Разработка способа выявления специфических антител к белку Е вируса жёлтой лихорадки (Flaviviridae: Flavivirus)методом иммуноферментного анализа

Обложка

Цитировать

Полный текст

Аннотация

Введение. Жёлтая лихорадка (ЖЛ) остаётся одной из самых распространённых природно-очаговых инфекционных болезней в мире. В связи с возрастающим туристическим потоком в страны, эндемичные по ЖЛ, обнаружением на территории южных регионов России устойчивых популяций комаров видов Aedes aegypti и Ae. albopictus, являющихся основными переносчиками вируса ЖЛ (ВЖЛ), и тем фактом, что в медицинских учреждениях нашей страны можно получить живую аттенуированную вакцину против ЖЛ, но нет возможности оценки эффективности вакцинации, возникает вопрос о разработке и внедрении в практику диагностических наборов для выявления антител к возбудителю методом иммуноферментного анализа (ИФА).

Цель работы – разработка способа выявления специфических антител класса IgG к белку Е ВЖЛ методом ИФА и оценка его диагностических характеристик.

Материалы и методы. Методом обратной транскрипции на матрице РНК ВЖЛ, выделенного на клеточной культуре Aedes albopictus clone C6/36, синтезирована специфичная кДНК и амплифицирован участок генома белка Е ВЖЛ, который был клонирован в плазмиду pET160 (Thermo Fisher Scientific, США). Полученный фрагмент гена использовали в качестве ДНК-матрицы для создания рекомбинантного аналога третьего домена белка Е ВЖЛ в клетках Escherichia coli (BL-21(DE3)). Далее произведена оценка иммуногенности полученного антигена и оптимизация условий анализа.

Результаты. Определены оптимальные условия наработки полученного рекомбинантного белка Е ВЖЛ, подтверждена его специфичность иммунологическими методами (вестерн-блоттинг и ИФА), подобраны сорбционные буферы и блокирующие растворы, проведён анализ чувствительности и специфичности рекомбинантного антигена и антител к ВЖЛ.

Заключение. Был разработан способ выявления специфических антител класса IgG к белку Е ВЖЛ методом ИФА. Данный диагностический набор может использоваться как для изучения протективных свойств вакцины против ЖЛ, так и для выявления завозных случаев инфекции на неэндемичных территориях.

Об авторах

Екатерина И. Кривошеина

ФБУН «Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии «Вектор» Роспотребнадзора

Email: mikkartash@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0001-5181-0415
Россия, 630559, г. Кольцово, Новосибирская область

Михаил Юрьевич Карташов

ФБУН «Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии «Вектор» Роспотребнадзора; ФГАОУ ВО «Новосибирский национальный исследовательский государственный университет» Минобрнауки России

Автор, ответственный за переписку.
Email: mikkartash@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0002-7857-6822

канд. биол. наук, старший научный сотрудник отдела молекулярной вирусологии флавивирусов и вирусных гепатитов

Россия, 630559, г. Кольцово, Новосибирская область; 630090, г. Новосибирск

Екатерина В. Найденова

ФКУН «Российский научно-исследовательский противочумный институт «Микроб» Роспотребнадзора

Email: mikkartash@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0001-6474-3696
Россия, 410005, г. Саратов

Никита Д. Ушкаленко

ФБУН «Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии «Вектор» Роспотребнадзора

Email: mikkartash@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0002-2171-7444
Россия, 630559, г. Кольцово, Новосибирская область

Степан А. Пьянков

ФБУН «Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии «Вектор» Роспотребнадзора

Email: mikkartash@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0002-6593-6614
Россия, 630559, г. Кольцово, Новосибирская область

Владимир А. Терновой

ФБУН «Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии «Вектор» Роспотребнадзора

Email: mikkartash@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0003-1275-171X
Россия, 630559, г. Кольцово, Новосибирская область

Валерий Б. Локтев

ФБУН «Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии «Вектор» Роспотребнадзора

Email: mikkartash@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0002-0229-321X
Россия, 630559, г. Кольцово, Новосибирская область

Список литературы

  1. WHO. Health topic. Yellow fever. Available at: https://www.who.int/health-topics/yellow-fever
  2. Львов Д.К., ред. Медицинская вирусология: руководство. М.: МИА; 2008.
  3. Lindenbach B.D., Rice C.M. Molecular biology of flaviviruses. Adv. Virus Res. 2003; 59: 23–61. https://doi.org/10.1016/s0065-3527(03)59002-9
  4. Douam F., Ploss A. Yellow fever virus: Knowledge gaps impeding the fight against an old foe. Trends Microbiol. 2018; 26(11): 913–28. https://doi.org/10.1016/j.tim.2018.05.012
  5. Monath T.P. Yellow fever: an update. Lancet Infect. Dis. 2001; 1(1): 11–20. https://doi.org/10.1016/S1473-3099(01)00016-0
  6. Ганушкина Л.А., Дремова В.П. Комары Aedes aegypti L. и Aedes albopictus skuse – новая биологическая угроза для юга России. Медицинская паразитология и паразитарные болезни. 2012; (3): 49–55.
  7. Ганушкина Л.А., Таныгина Е.Ю., Безжонова О.В., Сергиев В.П. Об обнаружении комаров Aedes (Stegomyia) albopictuss на территории Российской Федерации. Медицинская паразитология и паразитарные болезни. 2012; (1): 3–4.
  8. Коваленко И.С., Якунин С.Н., Абибулаев Д.Э., Владычак В.В., Бородай Н.В., Смелянский В.П. и др. Обнаружение Aedes (Stegomyia) albopictus (Skuse, 1895) в Крыму. Проблемы особо опасных инфекций. 2020; (2): 135–7. https://doi.org/10.21055/0370-1069-2020-2-135-137
  9. Ясюкевич В.В., Попов И.О., Титкина С.Н., Ясюкевич Н.В. Адвентивные виды Aedes на территории России − оценка риска новой биологической угрозы здоровью населения России. Проблемы экологического мониторинга и моделирования экосистем. Проблемы экологического мониторинга и моделирования экосистем. 2017; 28(3): 51–71. https://doi.org/10.21513/0207-2564-2017-3-51-71
  10. Управление Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека по Удмуртской Республике. О профилактике желтой лихорадки; 2022. Available at: https://18.rospotrebnadzor.ru/content/354/110271/
  11. Кривошеина Е.И., Карташов М.Ю., Найденова Е.В. Современные лабораторные методы выявления возбудителя желтой лихорадки. Проблемы особо опасных инфекций. 2021; (2): 24–32. https://doi.org/10.21055/0370-1069-202-2-21-32
  12. Heinz F.X., Stiasny K., Püschner-Auer G., Holzmann H., Allison S.L., Mandl C.W., et al. Structural changes and functional control of the tick-borne encephalitis virus glycoprotein E by the heterodimeric association with protein prM. Virology. 1994; 198(1): 109–17. https://doi.org/10.1006/viro.1994.1013
  13. Chávez J.H., Silva J.R., Amarilla A.A., Moraes Figueiredo L.T. Domain III peptides from flavivirus envelope protein are useful antigens for serologic diagnosis and targets for immunization. Biologicals. 2010; 38(6): 613–8. https://doi.org/10.1016/j.biologicals.2010.07.004
  14. Volk D.E., May F.J., Gandham S.H., Anderson A., Von Lindern J.J., Beasley D.W., et al. Structure of yellow fever virus envelope protein domain III. Virology. 2009; 394(1): 12–8. https://doi.org/10.1016/j.virol.2009.09.001
  15. Радаева И.Ф., Нечаева Е.А., Дроздов И.Г. Коллекция культур клеток ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор» Роспотребнадзора. Новосибирск: ЦЭРИС; 2009.
  16. Marshall O.J. PerlPrimer: cross-platform, graphical primer design for standard, bisulphite and real-time PCR. Bioinformatics. 2004; 20(15): 2471–2. https://doi.org/10.1093/bioinformatics/bth254
  17. National Center for Biotechnology Information. GenBank Overview. Available at: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/
  18. Okonechnikov K., Golosova O., Fursov M.; UGENE team. Unipro UGENE: a unified bioinformatics toolkit. Bioinformatics. 2012; 28(8): 1166–7. https://doi.org/10.1093/bioinformatics/bts091
  19. Kumar S., Stecher G., Tamura K. MEGA7: Molecular evolutionary genetics analysis version 7.0 for bigger datasets. Mol. Biol. Evol. 2016; 33(7): 1870–4. https://doi.org/10.1093/molbev/msw054
  20. Laemmli U.K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 1970; 227(5259): 680–5. https://doi.org/10.1038/227680a0

Дополнительные файлы

Доп. файлы
Действие
1. JATS XML
Скачать
2. Рис. 1. Схематичное изображение вирусной РНК и полипротеинов вируса жёлтой лихорадки. Стрелки указывают сайты расщепления в полипротеине, которые процессируются протеазами клеточного (красные стрелки) или вирусного происхождения (зелёные стрелки).

Скачать (93KB)
Метаданные
3. Рис. 2. Электрофореграмма лизатов клеток E. coli BL-21 (DE3) и очищенного рекомбинантного белка в 15% ПААГ-электрофорезе с SDS: 0 – до индукции ИПТГ; 1–7 – инкубация при 25°С при различных условиях: 1–3 инкубация в течение 5 ч после добавления ИПТГ в концентрациях 0,1, 1 и 10 мМ соответственно; 4–6 – инкубация в течение 18 ч после добавления ИПТГ в концентрациях 0,1, 1 и 10 мМ соответственно; 7 – спустя 18 ч после добавления ИПТГ 1 мМ/мл; 8 – очищенный рекомбинантный белок. Стрелкой обозначено положение рекомбинантного белка Е ВЖЛ. М – маркер; ИПТГ – изопропил-β-D-1-тиогалактопиранозид; ВЖЛ – вирус жёлтой лихорадки.

Скачать (98KB)
Метаданные
4. Рис. 3. Результаты выявления очищенного антигена методом вестерн-блоттинга: дорожка 1 – обработанная сывороткой, содержащей антитела к вирусу денге; дорожка 2 – обработанная сывороткой, не содержащей антитела к ВЖЛ, ВКЭ, ВГС, вирусу денге; дорожка 3 – обработанная сывороткой крови с антителами к ВЖЛ. Стрелкой обозначено положение рекомбинантного белка Е ВЖЛ. ВЖЛ – вирус жёлтой лихорадки; ВКЭ – вирус клещевого энцефалита; ВГС – вирус гепатита С.

Скачать (45KB)
Метаданные
5. Рис. 4. Результаты иммуноферментного анализа для определения оптимальных условий для сорбции рекомбинантного антигена вируса жёлтой лихорадки (разведение сыворотки крови 1 : 100).

Скачать (264KB)
Метаданные

© Кривошеина Е.И., Карташов М.Ю., Найденова Е.В., Ушкаленко Н.Д., Пьянков С.А., Терновой В.А., Локтев В.Б., 2022

Creative Commons License
Эта статья доступна по лицензии Creative Commons Attribution 4.0 International License.

Согласие на обработку персональных данных с помощью сервиса «Яндекс.Метрика»

1. Я (далее – «Пользователь» или «Субъект персональных данных»), осуществляя использование сайта https://journals.rcsi.science/ (далее – «Сайт»), подтверждая свою полную дееспособность даю согласие на обработку персональных данных с использованием средств автоматизации Оператору - федеральному государственному бюджетному учреждению «Российский центр научной информации» (РЦНИ), далее – «Оператор», расположенному по адресу: 119991, г. Москва, Ленинский просп., д.32А, со следующими условиями.

2. Категории обрабатываемых данных: файлы «cookies» (куки-файлы). Файлы «cookie» – это небольшой текстовый файл, который веб-сервер может хранить в браузере Пользователя. Данные файлы веб-сервер загружает на устройство Пользователя при посещении им Сайта. При каждом следующем посещении Пользователем Сайта «cookie» файлы отправляются на Сайт Оператора. Данные файлы позволяют Сайту распознавать устройство Пользователя. Содержимое такого файла может как относиться, так и не относиться к персональным данным, в зависимости от того, содержит ли такой файл персональные данные или содержит обезличенные технические данные.

3. Цель обработки персональных данных: анализ пользовательской активности с помощью сервиса «Яндекс.Метрика».

4. Категории субъектов персональных данных: все Пользователи Сайта, которые дали согласие на обработку файлов «cookie».

5. Способы обработки: сбор, запись, систематизация, накопление, хранение, уточнение (обновление, изменение), извлечение, использование, передача (доступ, предоставление), блокирование, удаление, уничтожение персональных данных.

6. Срок обработки и хранения: до получения от Субъекта персональных данных требования о прекращении обработки/отзыва согласия.

7. Способ отзыва: заявление об отзыве в письменном виде путём его направления на адрес электронной почты Оператора: info@rcsi.science или путем письменного обращения по юридическому адресу: 119991, г. Москва, Ленинский просп., д.32А

8. Субъект персональных данных вправе запретить своему оборудованию прием этих данных или ограничить прием этих данных. При отказе от получения таких данных или при ограничении приема данных некоторые функции Сайта могут работать некорректно. Субъект персональных данных обязуется сам настроить свое оборудование таким способом, чтобы оно обеспечивало адекватный его желаниям режим работы и уровень защиты данных файлов «cookie», Оператор не предоставляет технологических и правовых консультаций на темы подобного характера.

9. Порядок уничтожения персональных данных при достижении цели их обработки или при наступлении иных законных оснований определяется Оператором в соответствии с законодательством Российской Федерации.

10. Я согласен/согласна квалифицировать в качестве своей простой электронной подписи под настоящим Согласием и под Политикой обработки персональных данных выполнение мною следующего действия на сайте: https://journals.rcsi.science/ нажатие мною на интерфейсе с текстом: «Сайт использует сервис «Яндекс.Метрика» (который использует файлы «cookie») на элемент с текстом «Принять и продолжить».