Метаболический потенциал конверсии хлорфеноксиуксусных кислот штамма Serratia sp. 22s

Полный текст

2,4-Дихлорфеноксиуксусная (2,4-Д) и 2,4,5-трихлорфеноксиуксусная (2,4,5-Т) кислоты представляют собой синтетические ауксины, соли и эфиры которых с 1940 гг. широко применялись в сельском хозяйстве как гербициды для борьбы с широколиственными сорняками, а также в качестве регулятора роста растений. Кроме того, они использовались как дефолианты во время чрезвычайного положения в Малайзии в 1948‒1960 гг. и во время вьетнамской войны 1961‒1971 гг. Однако в 1980 гг. 2,4,5-T была запрещена во всем мире вследствие ее токсичности для животных [1].

Оба гербицида являются загрязнителями подземных вод, поскольку, с одной стороны, они хорошо растворимы в воде, а с другой стороны, медленно разлагаются [2]. Биоремедиация загрязненных почв и подземных вод микроорганизмами в последние годы вызывает большой интерес, так как этот метод безопасен, относительно эффективен, экологичен и экономичен [3].

К настоящему времени известны бактериальные штаммы, способные утилизировать 2,4-Д в аэробных условиях, такие как Cupriavidus pinatubonensis (первоначально Alcaligenes eutrophus) JMP 134, Sphingomonas sp. TFD44, Achromobacter xylosoxidans subsp. denitrificans EST4002, Bradyrhizobium sp. HW13, Pseudomonas aeruginosa PAOlc и Halomonas sp. EF43 [4–10]. Вышеперечисленные штаммы в основном были изолированы из загрязненных гербицидами почв, а их характерной особенностью являлось наличие у них единого пути конверсии 2,4-Д через 3,5-дихлоркатехол с последующим расщеплением его ароматического кольца (рис. 1а).

 

Рис. 1. Пути аэробной деградации хлорированных феноксиуксусных кислот у бактерий: а — 2,4-Д штамма C. necator JMP134 [4], б — 2,4,5-Т штамма B. phenoliruptrix АС1100 [11, 12]: I — 2,4-Д; II — 2,4-дихлорфенол; III — 2,4-дихлоркатехол; IV — 2,4-дихлор-цис, цис-муконат; V — транс-2-хлордиенлактон; VI — цис-2-хлордиенлактон; VII — 2-хлормалеилуксусная кислота; VIII — 2,4,5-Т; IX — 2,4,5-трихлорфенол; X — 2,5-дихлоргидрохинон; XI — 5-хлоргидроксигидрохинон; XII — 2-гидрокси-1,4-бензохинон; XIII — гидроксигидрохинон; XIV — малеилуксусная кислота; XV — β-кетоадипат; TCA — цикл трикарбоновых кислот.

 

В отличие от разнообразия аэробных бактерий, разлагающих 2,4-Д, сообщалось лишь о нескольких подобных культурах, осуществляющих конверсию 2,4,5-T. Наиболее известны представители родов Burkholderia, Nocardioides, Sphingomonas и Bradyrhizobium. Все они способны использовать 2,4,5-T в качестве основного источника углерода и энергии [11–16]. Полный путь разложения 2,4,5-Т известен для штамма Burkholderia phenoliruptrix (первоначально Pseudomonas cepacia) АС1100 (рис. 1б), который протекает через центральный метаболит — 2,5-дихлоргидрохинон, и далее — с образованием гидроксигидрохинона с последующим орто-расщеплением его ароматического кольца [11, 12]. Вероятно некоторая «избыточность» этого пути является следствием его происхождения — культура была получена в лаборатории методом «плазмид-ассоциированного молекулярного бридинга» [17].

Также через гидроксигидрохинон с дальнейшим орто-расщеплением ароматического кольца происходит деструкция 2,4-Д и 2,4,5-Т у штамма Nocardioides simplex 3E, для которого выделены и изучены ключевые ферменты конверсии — гидроксигидрохинон- и 6-хлоргидроксигидрохинон-1,2-диоксигеназы, а также малеилацетатредуктаза [18].

Несмотря на многочисленные попытки усилить биодеградацию хлорфеноксиуксусных кислот путем биоаугментации почв штаммами-деструкторами, часто не происходит значимого увеличения разложения загрязняющих веществ по сравнению с таковым в незасеянной почве. Интродуцированные штаммы не всегда хорошо выживают в почвенной среде, несмотря на различные стрессы, в том числе конкуренцию с аборигенными микроорганизмами. Использование природных местных микроорганизмов, разлагающих 2,4-Д, является реальной стратегией биоремедиации загрязненных участков [19].

Цель этой работы — выявление метаболического потенциала конверсии 2,4-Д и 2,4,5-T у аборигенного бактериального штамма 22S, а также определение его таксономического положения, оценка безопасности его применения, адаптогенности и приживаемости в почве.

МЕТОДИКА

Объектом исследований был выбран природный бактериальный штамм, обозначенный нами 22S, изолированный из образцов почвы, загрязненной отходами химического производства (Уфа, Россия).

Морфометрические характеристики были изучены с помощью просвечивающей электронной микроскопии на микроскопе Н-300 (“Hitachi”, Япония) при увеличении 18000 (75 кВ).

Культуральные и физиолого-биохимические свойства изолята определяли согласно методическому руководству [20].

Геномную ДНК выделяли из бактерий методом Бирнбойма–Доли с модификациями [21]. Небольшое количество бактериальной биомассы — одна колония с чашки с агаризованной среды или 25 мкл осадка жидкой культуры — суспендировали в 100 мкл буфера I (50 мМ Трис-HCl, рН 8.0; 10 мМ ЭДТА; 50 мкг/мл панкреатической РНКазы) до получения однородной суспензии. Затем добавляли 125 мкл лизирующего буфера II (0.2 М NaOH; 1%-ный додецилсульфат натрия). Смесь обрабатывали ультразвуком на ультразвуковом дезинтеграторе УЗДН-2Т (Россия) на максимальной мощности 22 кГц в течение 2 мин при 4°C. Затем суспензию инкубировали при 65°C в течение 45 мин и охлаждали до комнатной температуры. После этого добавляли 125 мкл буфера III (2.5 мМ ацетат калия, рН 4.5), смесь встряхивали и центрифугировали 10 мин при 10000 g в миницентрифуге Eppendorff 5415C (“Eppendorff”, Германия). В супернатант добавляли 500 мкл смолы Wizard Maxi Preps (“Promega”, США) и продолжали экстракцию в соответствии с рекомендациями производителя. Концентрация полученного препарата ДНК при использовании этого метода составляла 30–50 мкг/мл.

Для проведения ПЦР и дальнейшего секвенирования ПЦР-фрагментов частичной последовательности гена 16S рРНК была использована универсальная праймерная система [22]. Амплификационная смесь (50 мкл) имела следующий состав: буфер для ДНК-полимеразы BioTaq (“БиоМастер”, Россия) 17 мМ (NH₄)₂SO₄; 67 мМ трис-HCl, рН 8.8; 2 мМ MgCl₂; по 12.5 нмоль каждого из dNTP, 50 нг ДНК-матрицы; по 5 пмоль соответствующих праймеров и 3 ед. ДНК-полимеразы BioTaq (“Диалат”, Россия). Температурно-временной профиль ПЦР: первый цикл — 9 мин при 94°C, 1 мин при 55°C, 2 мин при 72°C; последующие 30 циклов — 1 мин при 94°C, 1 мин при 55°C, 2 мин при 72°C; завершающий цикл — 7 мин при 72°C. Секвенирование полученных ПЦР-фрагментов генов проводили с помощью набора реактивов Big Dye Terminator v.3.1 (“Applied Biosystems”, США) на автоматическом секвенаторе ABI PRIZM 3730 (“Applied Biosystems”, США) согласно инструкциям производителя.

С использованием пакета программ BLAST проведен поиск гомологичных последовательности с опубликованными в базе данных GenBank, а с помощью CLUSTAL W и MEGA 5 произведено их множественное выравнивание и построение филогенетического дерева (рис. 2).

 

Рис. 2. Филогенетическое дерево 16S рРНК штамма 22S и гомологичных ему последовательностей типовых видов бактерий близких к роду Serratia, построенное методом “Neighbor-Joining”. Цифрами указана достоверность ветвления, рассчитанная с помощью “bootstrap”-анализа (значимыми признаются величины больше 50). Масштаб отражает эволюционное расстояние, соответствующее 5 нуклеотидным заменам на каждые 1000 нуклеотидов. В скобках указаны номера последовательностей в базе данных (GenBank).

 

Бактериальный штамм выращивали в конических колбах (250 мл) на минимальной солевой среде М9 [23], содержащей в качестве единственного источника углерода 2,4-Д/2,4,5-Т в концентрации 100 мг/л. Культивирование проводили при температуре 28°C в термостатируемой установке УВМТ-12–250 (“Элион”, Россия) при 120 об./мин. Интенсивность роста культуры оценивали по оптической плотности (OП₅₉₀) клеточной суспензии с использованием фотоколориметра КФК-2 (“ЗОМЗ”, Россия).

Определение количества хлорфеноксиуксусных кислот в культуральной жидкости проводили согласно руководству [24] с небольшими модификациями, описанными ранее в статье Жариковой с соавт. [25].

Продукты метаболизма хлорфеноксиуксусных кислот определяли на хромато-масс-спектрометре NERMAG R-30-10 с хроматографом Carlo Erba MEGA 536010 (“Hewlett-Packard”, США), условия определения описаны в работе Жариковой с соавт. [25].

Интермедиаты идентифицировали с использованием системы обработки данных MS HP ChemStation, содержащей библиотеку из 138000 масс-спектров Base Date WILEY138L.

Изучение этапов промежуточного метаболизма хлорфеноксиуксусных кислот проводили в экспериментах с интактными клетками [26, 27]. Предварительное определение пути расщепления ароматического кольца выполняли качественными методами, в основе которых лежит желтое окрашивание среды инкубации при формировании полуальдегида гидроксимуконовой кислоты (мета-путь), либо положительная реакция Ротера (орта-путь).

Бактериальные клетки выращивали до конца экспоненциальной фазы на солевой среде М9, содержащей в качестве единственного источника углерода и энергии 2,4-Д или 2,4,5-Т в концентрации 100 мг/л. Затем клетки отделяли центрифугированием при 3630 g 20 мин, дважды промывали 50 мМ натрий-фосфатным буфером (рН 7.0) и суспендировали (1 г сырой биомассы) в том же буфере.

Далее выращенные на хлорфеноксикислотах интактные клетки суспендировали в 20 мл 50 мМ натрий-фосфатного буфера (рН 7.5) и инкубировали в течение 3 ч в присутствии 100 мМ катехола в темноте при 25°C. Контролем служила смесь без добавления интактных клеток.

Ферментативную активность катехол-1,2-диоксигеназы и катехол-2,3-диоксигеназы оценивали по изменению оптической плотности реакционной смеси на спектрофотометре СФ-46 (ООО “ЛОМО”, Россия) в кварцевых кюветах объемом 4 мл с длиной оптического пути 1см. Поглощение контрольной и опытной смеси до и после инкубации измеряли при длинах волн 260, 274 и 375 нм, соответствующих пикам поглощения муконовой кислоты, катехола и гидроксимуконового полуальдегида. Наличие активности диоксигеназ, расщепляющих ароматическое кольцо катехола, определяли по сдвигу пика поглощения катехола в более коротковолновую или, наоборот, в длинноволновую область спектра.

Оценка патогенности бактерий проводилась на основании изучения их вирулентности, токсичности, инфективности и инвазивности. Оценку средневирулентной дозы, то есть дозы, которая вызывает смертельный эффект у 50% подопытных животных, проводили путем однократного введения взвеси изучаемого штамма микроорганизма в дозах 10⁷, 10⁸ и 10⁹ кл. на одно животное внутрибрюшинно. Для испытания каждой дозы использовали белых мышей по 6 животных в группе. Наблюдение за их выживаемостью проводили в течение 30 сут.

Для определения токсичности штамма 22S животным внутрибрюшинно вводили взвесь убитых клеток в физрастворе в дозе 10⁹ кл./млпо бактериологическому стандарту. Фиксировали состояние животных в течение 48 ч. Контрольной группе белых мышей внутрибрюшинно вводили по 0.5 мл физраствора. Все животные содержались в условиях вивария.

В течение всего срока наблюдения за выживаемостью и общим состоянием животных отмечались клинические проявления воздействия микроорганизмов и поведенческие реакции мышей. Для определения диссеминации изучаемых микроорганизмов во внутренних органах у всех контрольных и зараженных животных выполняли посев крови и брали отпечатки легких, сердца, печени, селезенки, почек и кишечника на МПА в чашках Петри.

Для оценки приживаемости культуры 22S в модельном опыте с почвой использовали выщелоченный нестерильный чернозем, помещенный в стеклянные сосуды. Предварительно почву просеяли, перебрали, удалили корни и увлажнили до 60% стерильной дистиллированной водой.

В системе “почва–интродуцент–гербицид” использовали 2,4-Д и 2,4,5-Т в концентрациях, равных 100 ПДК, 1000 ПДК и 10000 ПДК (ПДК для почвы у 2,4-Д составляет 0.1 мг/см³, а у 2,4,5-Т — 0.15 мг/см³). Растворы 2,4-Д и 2,4,5-Т вносили в почву за 7–10 дней до внесения бактериальной культуры. Штамм предварительно выращивали на богатой жидкой среде и вносили в концентрации 3.4 × 10⁷ кл./г почвы.

Контроль (чистая почва) и все варианты опыта проводили в трех повторностях.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Грамотрицательные клетки штамма 22S представляли собой подвижные короткие палочки с перитрихиальным жгутикованием, размером 0.63 × 1.05 мкм.

На МПА изолят образовывал красноватые колонии, пигментация которых являлась варьирующим признаком, зависимым от условий культивирования и присутствия сахаров в среде. В УФ-лучах наблюдалась флуоресценция культуры. Оптимальный рост бактерий происходил в аэробных условиях в диапазоне 22–37°C и pH 7–8.

В качестве единственного источника углерода культура использовала мальтозу, маннит, сахарозу, цитрат и глюконат, но не L-арабинозу, лактозу, малонат, фенилаланин и мочевину. Клетки штамма оказались положительными по реакции Фогес–Проскауэра, каталазной и лизиндекарбоксилазной активности, восстанавливали нитрат. В то же время у бактерий не выявили орнитиндекарбоксилазу и аргининдигидролазу, способности к гидролизу желатина, а также отрицательной была проба с метиловым красным.

Для выделенного изолята была определена практически полная последовательность (1400 п. н.) амплификата гена, кодирующего 16S pРНК, которая была депонирована в международную базу данных GenBank под номером KY563745.

Сходство с исследуемой культурой показали бактерии рода Serratia, такие как Serratia marcescens DSM 30121^T (уровень идентичности 98.5%), S. marcescens JCM11315^T (уровень идентичности 98.4%), S. nematodiphila DZ0503SBS1^T (уровень идентичности 98.4%), S. surfactantfaciens YD25^T (уровень идентичности 98.3%) и S. ureilytica NiVa 51^T (уровень идентичности 97.1%) (рис. 2).

Необходимо отметить, что S. marcescens DSM 30121^T и S. marcescens JCM11315^T ранее считались типовыми штаммами двух подвидов данного вида: marcescens и sakuensis соответственно. Первоначально на основании данных ДНК–ДНК-гибридизации и факта обнаружения спор в клетках культуры штамм KREDT= DSM 17174T был описан как подвид S. marcescens subsp. sakuensis [28]. Однако более поздние исследования показали, что штамм DSM 17174^T не удовлетворял геномным критериям для определения подвида, и наличие спор в его клетках не было подтверждено. Таким образом, на основании исследования спорообразования и геномного анализа был сделан вывод, что S. marcescens subsp. sakuensis является более поздним гетеротипическим синонимом подвида S. marcescens subsp. marcescens [29, 30].

С типовым штаммом S. marcescens DSM 30121^T исследуемая культура образует кластер с высоким уровнем достоверности — значение бутстреп анализа равно 96 и уровнем идентичности — 98.5%. Последний сопоставим по значению (98.4 и 98.3% соответственно) с уровнями идентичности штамма 22S и типовых штаммов двух других видов S. nematodiphila DZ0503SBS1^T и S. surfactantfaciens YD25^T.

Суммируя филогенетические и физиологическо-биохимические признаки, штамм 22S мы отнесли к роду Serratia и обозначили как штамм Serratia sp. 22S.

Поскольку известно, что бактерии рода Serratia могут вызывать оппортунистические инфекции у госпитализированных больных, была проведена оценка патогенности клеток штамма 22S на основании изучения его вирулентности, токсичности, инфективности и инвазивности.

Опыты на белых мышах показали, что изолят не обладал токсическими свойствами, а средневирулентную дозу установить не удалось (т. е. она превышает 10⁹ кл./мл). Клинические проявления развития заболевания также не отмечались, а на вскрытии при визуальном осмотре патологических изменений внутренних органов не выявлено. В крови и внутренних органах опытных мышей исследуемого микроорганизма также не обнаружено.

На основании вышеизложенного следует, что изучаемый штамм не является патогенным.

В периодической культуре штамм Serratia sp. 22S был способен раздельно утилизировать хлорфеноксиуксусные кислоты в качестве единственного источника углерода и энергии (рис. 3).

 

Рис. 3. Зависимость ОП₅₉₀ (1) культуральной жидкости и концентрации 2,4-Д (а, 2) и 2,4,5-Т (б, 2) от времени культивирования Serratia sp. 22S в периодической культуре:

 

При выращивании на 2,4-Д (рис. 3а) значение оптической плотности клеточной суспензии достигало максимальной величины (0.27 ОЕ) на 3 сут культивирования, при этом потребление субстрата составило 24% от исходного. Далее наблюдалось резкое снижение ОП клеточной суспензии и переход культуры в стадию отмирания. Остаточное количество субстрата на 12 сут культивирования составило 42 мг/л.

При использовании 2,4,5-Т максимальное значение ОП наблюдалось на 4 сут культивирования — 0.42, а количество субстрата снижалось за это время до 45 мг/л. К концу культивирования (на 11 сут) количество 2,4,5-Т уменьшалось на 72% от исходного и составило 28 мг/л.

Конверсия 2,4-Д как единственного источника углерода и энергии у бактериальных штаммов исследовалась в различных концентрациях от нескольких мг/л до г/л [18, 31, 32]. В то же время стоит отметить, что штаммов, способных к метаболизму 2,4,5-Т, изолировано значительно меньше. Один из них — Burkholderia phenoliruptrix АС1100 — в течение 6 сут утилизировал более 97% 2,4,5-T в концентрации 1 мг/мл [17]. Другой штамм, Nocardioides simplex 3E, был способен полностью конвертировать 2,4,5-T в концентрации 0.04 мМ [14]. Около 200 штаммов, изолированных из почв Вьетнама, оказались деструкторами 2,4,5-Т, их способность тестировалась на солевой среде, содержащей это соединение в концентрации 100 мг/л [13].

Таким образом, штамм Serratia sp. 22S активен в отношении вышеуказанных хлорфеноксиуксусных кислот, причем 2,4,5-Т по сравнению с 2,4-Д являлась более предпочтительным субстратом для данной культуры, несмотря на большее количество атомов хлора в молекуле.

Следует отметить, что штамм 22S также раздельно утилизировал фенол и 2,4-дихлорфенол в концентрации 100 мг/л, что было показано ранее в работе [33].

В среде культивирования штамма Serratia sp. 22S было определено присутствие трех соединений, вероятно являющихся интермедиатами пути деградации хлорфеноксиуксусных кислот (табл. 1).

 

Таблица 1. Масс-спектрометрический анализ метаболитов, образующихся в результате конверсии 2,4,5-Т штаммом Serracia sp. 22S

Интермедиат	Основные пики в масс-спектре m/z, %	Наименование
	М+ 264 (30), 233 (30), 19 (100), 175 (25), 147 (30), 87 (15), 59 (20)	2,4-Дихлор-6-метилфеноксиуксусная кислота, метиловый эфир
	М+ 166 (50), 107 (120), 77 (80)	Феноксиуксусная кислота, метиловый эфир
	M+ 45 (100), 55 (20), 59 (8), 87 (5), 115 (6), 129 (20), 125 (2), 188 (0.1)	2-Гидрокси-2-гексендионовая кислота, метиловый эфир

 

Одной из ключевых стадий аэробной деградации хлорароматических соединений, в отличие от их незамещенных аналогов, является элиминация атома хлора из молекулы субстрата. По классическому пути деградации 2,4-Д, гены которого локализуются на плазмиде pJP4 штамма C. pinatubonensis JMP134, 2,4-Д через 2,4-дихлорфенол конвертируется до 3,5-дихлоркатехола, а затем происходит орто-разрыв его ароматического кольца с последовательной элиминацией двух атомов хлора [4]. Такой путь, когда хлор удаляется после раскрытия ароматического кольца, свойственен подавляющему большинству штаммов, выполняющих конверсию 2,4-Д.

Однако устранение галогена может происходить и перед разрывом ароматического кольца, что особенно характерно для конверсии полихлорированного субстрата. Аэробное разложение 2,4,5-Т штаммом B. phenoliruptrix AC1100 инициируется удалением остатка уксусной кислоты с образованием 2,4,5-трихлорфенола (2,4,5-ТХФ). Далее происходит замена первых двух атомов хлора на гидроксильные группы, а последний третий атом хлора элиминируется во время реакции восстановительного дехлорирования, в результате чего происходит образование 2-гидрокси-1,4-бензохинона [11, 12].

Штамм Nocardiodes simplex 3E помимо классической деградации 2,4,5-Т через образование 2,4,5-ТХФ, вероятно, имеет альтернативный вариант превращения первоначального субстрата, так как среди метаболитов пути были обнаружены 4-хлор- (4-ХФУК) и 2,4-дихлорфеноксиуксусная кислоты [14].

В пути деградации 2,4-Д у штамма Azotobacter chroococcum MSB-1 происходит трансформация первоначального субстрата до 4-ХФУК с элиминацией молекулы хлора и заменой ее на водород [34].

Необходимо отметить, что исследованные ранее штаммы Raoultella planticola 33–4ch, Raoultella planticola 36D, Raoultella planticola 36Т и Cellulosimicrobium sp. NPZ-121 также осуществляли восстановительное дехлорирование 2,4,5-Т с образованием 2,4-Д [35], 4-ХФУК и далее феноксиуксусной кислоты (ФУК) [25, 35].

Присутствие среди метаболитов катаболизма 2,4,5-Т у штамма 22S метильных производных 2,4-Д, а также ФУК, свидетельствовало о том, что культура осуществляла полное восстановительное дегалогенирование субстрата перед разрывом ароматического кольца.

Второй ключевой стадией конверсии (хлор)ароматических соединений является расщепление ароматического кольца. Сначала в молекулу субстрата вводится один или два атома кислорода, в результате чего происходит формирование дигидроксильного бензольного кольца с образованием центрального метаболита пути — катехола, либо гидрохинона или их производных. Далее происходит непосредственное раскрытие ароматического кольца, которое катализируется диоксигеназами. Когда субстратом реакции является катехол, расщепление может происходить как между гидроксильными группами (орто-расщепление), так и по соседству с одним из гидроксилов (мета-расщепление, рис. 4) [36, 37].

 

Рис. 4. Основные пути аэробного расщепления ароматического кольца катехола (а) и гидрохинона (б) [35, 36]: I — катехол, II — муконовая кислота, III — 2-гидроксимуконовый полуальдегид, IV — гидрохинон, V — 4-гидроксимуконовый полуальдегид, VI — гидроксигидрохинон, VII — 4-малеилуксусная кислота.

 

Обнаруженное в среде культивирования штамма 22S соединение — 2-гидрокси-2-гексендионовая кислота, вероятно, является продуктом реакции расщепления ароматического кольца. Наличие гидроксильной группы при втором атоме углерода рядом с одной из карбоксильных групп интермедиата свидетельствовало о происходящем мета-раскрытии ароматического кольца катехола как вероятного центрального метаболита пути (рис. 4). При классическом мета-расщеплении катехола образуется 2-гидроксимуконовый полуальдегид, альдегидная группа которого затем может подвергнуться окислению с образованием соответствующей кислоты, как это видно в пути расщепления гидрохинона.

Необходимо отметить, что классическим путем деградации хлорароматических соединений у бактерий считается модифицированный орто-путь расщепления хлоркатехола, а мета-путь больше характерен для метаболизма метилароматических углеводородов [36].

Ранее в культуральных средах штаммов R. planticola 33–4ch, R. planticola 36D, R. planticola 36Т, а также Cellulosimicrobium sp. NPZ-121 было обнаружено соединение 2-кето-3-метилмуконовый полуальдегид, которое также является производным 2-гидроксимуконового полуальдегида [25, 35]. На основании сходных промежуточных метаболитов можно предположить существование единого для изучаемого штамма и вышеперечисленных деструкторов пути катаболизма хлорфеноксиуксусных кислот посредством полного восстановительного дехлорирования субстрата с последующим мета-разрывом ароматического кольца катехола.

Для проверки предположения о возможной роли катехола в качестве центрального метаболита пути деградации хлорфеноксиуксусных кислот у штамма Serratia sp. 22S был проведен опыт с бактериальными клетками, выращенными раздельно на 2,4-Д или 2,4,5-Т как единственных источниках углерода и энергии.

Инкубация интактных клеток в фосфатно-натриевом буфере, содержащем 100 мг/л катехола, с последующей спектрофотомерией показала, что по сравнению с контролем происходило смещение основного пика поглощения катехола (274.0 нм) в длинноволновую область спектра и появление нового пика при 375.0 нм. При этом среда инкубации окрашивалась в желто-оранжевый цвет, что указывало на формирование 2-гидроксимуконового полуальдегида, который образуется из катехола при мета-разрыве ароматического кольца. Следует отметить, что при формировании муконовой кислоты, продукта орто-разрыва ароматического кольца катехола, наблюдалось бы смещение максимума поглощения в коротковолновый участок спектра. Отрицательный результат реакции Ротера, которая детектирует превращение муконовой кислоты в β-кетоадипат, также показал отсутствие активности ферментов β-кетоадипатного пути.

Полученные результаты подтвердили предположение о том, что деградация 2,4-Д и 2,4,5-Т у штамма 22S идет единым путем через образование катехола с последующим мета-расщеплением его ароматического кольца.

Традиционное изучение бактерий-деструкторов на лабораторных питательных средах, важное для понимания различных аспектов их биологии, не объясняет поведения данных микроорганизмов в почвенных условиях. В связи с этим необходимым этапом исследований является изучение потенциальных интродуцентов в модельных экосистемах, позволяющее оценить их адаптагенность и приживаемость в составе почвенного микробиоценоза.

В модельных системах “почва–интродуцент” и “почва–интродуцент–гербицид” была изучена приживаемость штамма 22S в нестерильной почве, а также адаптагенность культуры к высоким концентрациям гербицидов 2,4-Д и 2,4,5-Т (рис. 5). Наличие маркера (способность к конверсии гербицидов) обеспечило возможность контроля за их развитием в почве путем высева почвенных суспензий на бедную агаризованную среду М9 с 2,4-Д/2,4,5-Т в качестве единственного источника энергии.

 

Рис. 5. Численность клеток штамма Serratia sp. 22S (КОЕ) в чистой (1) и загрязненной 2,4,5-Т (а) и 2,4-Д (б) почве при 100 ПДК (2), 1000 ПДК (3) и 10000 ПКД (4).

 

Анализ плотности популяции клеток штамма 22S в модельной системе “почва–интродуцент” показал, что численность штамма поддерживалась на достаточно высоком уровне — порядка 10⁵ кл./г почвы на протяжении всего опыта (52 сут). При этом в начале опыта, по-видимому, происходила адаптация культуры к новым условиям, а после 9 сут титр штамма увеличился почти в 5 раз, а затем начал снижаться и к 27 сут стабилизировался на уровне 1.5–1.8 × 10⁵ кл./г почвы и сохранялся таким до конца эксперимента.

В модельной системе “почва–интродуцент–гербицид” при содержании 2,4-Д в 100 ПДК с 9 по 37 сут наблюдался рост титра клеток более чем в 12 раз, затем происходило его снижение до уровня 3 × 10⁵ кл./г почвы. В почвенных сосудах с концентрацией 2,4-Д в 1000 и 10000 ПДК не происходило увеличение титра клеток штамма, вероятно, такие высокие концентрации гербицида подавляли его рост.

При исследовании способности к адаптации и приживаемости штамма 22S при высоких концентрациях 2,4,5-Т наилучшие результаты наблюдались при использовании более высокой, чем для 2,4-Д, концентрации гербицида — 1000 ПДК, при этом титр штамма на 19 сут вырос до значения 1.3 × 10⁷. Далее происходило снижение и стабилизация биомассы культуры до 9 × 10⁵ кл./г почвы.

Проведенные эксперименты выявили хорошую адаптагенность и приживаемость штамма 22S в почве, причем содержание хлорфеноксиуксусных кислот до определенной концентрации (2,4-Д не выше 100 ПДК, а 2,4,5-Т не выше 1000 ПДК) оказывали положительное влияние на динамику роста культуры, вероятно в результате их селектирующего воздействия.

Полученные результаты показали, что природный штамм Serratia sp. 22S способен использовать в своем метаболизме (хлор)ароматические соединения, включая хлорфеноксиуксусные кислоты. На основании идентифицированных промежуточных метаболитов предложен единый путь конверсии хлорфеноксиуксусных кислот у штамма 22S посредством полного восстановительного дехлорирования субстрата с последующим мета-разрывом ароматического кольца катехола. Эксперимент с интактными клетками подтвердил наличие активности фермента мета-расщепления ароматического кольца катехола. Была показана безопасность применения изучаемой культуры для человека и животных, а также ее высокая адаптагенность и приживаемость в почве. Следовательно, штамм Serratia sp. 22S может быть перспективным для применения как агента ремедиации территорий, загрязненных хлорфеноксиуксусными кислотами.

При проведении исследований использовали оборудование ЦКП “Агидель” УФИЦ РАН.

ФИНАНСИРОВАНИЕ РАБОТЫ. Работа выполнена в рамках государственного задания Минобрнауки России по теме № 220131100163-4 “Межвидовые взаимодействия в микробных сообществах и растительно-микробных ассоциациях естественных и техногенных экосистем (генетические, биохимические и биотехнологические аспекты)”.

СОБЛЮДЕНИЕ ЭТИЧЕСКИХ СТАНДАРТОВ. Исследования на лабораторных мышах проводили в строгом соответствии с этическими нормами обращения с животными, принятыми Европейской конвенцией по защите позвоночных животных, используемых для исследовательских и иных научных целей (European Treaty Series, № 123).

КОНФЛИКТ ИНТЕРЕСОВ. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Об авторах

Н. В. Жарикова

Уфимский Институт биологии УФИЦ РАН

Автор, ответственный за переписку.
Email: puzzle111@yandex.ru
Россия, Уфа, 450054

Е. Ю. Журенко

Уфимский Институт биологии УФИЦ РАН

Email: puzzle111@yandex.ru
Россия, Уфа, 450054

В. В. Коробов

Уфимский Институт биологии УФИЦ РАН

Email: puzzle111@yandex.ru
Россия, Уфа, 450054

Л. Г. Анисимова

Научно-исследовательский технологический институт гербицидов и регуляторов роста растений с опытно-экспериментальным производством АН РБ

Email: puzzle111@yandex.ru
Россия, Уфа, 450029

Г. Э. Актуганов

Уфимский Институт биологии УФИЦ РАН

Email: puzzle111@yandex.ru
Россия, Уфа, 450054

Список литературы

Дополнительные файлы