молекулярные и поведенческие реакции облученных животных. В результате локального облучения головы по ряду вышеперечисленных показателей были обнаружены изменения некоторых параметров. Данные этого исследования опубликованы в работе [20]. Следует отметить, что все показатели находились в пределах референсных значений для данного вида животных. К 163-м суткам зафиксировано возвращение до контрольных значений по основным гематологическим показателям (например, эритроцитам). Вместе с тем уровень лимфоцитов оставался повышенным на всех сроках наблюдения (рис. 4) и у двух обезьян превышал референсные значения. Возможно, незначительные колебания гематологических показателей связаны с реакцией на облучение мозга и, как следствие, возникновением местной воспалительной реакции тканей.

 

Рис. 4. Уровень эритроцитов и лимфоцитов в разные сроки наблюдений после локального облучения головы обезьян Macaca mulatta. Прерывистыми линиями обозначены референсные значения.

Fig. 4. Levels of red blood cells and lymphocytes at different observation times after local irradiation of the head of Macaca mulatta monkeys. The dashed lines indicate the reference values.

 

На протяжении всего эксперимента вес как контрольных, так и облученных обезьян постепенно увеличивался. У животных выявлена тенденция к более быстрому набору массы у облученных обезьян, что, возможно, может свидетельствовать о нарушении метаболизма (рис. 5).

 

Рис. 5. Динамика массы тела облученных и контрольных животных.

Fig. 5. Dynamics of the body weight of irradiated and control animals.

 

По поведенческим реакциям у некоторых облученных животных сформировались устойчивые отклонения от стандартного поведения обезьян. Наиболее выраженные патологии зафиксированы у двух самцов, которые проявлялись в виде эпизодических запрокидываний головы вверх и нехарактерных маятниковых движений тела [21]. Данные отклонения проявились в более поздние сроки наблюдения (460-е сутки) и сохранялись вплоть до 5 лет после облучения. Примечательно, что ряд авторов также отмечают влияние облучения на поведенческие реакции у грызунов и нарушения гиппокамп-зависимых форм поведения и обеспечивающих их нейрохимических и молекулярных механизмов [22—24]. В проведенном исследовании обращает на себя внимание возможная корреляция между поведенческими дисфункциями и повышенным уровнем хромосомных аберраций (в том числе дицентриков и центрических колец), который был обнаружен после локального облучения у одной обезьяны (42031) на протяжении всего эксперимента.

Результаты цитологического анализа после локального облучения головы обезьян ускоренными ионами криптона указывают на то, что поврежденные лимфоциты элиминируются частично, и продолжают циркулировать в кровеносном русле в течение длительного времени после облучения. Возможно, часть из них депонируются в лимфосистеме и выходят в кровеносное русло в поздние сроки наблюдения [25]. Примечательно, что в большинстве работ, посвященных ретроспективной оценке полученных доз в результате различных инцидентов, указывается на экспоненциальное снижение уровня хромосомных аберраций (дицентриков) со временем [26]. Вместе с тем полученные данные демонстрируют эффекты, отличные от стандартных типов облучений, и в ходе даже локального облучения ускоренными ионами могут формироваться более стойкие повреждения в организме животных, которые проявляются в повышении уровня хромосомных аберраций и в отклонении поведенческих реакциях в отдаленные сроки наблюдения.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Таким образом, проведенное исследование цитогенетических нарушений в лимфоцитах крови обезьян Масаса mulatta после локального воздействия ускоренных ионов криптона ⁷⁸Kr в дозе 3 Гр на область гиппокампа животных выявило сохраняющуюся хромосомную нестабильность в лимфоцитах периферической крови обезьян Macaca mulatta на протяжении 460 суток после облучения. Наибольший выход хромосомных аберраций отмечен через сутки после облучения с последующим их снижением на протяжении всего исследуемого срока. В отдаленные сроки у ряда облученных животных отмечались отклонения от стандартного поведения обезьян. У одного животного отмечается корреляция поведенческой дисфункции и повышенного уровня хромосомных аберраций.

На основе данных, полученных после облучения in vitro лимфоцитов крови обезьян Macaca mulatta протонами с энергией 170 МэВ в дозах 1–5 Гр, построены кривые зависимости доза–эффект по выходу хромосомных повреждений. Сопоставление данных хромосомных нарушений, обнаруженных в лимфоцитах крови обезьян и человека после облучения лимфоцитов крови in vitro протонами с энергией 170 МэВ в исследованных дозах не выявило существенных отличий, что указывает на одинаковую радиочувствительность исследуемых объектов.

БЛАГОДАРНОСТИ

Выражаем благодарность сотрудникам ГНЦ РФ ИМБП РАН и Института медицинской приматологии ФГБУ “НИЦ “Курчатовский институт”, осуществлявшим клиническое, научное и организационное обеспечение эксперимента на приматах, специалистам Медико-технического комплекса для протонной лучевой терапии Г.В. Мицыну, А.Г. Молоканову, С.В. Швидкому, обеспечившим дозиметрию и облучение обезьян протонами на фазотроне ЛЯП ОИЯИ, и сотрудникам ЛРБ ОИЯИ Г.Н. Тимошенко, В.А. Крылову и Е.Е. Павлику, осуществившим на нуклотроне ЛФВЭ ОИЯИ облучение обезьян ускоренными ионами криптона.

ФИНАНСИРОВАНИЕ

Работа выполнена в рамках темы ЛРБ ОИЯИ 05-7-1077-2009 и базовой темы РАН 65.2, FMFR-2024-0036.

Sobre autores

Igor Koshlan

Joint Institute for Nuclear Research; Dubna State University

Autor responsável pela correspondência
Email: koshlan@jinr.ru
ORCID ID: 0009-0000-1591-7418
Rússia, Dubna; Dubna

Nataliya Koshlan

Joint Institute for Nuclear Research

Email: nkoshlan@jinr.ru
ORCID ID: 0009-0004-9625-1572
Rússia, Dubna

Maria Isakova

Joint Institute for Nuclear Research

Email: isakova@jinr.ru
ORCID ID: 0009-0002-2780-3914
Rússia, Dubna

Iulia Melnikova

Joint Institute for Nuclear Research

Email: julesmelnikova@mail.ru
ORCID ID: 0009-0000-4731-8874
Rússia, Dubna

Alexandra Belyaeva

Institute of Biomedical Problems, Russian Academy of Sciences

Email: yasya_bi@mail.ru
ORCID ID: 0000-0001-6348-1938
Rússia, Moscow

Alexander Perevezentsev

Institute of Biomedical Problems, Russian Academy of Sciences

Email: perezx@me.com
ORCID ID: 0000-0001-6464-2887
Rússia, Moscow

Andrey Stemberg

Institute of Biomedical Problems, Russian Academy of Sciences

Email: andrei_shtemberg@mail.ru
ORCID ID: 0000-0001-8944-0296
Rússia, Moscow

Igor Klotz

Institute of Medical Primatology

Email: igor-imp@mail.ru
ORCID ID: 0000-0003-1025-3127
Rússia, Sochi

Tat’yana Gvozdik

Institute of Medical Primatology

Email: teg-adler@mail.ru
ORCID ID: 0000-0001-7171-4500
Rússia, Sochi

A. Bugay

Joint Institute for Nuclear Research

Email: koshlan@jinr.ru
Rússia, Dubna

Bibliografia

Arquivos suplementares